Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv

Zusammenfassung 1. Das für das Proteolipid aus Methanocaldococcus jannaschii kodierende Gen atpK wurde in E. coli DH5alpha und in dem Minizell-Produzenten E. coli DK6 exprimiert. Das Genprodukt wurde durch radioaktive Markierung nachgewiesen. 2. Aus den Membranen der thermophilen, hydrogenotrophen methanogenen Archaea M. jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter marburgensis sowie aus den Membranen des mesophilen, methylotrophen methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden mit Chloroform/Methanol die Proteolipide der A1AO-ATPasen und die MtrD-Untereinheiten der Methyltetrahydromethanopterin:CoenzymM-methyl-transferase extrahiert. Die einzelnen Peptide wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert. 3. Durch MALDI-TOF-Analyse wurde die molekulare Masse des maturen Proteolipids aus M. jannaschii zu 21316 Da und 21183 Da (Methionin-freie Form) bestimmt. Zusammen mit der Gensequenz konnte daraus gefolgert werden, daß es sich um eine triplizierte Form des bakteriellen 8-kDa Proteolipids handelt, also 3 Haarnadel-Domänen ausweist. Die ionentranslozierenden Carboxylate sind nur in Haarnadel 2 und 3 konserviert. Bei einer angenommenen Anzahl von 24 Helices im c-Oligomer bedeutet das, daß ein Ionen/ATP-Verhältnis von 2,7 für die Synthese von ATP ausreichen würde. 4. Die Proteolipide aus M. thermautotrophicus und M. marburgensis besitzen duplizierte Proteolipide. Die aktiven Carboxylat-Reste sind im Gegensatz zu den bisher bekannten duplizierten Proteolipiden der V1VO-ATPasen in beiden Haarnadeln konserviert. 5. Die archäellen A1AO-ATPasen-Operone der Pyrococcen enthalten ebenfalls Gene, die für duplizierte Proteolipide kodieren. Allerdings sind die für die Ionentranslokation essentiellen Carboxylat-Reste wie in den Proteolipiden der V-Typ-ATPasen nur in der zweiten Haarnadel vorhanden. Die Abtrennung der A1AO- und V1VO-ATPasen muß daher vor der Entwicklung der Eukaryonten erfolgt sein. 6. Sequenzanalysen haben gezeigt, daß das Proteolipid-Gen aus Methanopyrus kandleri dreizehnmal so groß wie das aus Bakterien ist. Es kodiert für ein Protein mit 13 Haarnadel-Domänen. Die Ionenbindstelle ist in jeder Haarnadel konserviert. 7. Alle heute bekannten Formen der Proteolipide der V- und F-ATPasen waren schon in den Archaea enthalten. Die Vielfalt an Proteolipid-Größen und -Formen der archäellen ATPasen läßt vermuten, daß sie ein Reservoir an Möglichkeiten darstellen, aus denen die V1VO- und F1FO-ATPasen gespeist wurden. 8. Durch Sequenzvergleich mit den Na+-translozierenden Proteolipiden der bakteriellen F1FO-ATPasen wurde auch in den Proteolipiden der A1AO-ATPasen ein Na+-Bindemotiv identifiziert. Es lautet: P/S/T-XXX-Q/E (Motiv I in Helix eins), ET/S (Motiv II in Helix zwei). 9. Aus Membranen von Sulfolobus acidocaldarius und M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, anschließend wurde aus diesen Lipiden Liposomen hergestellt, in die die A1AO-ATPase aus M. jannaschii rekonstituiert wurde. Die Synthese von ATP konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. 10. Die ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kanninchen eingesetzt. Die erhaltenen Antiseren gegen die ATPase-Untereinheiten AhaA, AhaB, AhaC und AhaE waren spezifisch und wurden für die Analysen dieser Arbeit eingesetzt. 11. Das für die gesamte A1AO-ATPase kodierende Operon ahaHIKECFABDG des methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurde in den Expressionsvektor pVSBAD2 hinter den ara-Promotor kloniert. Das Konstrukt wurde pRT1 genannt. 12. Die auf pRT1 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert. Die A1AO-ATPase war in E. coli membran-assoziiert und funktionell. Die spezifische ATPase-Aktivität an Membranen von E. coli DK8 betrug 150 mU/mg Protein. 13. DCCD und der für archäelle ATPasen spezifische Inhibitor DES hemmten das Enzym. Die I50-Wert betrugen 0,5 mM/mg Protein, beziehungsweise 200 nmol/mg Protein. 14. Die Synthese von AhaA, AhaB, AhaC, AhaE, AhaH, AhaK, und zum ersten Mal auch des gesamten AhaI, konnten nachgewiesen werden. Gegen AhaF, AhaD und AhaG lagen keine funktionellen Antikörper vor.

