Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv

The Drosophila gene minibrain codes for a protein kinase. Mutants with a reduced expression of minibrain are characterised by a strongly reduced brain size and learning and memory deficits. Dyrk1A is the mammalian homologue of minibrain; the encoded protein is the founding member of the family of Dyrk protein kinases. The human DYRK1A gene is implicated in the emergence of the cognitive deficits in Down syndrome, due to its location on chromosome 21 in the so-called Down syndrome critical region (DSCR), its overexpression in Down syndrome individuals and also because Dyrk1A-overexpressing mice show learning and memory deficits. Taken together, these data point to a gene dosage dependent function of Dyrk1A/minibrain in processes that are associated with cognitive functions such as learning and memory. The aim of this study was to elucidate the function of Dyrk1A in the adult mammalian brain. Three aproaches were chosen: First, an analysis of the expression of Dyrk1A and of the intracellular localisation of the respective protein in the adult mouse brain was performed. Dyrk1A is expressed in several brain areas, e.g. in the neocortex, in the hippocampal formation and in the cerebellum. In neurons, Dyrk1A is located either mostly nuclear, or predominantly or even exclusively in the cytoplasm, depending on the region and on the type of neuron. Second, to characterise the gene dosis dependent function of Dyrk1A, it was intended to generate transgenic mice that express a third copy of Dyrk1A, as it is the case in human trisomy 21 (Down syndrome). These transgenic mice should express the third copy of Dyrk1A in a region- and time-specific manner, e.g. in principal neurons in the adult forebrain. This should avoid developmental defects and disturbances of, e.g., the motor system and should allow for the specific analysis of the role of Dyrk1A in learning and memory and in brain regions involved in cognitive processes. A BAC (bacterial artificial chromosome) clone containing the whole Dyrk1A locus was isolated. This BAC was modified by homologous recombination in E. coli (GET recombination) to render it suitable for the generation of transgenic mice. Furthermore, a recombination cassette for a second modification step was constructed to allow for the region- and time-specific expression of the Dyrk1A gene on the BAC. Third, a yeast two-hybrid screen to identify proteins interacting with Dyrk1A was performed. Two of six clones obtained were shown to code for proteins interacting specifically with Dyrk1A: Sept4 (Pnutl2/H5/CDCrel-2), a GTPase of the Septin family, and Arip4, a steroid hormone receptor cofactor with ATP-dependent chromatin-remodelling activity. These interactions were confirmed in mammalian cells by coimmunoprecipitation. By in situ-hybridisation, the coexpression of Dyrk1A with the genes of both interactors was shown in various brain regions. In addition, Dyrk1A and Arip4 were shown to be colocalised in a speckle-like nuclear subcompartment in primary rat hippocampal neurons and in mammalian cell lines. These results point to an interaction of Dyrk1A with Arip4 also in vivo and implicate Dyrk1A in steroid hormone-mediated signalling. Furthermore, an interaction between Dyrk1A and Sept5/CDCrel-1, a close relative of Sept4, was shown. Sept5 is thought to play an inhibitory role in the fusion of synaptic vesicles with the presynaptic membrane and transmitter release. The results of this study contribute to the understanding of the role of Dyrk1A in physiological and pathophysiological contexts. Eventually, this should help (i) to elucidate the mechanisms that lead to mental retardation in Down syndrome and (ii) to develop tools to interfere with the function of Dyrk1A and to establish novel strategies for a therapy to alleviate mental retardation in Down syndrome.

The simple metazoan Hydra does posses two genes for caspases: Caspase 3A and caspase 3B. We generated antibodies against these caspases. By immunofluorescence staining and cell fractionation we demonstrated that both caspases are localized in mitochondria in vivo.Caspase 3A is a constitutively active enzyme independent of PCD. After induction of apoptosis caspase 3B translocates from the mitochondria to the cytoplasm and is activated. Activity of 3B is DEVD-specific.