Bei Patienten, die mit dem humanen Immundefizienzvirus-1 (HIV-1) infiziert sind, kommt es häufig zu krankhaften Veränderungen des Endothels, die zu einer Fehlfunktion des Gefäßsystems führen. Klinischer Ausdruck dieser als acquired immune deficiency syndrome (AIDS)-assoziierten Vaskulopathie bezeichneten Veränderungen sind Schädigungen des Aortenendothels, die mit einer erhöhten Adhäsion mononukleärer Zellen an das Endothel einhergehen, Defekte der Blut-Hirn-Schranke, die zur Entstehung von Demenz beitragen, sowie das Kaposi-Sarkom (KS), das durch eine sehr starke Extravasation von T-Zellen und Monozyten gekennzeichnet ist. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass das regulatorische HIV-1-Tat-Protein und das inflammatorische Zytokin TNF-a synergistisch die Adhäsion der promonozytären Zelllinie U937 und von PBMZ an humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HMVEZ) erhöht. Die adhäsionsfördernde Wirkung wurde selektiv bei HIV-1-Tat beobachtet, andere virale Proteine des HIV-1, wie Negativfaktor (Nef) und das Glykoprotein gp41, hatten keinen Einfluss auf die Adhäsion. Anhand zellspezifischer Marker wurde gezeigt, dass HIV-1-Tat in periphere mononukleäre Blutzellen (PBMZ) spezifisch die Adhäsion von Monozyten und T-Zellen erhöhte, jedoch nicht von B-Zellen. Intravital-mikroskopische Untersuchungen an der Maus bestätigten in vivo, dass HIV-1-Tat und TNF-a synergistisch die Adhäsion von Leukozyten an das Endothel erhöhten. HIV-1-Tat reguliert die Expression einer großen Anzahl zellulärer Gene. Diese Fehlregulation durch HIV-1-Tat könnte an der Enstehung der AIDS-assoziierten Vaskulopathie beteiligt sein. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die parakrine Wirkung von HIV-1-Tat auf die Genexpression in Monozyten mittels der suppressed subtractive hybridization (SSH)-Methode untersucht. Hierbei wurde O-linked N-Acetylglucosamine-transferase (OGT) als Gen identifiziert, dessen Expression durch HIV-1-Tat unterdrückt wird. Bisher ist bekannt, dass OGT ein Repressor der basalen Transkription und der SP-1-regulierten Transkription ist. Die Expression von OGT wurde sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Protein-Ebene durch HIV-1-Tat und VEGF121 gehemmt, wobei die Regulierung über den VEGF-Rezeptor Flt-1 vermittelt wurde. Weitere Faktoren wie inflammatorische Zytokine (TNF-a, IL-1b, IFN-g und IL-2), angiogene Wachstumsfaktoren (bFGF und VEGF165) und Chemokine (IL-8, MIP-1a, IP-10, MCP-1 und SDF-1a) hatten keine hemmende Wirkung auf die OGT-Expression. Die schnelle Abnahme von intrazellulärem OGT-Protein wurde weder durch lysosomale Proteasen noch durch Proteasen des Proteasoms verursacht. Expressionsstudien an PBMZ von fünf verschiedenen Probanden zeigten, dass bei zwei Probanden die OGT-Konzentration durch HIV-1-Tat zunahm, bei zweien nahm sie ab und bei einer Person gab es keine Veränderung. Diese Ergebnisse belegen, dass HIV-1-Tat entscheidend an der Entstehung der AIDS-assoziierten Vaskulopathie, insbesondere von KS, beteiligt sein könnte. Die Repression von OGT durch HIV-1-Tat könnte die weitreichende Wirkung des HIV-1-Tat-Proteins auf zelluläre und virale Gene erklären.