N-Acylhomoserinlactones (AHL) are signalling molecules in gram-negative bacteria, which regulate, in a cell density dependent way, important interactive functions. This phenomenon is known as quorum-sensing. This work characterised the microbial ecology of the autoinducer (AHL) producing bacteria Serratia liquefaciens MG1 and Pseudomonas putida IsoF in the rhizosphere of tomato plants. Gfp- and rfp-tagged strains of the AHL producing wiltypes S. liquefaciens MG1 and P. putida IsoF were compared with its AHL-negative mutants, which were unable to produce AHL. Two kinds of plants cultivating systems were used: a defined axenic system and a complex soil system. The characterisation of the root colonisation behaviour was performed using confocal laserscanning microscopy (CLSM) and cell counting of bacteria. Fluorescence in situ hybridisation (FISH) and terminal restrictions fragment length polymorphism (t-RFLP)-techniques were used to examinate shifts of the bacterial population in the rhizosphere on tomato plants. The effective in situ production and spreading of AHL on tomato roots was demonstrated with P. putida IsoF using an AHL-sensor strain P. putida F117 pKR-C12. AHL was produced in effective concentrations in the rhizosphere of tomato plants and influenced the bacterial rhizosphere population. However, the AHL-production had no influence on the colonization behaviour of the AHL-producing strains S. liquefaciens MG1 and P. putida IsoF.

Die Überexpression des Adenin-Nukleotid-Translokators-.1 (ANT-1), einer Komponente des Pro-apoptotischen "permeability-transition-pore"-Komplexes (PTP) induziert programmierten Zelltod bei Überexpression. Der ANT-1-Interaktionspartner Cyclophilin D (CypD) wurde weiterhin als endogener Inhibitor des PTP-Komplexes charakterisiert, der in Tumoren überexprimiert ist.

Ziel dieser Arbeit war zum Einen die Synthese von neuartigen (Bakterio-)Chlorophyll-Derivaten zur Einlagerung in Proteine und ihre Charakterisierung in Lösung, zum Anderen Bindungsstudien an Komplexen dieser Derivate mit modularen Proteinen und dem Lichtsammler-Komplex 1 aus Rhodobacter sphaeroides. 1.) Darstellung von Fe-(Bakterio-)Pheophytinen: Es wurde ein Verfahren etabliert, das die Metallierung von Pheophytin a, Bakteriopheophytin a und deren Derivate mit Eisen ermöglicht. Zusätzlich wurde diese Methode so weit modifiziert und optimiert, dass ausgehend vom Mohrschen Salz auch die Einlagerung von 57Fe möglich ist, wodurch eine Erweiterung der spektroskopischen Methoden (Mößbauer-Spektroskopie) erreicht wird. Da die Fe Komplexe nicht mit den für (Bakterio-)Chlorophyll-Derivate etablierten Methoden gereinigt werden können, wurde für diese Komplexe ein neues Chromatographiesystem entwickelt. 2) Spektroskopische Untersuchung der Fe-(Bakterio-)Pheophytine: Es ist bekannt, dass Fe-Porphyrine leicht zu µ-oxo-Komplexen (Fe(III)(B)Phe a)2O dimerisieren und das Zentralion in zwei Oxidationsstufen (+2 und +3) vorliegen kann. Die Dimerisierung des Fe Phe und Fe-BPhe wurde durch Säure-Base-Titration absorptionsspektroskopisch untersucht. In aerober Lösung liegt das Zentralmetall des Fe-(B)Phe dreiwertig vor ((Fe(III)(B)Phe a)Cl). Dieses lässt sich „klassisch“ mit Na-Dithionit allein durch Ligandierung mit Pyridin zum zweiwertigen Fe(II)(B)Phe a reduzieren. Die drei Zustände der Fe-Komplexe (Fe(III)(B)Phe a)Cl, (Fe(III)(B)Phe a)2O und Fe(II)(B)Phe a wurden durch ESR- und Absorptionsspektroskopie charakterisiert. Die Oxidationsstufen der drei Zustände wurden für 57Fe-Me-Pheid a durch Mößbauerspektroskopie bestätigt. 3) Einlagerung von Fe-Bakteriopheophytin a in LH1 von Rhodobacter sphaeroides: Zur Untersuchung, ob Fe-BPhe von BChl-Bindungstaschen akzeptiert wird, wurde versucht Fe-BPhe ins LH1 von Rb. sphaeroides einzulagern. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen deuten zwar auf einen Einbau von Fe-BPhe hin, allerdings nur in sehr geringem Maß. Zur Quantifizierung des Fe-BPhe-Gehalts wurden verschiedene Methoden getestet. Der einfachste und vielversprechendste Weg war die Differenzabsorptionsspektroskopie, bei der die unterschiedliche Absorption von µ-oxo-Dimer und Monomer des Fe-BPhe ausgenützt wird. 4) Darstellung von Formyl-(Bakterio-)Chlorophyll-Derivaten: Eine kovalente Bindung von Chlorophyll-Derivaten an synthetische Peptide ist durch die Kopplung von Formyl-Gruppen mit einem modifizierten Lysin-Rest unter Bildung eines Oxims möglich. [3 Formyl]-Me-Pheid a konnte durch oxidative Spaltung des C-3-Vinyl des Chlorophyll a mit Ozon hergestellt werden. Ebenfalls mit Ozon konnte die Phytyl-Doppelbindung von Pheophytin a unter Bildung des Ethanal-Pheid a erreicht werden. Somit stehen insgesamt drei Chlorophyll-Derivate für die kovalente Bindung an synthetische Peptide zur Verfügung, welche die Formyl-Gruppen an verschiedenen Positionen tragen, wodurch eine unterschiedliche Orientierung der Pigmente im Protein erreicht werden kann. Es wurde versucht, in Analogie zum Pheophytin a das [3-Vinyl]-Me-BPheid a mit Ozon zu spalten. In Folge der leichten Oxidation des Makrozyklus lieferte diese Reaktion das Zielprodukt [3-Formyl]-Me-BPheid a nur in äußerst geringen Mengen, so dass diese Methode für die präparative Synthese dieser Verbindung nicht geeignet ist. 5) Nicht-kovalente Bindung von [M]-BPheid (M = Ni, Zn, Fe) in synthetische modulare Proteine (MOP): Ni-, Zn-, und Fe-BPhe wurden auf ihre Komplexbildung mit 216 verschiedenen, synthetischen Vier-Helix-Bündel-Proteinen untersucht. Die [M] BPheid-MOP-Komplexe wurden absorptionsspektroskopisch auf die Stärke der Bindung, die Koordination des Zentralmetalls und auf die Hydrophobizität der Umgebung untersucht. Alle MOP binden [M] BPheid in sehr unterschiedlichem Maße. Stärke und Art der Bindung werden in erster Linie durch die Bindehelix bestimmt. Eine quantitative Modulation findet allerdings auch durch die Abschirmhelix statt. Ni-BPheid zeigt in den Komplexen drei mögliche Koordinationszustände (nc = 4, 5, 6). Eine hohe Koordinationszahl geht immer mit einer stabilen Bindung und einer schmalen Qy Bande einher. Zn-BPheid ist in allen Komplexen fünffach koordiniert, das Fe-BPheid vierfach. Qualitativ zeigen alle drei Pigmente ein gleiches Muster in Bezug auf das Bindungsverhalten, so dass ausgehend von Häm-Bindungstaschen die Bildung von BChl-Bindungstaschen bestätigt werden konnte.

The endothelium is among the largest organs in the body. Stimuli originating from the blood or from neighbouring cells, like inflammatory cytokines (IC), lead to structural and functional alterations of vascular endothelial cells (EC). These alterations are often referred to as “EC activation”. Activated EC play a key role in different physiological processes like during immune response, in menstruation and in pathological processes like inflammation, allergy, viral infections, atherosclerosis and tumour angiogenesis. The human guanylate binding protein-1 (GBP-1) is a protein of the family of large GTPases. GBP-1 is characterized by a high turnover GTPase activity. Previous work showed that GBP-1 mRNA expression is induced by IC in EC and that GBP-1 is the specific mediator of the anti-proliferative effect of IC on EC in vitro. The main goals of this work were first, to investigate whether GBP-1 may be a molecular marker of IC-activated EC at the protein level in vitro. Second, to investigate GBP-1 expression in human healthy and/or disease tissues and to determine whether GBP-1 may be a molecular marker of IC-activated EC in vivo. To this goal mono- and poly-clonal antibodies against GBP-1 were generated. In vitro studies showed that GBP-1 expression in EC is induced by IFN-, IFN-, IL-1, IL-1 or TNF- but not by other cytokines, chemokines or growth factors. Moreover, simultaneous addition of bFGF and VEGF and IC reduced the IC-induced GBP-1 expression. This indicated that GBP-1 characterizes cells that are preferentially exposed to IC. In vivo studies using immunohistochemistry and immunofluorescence showed that GBP-1 expression is highly associated with vascular EC in a broad range of human tissues. This was confirmed by the simultaneous detection of GBP-1 and the EC-associated marker CD31. Notably, GBP-1 expression was undetectable in healthy skin. In contrast, GBP-1 was highly expressed in vessels of skin diseases with a high inflammatory component including psoriasis, adverse drug reactions and Kaposi’s sarcoma. This indicated that GBP-1 characterizes IC-activated EC in vivo. Further immunohistochemical studies on Kaposi’s sarcoma demonstrated that GBP-1 expression and EC cell proliferation are inversely related. This indicated that GBP-1 may also mediate the anti-proliferative effect of IC on EC in vivo. Finally, GBP-1 was found to be secreted by EC stimulated with IFN- and IFN- in vitro. This finding was confirmed by immunoprecipitation of GBP-1 from cell culture supernatants and by a novel ELISA developed for the detection of GBP-1 in solution. Further characterization of the mechanism of secretion demonstrated that GBP-1 release is due to an 3 Summary energy-dependent mechanism and is not due to cell death. Most importantly, circulating GBP-1 could be detected in increased concentrations in the blood of patients that were subjected to IFN–-therapy or in patients with inflammatory diseases. These findings indicated that GBP-1 is a novel marker of inflammatory vessel activation. Specifically, the serological detection of GBP-1 may open new perspectives for the early detection of inflammatory activation of EC in patients with inflammatory diseases.