Risp wurde in einer früheren Arbeit in einem Hefesystem als ein neues; mit HIV-1 Rev interagierendes zelluläres Protein beschrieben, das dem C-terminalen Teil eines weitaus größeren Proteins (KIAA0592) zu entsprechen schien. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Organisation des KIAA0592-Gens zu untersuchen und die biochemischen und strukturellen Eigenschaften des KIAA0592-Proteins zu ermitteln.Es gelang erstmals das vollständige, KIAA0592komplett-Protein in verschiedenen Zelllinien zu exprimieren und einem Promotorbereich zuzuordnen. Somit konnten die in silico-Daten über das Vorhandensein dieses Gens inklusive regulatorischer Bereiche experimentell verifiziert werden. Es konnte anhand der verfügbaren Datenbanken gezeigt werden, dass zu KIAA0592 homologe Proteine und genomische Bereiche in den verschiedensten Spezies (H. sapiens, M. musculus, R. norvegicus und C. griseus) konserviert sind. Dies weist auf essentielle zelluläre Funktionen hin. Um mögliche Funktionen des bisher nicht charakterisierten KIAA0592-Proteins zu analysieren, wurden anhand der Aminosäuresequenz spezifische strukturelle und funktionale Eigenschaften vorausgesagt. KIAA0592 enthält Transmembranbereiche, superhelikale „Coiled Coil“-Strukturen und Bereiche für unterschiedlichste posttranslationale Modifikationen. Es konnte durch in silico-Sequenzanalysen und in vitro-Expressionsanalysen gezeigt werden, dass das als Revinteragierend identifizierte Protein Risp ein Teil des KIAA0592-Proteins darstellt. Bei der ursprünglich identifizierten cDNA handelte es sich demnach um einen unvollständigen Sequenzbereich von KIAA0592. Das erstmals in trans exprimierte gesamte KIAA0592komplett-Protein zeigte eine starke zytoplasmatische Lokalisation, wie auch die Risp-Domäne alleine. Es wurde in einem Säugerzellsystem gezeigt, dass Risp Interaktionen mit Rev und Crm1 eingeht und in der Lage ist, zumindest zu dimerisieren. Für Rev ist bekannt, dass es ebenfalls mit dem Kernexportrezeptor Crm1 interagiert, und dass diese Eigenschaften essentiell für die Aktivierungsfunktion von Rev ist. Deswegen wurden die Lokalisations- bzw. Transporteigenschaften der Rev-interagierenden Proteindomäne (=Risp) von KIAA0592 und der Einfluss auf die Aktivierungsfunktion von Rev untersucht. In den verwendeten eukaryotischen Zelllinien lokalisiert Risp hauptsächlich im Zytoplasma, es ist aufgrund der identifizierten Import- und Exportsignale jedoch zum nukleozytoplasmatischen Transport fähig. Diese Transportfähigkeit von Risp ließ sich auf eine C-terminal deletierte Rev-Variante (Rev1-54) übertragen. Trotzdem konnte durch diese Substitution die Funktionalität von Rev nicht wiederhergestellt werden. Eine Crm1-Rekrutierung an Rev ist offensichtlich nicht alleine ausreichend, ein funktionales RRE-mRNA exportierendes Rev-Protein zu konstruieren. Es handelt sich bei KIAA0592/Risp um ein Protein, das nicht nur HIV-1 Rev bindet, sondern ebenso über strukturelle Komponenten verfügt und durch Crm1 mit dem Kernexport verbunden ist.