MyoD is one of the MRFs (Muscle Regulatory Factors) and it functions to determine the muscle cell fate. The mechanism by which MyoD regulates the muscle development program is very well understood. However, the transcriptional regulation of the MyoD gene itself has not studied in Xenopus. In this thesis, I have analyzed the transcriptional regulatory mechanism of the MyoD gene in Xenopus by different approaches, which include transgenic reporter analysis of its cis-regulatory elements of MyoD transcription and gain-of-function and loss-of-function tests of several potential regulaters. Here I showed that the expression of the XmyoD gene is controlled by a combination of induction, repression and maintenance. One activating motif, one repressing motif and one maintenance motif were found by transgenic reporter analysis. XSRF (Xenopus serum response factor) binds with the maintenance enhancer to maintain the expression of XmyoD gene. A repetitive DNA sequence was discovered in the -2.8/-2.0kb region in the XmyoD genomic sequence. The repetitive DNA sequence in the XmyoD gene locus may produce sense and anti-sense transcripts. In addition, several potential regulators have been analyzed. It has been shown that XSEB-4, a direct target of XmyoD protein, is able to induce the expression of XmyoD gene. Xenopus Ying Yang 1 (XYY1) can repress the expression of the XmyoD gene. Lef-1 is necessary and sufficient for the expression of XmyoD gene. This provides strong evidence that Lef-1 is the transcription factor of the zygotic Wnt signaling pathway that activates the expression of the XmyoD gene.

Die Immuntherapie von niedrig malignen Tumoren stellt eine vielversprechende alternative Behandlungsmethode dar. Epstein Barr-Virus (EBV) etabliert eine latente Infektion in der Zielzelle, in der das EBV-Genom extrachromosomal aufrecht erhalten wird. EBV eignet sich mit diesen Eigenschaften hervorragend als Genvektor. Meine Aufgabenstellung war es, neue EBV-abgeleitete Genvektoren zu entwickeln, die das therapeutische Zytokin GM-CSF in Tumorzellen von B-CLL-Patienten (Chronische lymphatische Leukämie) exprimieren. Dabei entscheidend ist die Eigenschaft von EBV naive, wie auch reife und maligne B-Lymphozyten über den CD21-Rezeptor spezifisch zu infizieren. Als Grundlage diente das Maxi-EBV-System, mit dem das EBV-Genom für genetische Veränderungen zugänglich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein sicherer EBV-Basis-Vektor etabliert, der replikations-defizient ist und dem zusätzlich die immortalisierenden Eigenschaften von EBV fehlen. Im selben Zuge wurden verschiedene Expressionskassetten für das Transgen GM-CSF in den EBV-Basis-Vektor eingebracht. Es konnten fünf unterschiedliche GM-CSF-Vektoren etabliert werden, die das Transgen an verschiedenen Genorten innerhalb des Maxi-EBV-Genoms tragen. Zwei dieser GM-CSF-Vektoren erzielten besonders hohe Transduktionseffizienzen und Expressionsraten in der Modellzelllinie Raji (Burkitt-Lymphom-B-Zelllinie). Auch B-CLL-Zellen konnten mit guter Effizienz transduziert werden, die Expression des GM-CSF war aber deutlich schwächer. Das immunstimulatorische Zytokin GM-CSF führt in vivo zu einer verbesserten Immunantwort gegen Tumore. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass GM-CSF-haltige Überstände von Vektor-transduzierten Raji-Zellen eine Reifung von dendritischen Zellen (DC) bewirken, die als wichtige Effektoren bei einer Anti-Tumorantwort gelten. Die Funktion von GM-CSF konnte auch anhand eines Proliferationsversuchs mit einer Zytokin-abhängigen Zelllinie gezeigt werden. Darüber hinaus waren DC nach exogener Antigenbeladung in der Lage, spezifischen CD4-positiven T-Zell-Klonen effizienter ein antigenes Peptid zu präsentieren, wenn die DC in Gegenwart von GM-CSF gereift waren. Damit zeigt das nach Gentransfer sezernierte GM-CSF einen immunstimulatorischen Effekt ähnlich dem von rekombinantem GM-CSF und kann eine effizientere Antigenpräsentation von Tumorantigenen hervorrufen. Prinzipiell eignen sich B-CLL-Zellen daher als Produzenten von EBV-Genvektor-transduziertem GM-CSF, das zur immunologischen Demaskierung von B-CLL-spezifischen, tumor-assoziierten Antigenen auch in vivo führen sollte.

Uncovering the motifs of a higher order nuclear architecture and its implications on nuclear function has raised increasing interest in the past decade. The nucleus of higher eukaryotes is considered to display a highly dynamic interaction of DNA and protein factors. There is an emerging view that there are hierarchical levels of gene regulation, reaching from epigenetic modifications at the DNA- and histone level to a higher order functional nuclear topology, in the context of which gene-activating and -repressing processes influence the gene expression profile of an individual cell beyond the sequence information of the DNA. The present work focuses on the analysis of the dynamic aspects of higher order nuclear architecture in living cells. As a prerequisite, an in vivo replication labeling strategy was developed, that enabled the simultaneous visualization of early and mid-to-late replicating chromatin as well as single chromosome territories on the basis of a labeling/segregation approach. The presented scratch replication labeling protocol combines a high labeling efficiency with reduced “damaging” effects and can be successfully applied to a number of adherently growing cell lines, including primary human fibroblasts. In addition, a live cell observation system was developed that facilitates time-lapse confocal (4D) microscopy over elongated time periods which made it possible to follow a complete cell cycle or more. To address possible long-range movements of chromosome territories (CTs) during an entire interphase, fluorescence labeling of a small number of CTs was performed in living HeLa cells stably expressing histone H2B-GFP. This was achieved by in vivo scratch replication labeling with fluorescent nucleotides. Labeled cells were cultivated for several cell cycles until labeled chromatids had segregated. Such cells were followed by time-lapse confocal microscopy over time-scales of up to 20 hours covering major parts or the complete cell cycle. Positional changes of the intensity gravity centers of labeled CTs in the order of several µm were observed in early G1, thereafter, the positions remained within a range of ~1 µm till the end of G2. In conclusion, CT arrangements were highly constrained from mid G1 to late G2 / early prophase, whereas major changes of CT neighborhoods occurred from one cell cycle to the next. More extended movements observed in early G1 might play a role when CTs “home in” to establish a non-random radial CT arrangement. To analyze possible changes of chromosome arrangements from one cell cycle to the next, nuclei were photobleached in G2 maintaining a contiguous zone of unbleached chromatin at one nuclear pole. This zone was stably preserved until the onset of prophase whereas unbleached chromosome segments were often observed to become located at distant sites in the metaphase plates. Accordingly, chromatin patterns observed in daughter nuclei differed significantly from the mother cell nucleus, indicating that CT neighborhoods were not preserved during mitosis. The variability of CT neighborhoods during clonal growth was further confirmed by 3D-FISH experiments. A series of experiments of a more preliminary character looked at the influence of the nuclear lamina in constraining and determining a higher order nuclear architecture by selectively interacting with mid-to-late replicating chromatin. Simultaneous immunodetection of lamin B on two-color replication labeled neuroblastoma cell nuclei revealed specific attachment of the mid-to-late replicating chromatin compartment not only along the periphery but also inside the nucleus along invaginations of the lamina. 4D-live cell observation of lamin C-GFP expressing CHO cells with mid-to-late replicating chromatin labeled simultaneously revealed concomitant movements of replication foci attached to lamin invaginations. Moreover, a functional essay was employed which uses injection of a dominant negative lamin A mutant protein (ΔNLA) to cause a reversible disruption of the nuclear lamina. Initial results point to concomitant distortion of the mid-to-late replication pattern and a preferential attachment of the respective chromatin sites to partially disrupted lamin B (as compared to lamin A and nuclear pore complex). Finally, a model is presented on the chromosome positioning in mammalian nuclei depending on cell cycle and nuclear shape.