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Fragestellungen zur funktionellen und dynamischen Organisation des Kerns von Säugerzellen untersucht. Der erste Teil der Arbeit widmete sich der Frage, in welchem Zusammenhang die Synthese naszenter RNA mit der Organisation des Chromatins im Zellkern steht. Dabei wurde speziell untersucht, ob naszente RNA bevorzugt in chromatinarmen Räumen lokalisiert, wie es das Chromosomen-Territorien/Interchromatin-Kompartiment Modell (CT/IC-Modell)(Cremer und Cremer, 2001) vorhersagt. Diese Untersuchungen wurden an HeLa-Zellen durchgeführt, die stabil eine Fusion zwischen dem „Green Fluorescent Protein” (GFP) und dem Histon H2B exprimierten (Kanda et al., 1998). Mit Hilfe dieses Fusionsproteins kann die Chromatinstruktur sehr gut dargestellt werden (Sadoni et al., 2001; Zink et al., 2003). Die naszente RNA wurde in diesen Zellen durch kurze Pulse von BrUTP markiert, das anschließend durch eine Immunfärbung nachgewiesen wurde. Die markierten Zellen wurden mit Hilfe hochaufl ösender konfokaler Laserscanning Mikroskopie aufgenommen. Für die Analyse der Bilddaten wurde eine Erosionsmethode entwickelt, welche die Auswertung der Daten unabhängig von subjektiv gewählten Schwellenwerten ermöglichte. Die Ergebnisse dieser Analysen zeigten keine bevorzugte Lokalisierung naszenter RNA in chromatinarmen Bereichen. Damit stützen die Ergebnisse nicht die entsprechenden Vorhersagen des ICD-Modells. Die hier gewonnenen Ergebnisse stehen nicht im Einklang mit den Ergebnissen anderer Studien (Politz et al., 1999; Verschure et al., 1999). Die unterschiedlichen Ergebnisse sind wahrscheinlich auf unterschiedliche Methoden zur Darstellung der Chromatinorganisation, beziehungsweise auf unterschiedliche Methoden zur Bildanalyse zurückzuführen. Eine weitere Fragestellung, die im Zusammenhang mit der dynamischen Organisation der RNA-Synthese und RNA-Prozessierung in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde, war wie das Spleißfaktor-Kompartiment mit Chromatin interagierte. Diese Interaktion sollte in lebenden „Chinesischen Hamster Ovarien” (CHO)-Zellen untersucht werden. Speziell sollte der Frage nachgegangen werden, ob das Spleißfaktor-Kompartiment unterschiedlich mit funktionell unterschiedlichen Chromatinfraktionen assoziiert ist. Dafür wurde die DNA dieser Chromatinfraktionen mit Hilfe von Cy3-dUTP (Zink et al., 1998; Zink et al., 2003) spezifisch markiert. Das Spleißfaktor-Kompartiment der lebenden Zellen wurde simultan mit einem hier lokalisierenden GFP-Fusionsprotein dargestellt (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. M. C. Cardoso, MDC, Berlin). Die so markierten lebenden Zellen wurden mit Hilfe der konfokalen Laserscanning Mikroskopie aufgenommen. Die Auswertung der Bilddaten ergab eine generelle enge Assoziation des Spleißfaktor-Kompartiments mit früh-replizierendem und transkriptionell aktivem Chromatin. Dagegen bestand eine solche Assoziation nicht mit spät-replizierendem und transkriptionell inaktivem Chromatin. Eine Behandlung der Zellen mit dem Transkriptions-Inhibitor α-Amanitin zeigte, dass die enge Assoziation des Spleißfaktor-Kompartiments mit früh-replizierendem und transkriptionell aktivem Chromatin direkt vom Prozess der Transkription abhängig war. Insgesamt zeigten die Daten zum ersten Mal, dass es in lebenden Zellen eine definierte Interaktion des Spleißfaktor-Kompartiments mit funktionell unterschiedlichen Chromatinfraktionen gibt, die abhängig ist vom Prozess der Transkription. Ein weiterer dynamischer Prozess im Zellkern, der in der vorliegenden Arbeit an lebenden HeLa-Zellen untersucht werden sollte, war der Prozess der DNA-Replikation. Von besonderem Interesse war hierbei die Frage, welchen dynamischen Reorganisationen die DNA während der S-Phase unterliegt. Daneben sollte auch untersucht werden, wie der spezifische zeitlich-räumliche Verlauf der S-Phase in Säugerzellen koordiniert wird. Zur Untersuchung dieser Fragen wurde die zu replizierende oder die naszente DNA lebender Zellen mit fluoreszensmarkierten Nukleotiden dargestellt. Simultan wurde die Replikationsmaschinerie mit Hilfe eines GFP-PCNA Fusionsproteins markiert (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. M. C. Cardoso, MDC, Berlin). Diese Markierungstechniken erlaubten es zum ersten Mal, direkt die Interaktionen von replizierender DNA und der Replikationsmaschinerie zu beobachten und zu analysieren. Die Ergebnisse zeigten, dass die DNA während der S-Phase keine großräumigen Umlagerungen erfuhr. Nur einige lokal begrenzte Reorganisationen wurden beobachtet, die sich innerhalb von Distanzen von weniger als 1 µm abspielten. Die Ergebnisse zeigten ferner, dass DNA in stabile Aggregate organisiert war, die den Replikationsfoci entsprachen. 85 % dieser Aggregate, die auch als subchromosomale Foci bezeichnet werden (Zink et al., 1998), behielten ihren Replikationszeitpunkt von S-Phase zu SPhase stabil bei. Während des zeitlichen Fortschreitens der S-Phase schritt die Replikationsmaschinerie sequentiell durch benachbarte Gruppen von subchromosomalen Foci. Diese besaßen einen definierten Replikationszeitpunkt, und lokalisierten an de- finierten Positionen im Zellkern. Diese Ergebnisse legten nahe, dass die spezifische Anordnung von subchromosomalen Foci im Kern, die während der frühen G1-Phase etabliert wird (Dimitrova und Gilbert, 1999; Ferreira et al., 1997; Sadoni et al., 1999), die räumlich-zeitliche Organisation der S-Phase determiniert.