Bei Welsen der Spezies Schilbe mystis kommt es im elektrosensorischen System zur Konvergenz mehrerer (bis zu ca. 30) ampullärer Rezeptororgane eines sog. Clusters auf ein primäres afferentes Neuron. Es gibt zwei morphologische Grundtypen der Clusterinnervierung (stern- oder baumförmig); bei Clustern vom "Bäumchentyp" an der Analflossenbasis erstreckt sich das Konvergenzareal über bis zu ca. 2 mm. Die Dendriten weisen eine vollständige, aber untypische Myelinisierung mit u.a. sehr kurzen Internodienabständen auf und erreichen Längen bis zu ca. 3mm. Im Unterschied zu Physialia spec. sind bei Schilbe die Leitungslängen innerhalb eines Clusters vom Bäumchentyp zwischen Synapse und Axonstamm - und davon abhängig auch die elektrischen Eigenschaften der Dendriten - sehr unterschiedlich. Ampulläre Rezeptororgane sind spontanaktiv und generieren in der afferenten Faser Aktionspotentiale in sehr regelmäßiger Abfolge; die statistische Auswertung des Interspike-Intervalls zeigt eine eingipflige, schmale, symmetrische Verteilung (s = 7%). Zusammen mit den Ergebnissen zur Empfindlichkeitsaddition im Cluster (Peters & Mast 1983, van Dongen & Bretschneider 1984, Peters & van Ieperen 1989, Peters et al. 1997a) und Überlegungen zur Signalausbreitung lassen sich diese Ergebnisse nur mit monozentrischer Erregungsbildung im Axonstamm erklären (Bestätigung durch progressive TTX-Vergiftungsexperimente, s.u.) und sind mit der "Kollisionstheorie" (Murray & Capranica 1973, Pabst 1977, Holden 1976, Sanchez & Zakon 1990, Teunis et al. 1990b, Longtin & Racicot 1996) nicht vereinbar. Nach MS-222 Anästhesie oder Anwendung des Natriumkanal-Blockers TTX zeigt die Histogrammverteilung charakteristische Veränderungen und gibt so weitere Hinweise auf Funktionsmechanismen bei Erregungsbildung und Fortleitung. Der Vergleich der meßbaren Aktionspotentialamplituden im Cluster zeigt keine Abhängigkeit von der Fortleitungsdistanz innerhalb des Dendritenbaums. Die Ergebnisse sind nur mit einer aktiven Invadierung der Endarborisation vereinbar, was auch durch progressive TTX-Vergiftungsexperimente klar bestätigt wird (s.u.). Es gibt während "kathodischer Inhibition" mit starken Stimuli nach der zu erwartenden anfänglichen Unterdrückung der Nervenantwort eine Plateauphase, in der eine reduzierte, sehr regelmäßige Spontanaktivität bei fehlender Reizempfindlichkeit auftritt. Die Rückkehr der Empfindlichkeit nach dieser Phase erfolgt anisotrop. Dies legt die Existenz wenigstens zweier adaptiver Prozesse innerhalb der analogen Verarbeitung (vor der Generation von Aktionspotentialen) nahe. Nach den Ergebnissen der progressiven TTX-Vergiftung ist der schnellere dieser Mechanismen in den Dendriten lokalisiert und korreliert mit der Adaptation dendritischer Natriumkanäle. Es gibt eine positive, nichtlineare Korrelation zwischen Spikeamplitude und Interspike-Intervall: bei Stimulation des Systems tritt eine Amplitudenverminderung ein und umgekehrt. Ein Zusammenhang mit Refraktärphänomenen oder "Shuntingprozessen" in der Endarborisation kann ausgeschlossen werden. Das Ergebnis ist allein auf der Basis verminderter Aktivierbarkeit der dendritischen Natriumkanäle (potentialabhängige Inaktivation) aufgrund des EPSP-induzierten Anstiegs des intradendritischen Potentials zu erklären und gibt damit Hinweise auf die aktive Rolle der Natriumkanäle bei der Fortleitung graduierter Potentiale. Progressive TTX-Blockierungsexperimente der dendritischen Natriumkanäle zeigen bei Doppelableitungen von proximalen und distalen Organen innerhalb eines Clusters charakteristische, hochsignifikante Veränderungsmuster in