Die Gattung Bomarea wurde seit BAKER 1888 nicht mehr revidiert. Seither hat die Zahl gültig veröffentlichter Namen von 105 auf 280 zugenommen. Eine neue Revision ist dringend erforderlich. Ausgedehnte Feldstudien in Peru bilden die Grundlage für die Inangriffnahme dieses Projekts. In der vorliegenden Arbeit wird die taxonomische Geschichte der Gattung rekonstruiert. Bomarea wird gegen die nahe verwandte Alstroemeria abgegrenzt. HUNZIKER (1973) hatte Bomarea sogar eingezogen. Die meisten Autoren erkennen aber beide Gattungen als selbstständig an (KILLIP 1936; NEUENDORF 1977; SMITH & GEREAU 1991; AAGESEN & SANSO 1998). Die wichtigsten Unterschiede zwischen den beiden Gattungen bestehen im Fruchtbau sowie in den Chromosomenzahlen. Die Basiszahl ist in Alstroemeria x = 8 und on Bomarea x = 9. Die 4 bekannten Untergattungen werden überwiegend an Hand von Merkmalen des Ovariums und der Frucht definiert. Die entscheidenden Kriterien zur Identifikation der 4 Untergattungen sind folgende: Bei Bomarea s.str. ist das Ovarium immer unterständig, die Frucht ist dehiszent; Die Arten von Sphaerine sind nicht windend, das Ovarium ist unterständig, die Frucht indehiszent, das Perikarp ist dünn, saftig, und kräftig gefärbt; In Wichuraea ist das Ovarium halbunterständig, die Frucht ist dehiszent; Die Arten des Subgenus Baccata sind immer windend, das Ovarium ist unterständig, die Frucht ist indehiszent mit einer dicken, fleischigen Fruchtwand (HOFREITER & TILLICH 2002). Feldstudien in Peru zeigten innerhalb einer Population eine hohe Variabilität der Merkmale. Die Merkmals-Variabilität ist bei den Arten der Untergattung Wichuraea an höchsten, bei Sphaerine am niedrigsten. Die Verbreitungs- und Evolutionsmuster in Bomarea unterscheiden sich nach den verschiedenen Höhenstufen und ökologischen Bedingungen. Es sind 7 verschiedene Lebensformtypen entstanden. Der Lebensformtyp „windend wachsend in Nebelwäldern“ besiedelt bis auf die Wälder in der Pantepuiregion und im Küstengebirge von Brasilien alle in Südamerika vorkommenden Nebelwaldgebiete. Die Ausbreitungsbarrieren konnten in der Eiszeit überwunden werden, und der im Vergleich zum Tiefland stärker strukturierte Lebensraum hat dazu beigetragen, mehr Arten entstehen zu lassen. Die windenden Tieflandarten haben trotz ihres größeren Verbreitungsgebietes eine weit geringere Artenzahl als die Nebelwaldarten. Die aufrecht wachsenden Nebelwaldarten haben im Süden die Grenze der Nebelwälder erreicht, und ihre Verbreitungsgrenze ist identisch mit der Grenze der windenden Nebelwaldarten. Warum sie nicht nördlich der Amotape-Huancabamba-Region vorkommen ist nicht geklärt, warum sie insgesamt weniger weit verbreitet sind als die windenden Nebelwaldrandarten erklärt sich durch die Verbreitungsmuster der Früchte fressenden Vögel. Die Huancabamba-Niederung stellt keine Ausbreitungsbarriere dar. Es wurde keine Art gefunden die nur nördlich oder südlich bis zur Grenze der Niederung vorkommt. Die Amotape-Huancabamba-Region stellt dagegen ein Diversitätszentrum der Gattung dar. Das zweite Diversitätszentrum ist die Cordillera Central in Peru. Die aufrecht wachsenden Hochgebirgsarten konnten sich teilweise aufgrund geologischer Barrieren nicht so weit ausbreiten, teilweise weil sich die ökologischen Bedingungen in den offenen Lebensräumen stärker ändern als in den Wäldern. Diese Lebensform ist mehrmals unabhängig entstanden. Die Trockengebiete wurden ebenfalls mehrmals unabhängig besiedelt, aber nur von wenigen, teilweise gering verbreiteten Arten. Die Bomarea-Floren in allen Regionen erweisen sich als polyphyletisch. Der aufrecht wachsende Lebensformtyp ist mehrmals entstanden, weil der für diese Lebensform nötige Habitattyp im Gesamtareal der Gattung stark fragmentiert ist. Der Lebensformtyp windend in Nebelwäldern wachsend ist nur einmal entstanden, weil sein Habitat nahezu kontinuierlich im Areal vorkommt oder zumindest während der letzten Eiszeit vorkam. Die Schwestergruppe der Alstroemeriaceae sind die Luzuriagaceae. Innerhalb der Alstroemeriaceae sind die Sphaerinen den Luzuriagaceae am ähnlichsten. Alstroemeria ist sicher monophyletisch, Bomarea ist ebenfalls monophyletisch oder paraphyletisch zu Alstroemeria. Die Alstroemeriaceae gehören ihrer Abstammung nach der austral-antarktischen Flora an.