Aktionspotentialamplituden, Reizempfindlichkeit und Erregungsmustern in Abhängigkeit von der Diffusionsrichtung des Kanalblockers. Die Ergebnisse liefern u.a. eindeutige Hinweise, daß: (1) in jedem Cluster nur ein Impulsentstehungsort für die Generierung der Aktionspotentiale verantwortlich ist, der sich im Axonstamm der gemeinsamen Afferenz befindet. (2) Die Ausbreitung der postsynaptischen Potentiale erfolgt mit aktiver Unterstützung dendritischer Natriumkanäle, die im unterschwelligen Bereich als spannungsgesteuerte Stromverstärker arbeiten und postsynaptische Signale stabil verstärken; damit schaffen sie erst die Voraussetzung für Konvergenz und Addition der Analoginformation im Axonstamm. (3) Die Endarborisation wird in ihrer gesamten Erstreckung von den Aktionspotentialen aktiv retrograd invadiert, was u.a. eine wichtige "Reset"-Funktion in der Endarborisation erfüllen dürfte. Die Endarborisation stellt damit ein - in dieser Form und Ausprägung aus der Literatur noch nicht bekanntes - effizientes peripheres mononeuronales Konvergenzsystem dar, das in komplexer Weise essentiell auf aktiven Funktionen dendritischer Natriumkanäle basiert. Konsequenzen daraus für den neuronalen Informationsverarbeitungsprozeß (analoge Vorverarbeitung) und den Rezeptormechanismus ampullärer Organcluster werden diskutiert.

During my PhD thesis I was working on the identification of novel apoptosis-inducing genes by using a novel genetic expression screen (Grimm and Leder, 1997). One of the identified genes turned out to be a evolutionary conserved cDNA that codes for a novel BH3-only protein of 219 amino acid residues which was named Spike, for Small protein with inherent killing effect. Spike was then in the course of my PhD thesis extensively characterised, molecularly and biochemically. In summary, upon overexpression in mammalian cells Spike efficiently leads to all features of apoptosis, such as phenotypic alterations, cytochrome c release, caspase activation and DNA degradation. It was shown that Spike localised to the endoplasmic reticulum, where it interacts with a recently identified apoptosis regulating protein complex, consisting of Bap31, Bcl-2, Bcl-XL and an ER-specific isoform of caspase-8: pro-caspase 8L (Breckenridge et al. 2002). Although no direct interaction with anti-apoptotic members of the Bcl2-family could be observed, the importance of the BH3-like sequence for the apoptosis-inducing activity of Spike was demonstrated by using point mutations of conserved amino acid residues of this motif (Mund et al. 2003). Instead of directly interacting with anti-apoptotic members of the Bcl-2 family Spike is able to interfere with the complex formation between Bap31 and Bcl-XL. Based on these data I proposed a model according to which the complex on Bap31 is controlled by Bcl-2/Bcl-XL as long as they are associated. Displacement of Bcl-2/Bcl-XL from Bap31 by Spike leads to the formation of a pro-apoptotic complex. In addition, Spike appears to be implicated in the cell death signal of the Fas receptor. I observed that a dominant-negative version of Spike and a highly effective anti-sense oligonucleotide significantly reduced Fas-mediated DNA fragmentation whereas no reduction was detected in TNFa-induced cell death (Mund et al. 2003).

Die Chlorophyll Synthase ist ein äußerst hydrophobes Transmembranprotein und sitzt in der Thylakoidmembran im Chloroplasten. Sie verestert Chlorophyllid und Phytylpyrophosphat zu Chlorophyll. In dieser Arbeit sind Untersuchungen zur Lage der Transmembranbereiche, zum aktiven Zentrum bzw. zu essentiellen Aminosäuren und zum Reaktionsmechanismus dargestellt.