The TOM complex, a multisubunit assembly in the mitochondrial outer membrane, mediates targeting and membrane translocation of virtually all nuclear-encoded mitochondrial preproteins analyzed so far. In the present study the mechanisms by which the TOM complex recognizes different precursor proteins and translocates them across the outer membrane were investigated. In a first part of study the isolated TOM complex was analyzed for its ability to interact with preproteins with N-terminal targeting signals. The TOM translocase was found to bind precursor proteins efficiently in a specific manner in the absence of chaperones and lipids in a bilayer structure. Following the initial binding, the presequence was transferred into the translocation pore in a step that required unfolding of the mature part of the preprotein. This translocation step was mediated also by protease-treated TOM holo complex that contains almost exclusively Tom40. The TOM core complex consisting of Tom40, Tom22, Tom5, Tom6 and Tom7 represents a molecular machine that can recognize and partially translocate mitochondrial precursor proteins. In a second part of study the interaction of BCS1 precursor with the TOM complex was investigated. BCS1 belongs to the group of proteins with internal, non-cleavable import signals. The information for import and intramitochondrial sorting of BCS1 was localized to the region consisting of amino acid residues 1-126. Three sequence elements were identified in this region: (i) a transmembrane domain (amino acid residues 45-68), (ii) a presequence-like helix (residues 69-83), and (iii) an import-auxiliary sequence (residues 84-126). The contribution of each of these elements to import was studied. The transmembrane domain was found not to be required for stable binding to the TOM complex. The Tom receptors (Tom70, Tom22 and Tom20), as determined by peptide scan analysis, had no affinity for peptides corresponding to the transmembrane domain. They did interact with the presequence-like helix, yet the highest binding was to the region covering residues 92-126. This latter region represents a novel type of signal with targeting and sorting function. It is recognized by all three known mitochondrial import receptors demonstrating their capacity to decode various targeting signals. The results of the present study suggest that the BCS1 precursor crosses the TOM complex as a loop structure. This is in contrast to preproteins with cleavable presequences which enter the TOM complex in a linear fashion with the N-terminal first. Once the precursor emerges from the TOM complex, all three structural elements are essential for the intramitochondrial sorting to the inner membrane.

Modern light microscopical techniques were employed to follow dynamical nuclear processes during the cell cycle and during DNA-repair. Laser-UVA-microirradiation The protein Rad51 is essential for the repair of double-strand breaks (DSBs) via the conservative homologous recombination repair pathway. To test the hypothesis that Rad51 localizes to damaged sites during DSB repair, a laser-UVA-microirradiation system was established. With this system spots with sizes around 1 µm in nuclei of living cells can be irradiated with UVA-light. After sensitization of cells by incorporation of BrdU into nuclear DNA and staining with the live cell dye Hoechst 33258, the system can be used to introduce double-strand breaks and single-strand breaks in the irradiated spots. The response of Rad51 to microirradiation By use of laser-UVA microirradiation the localization of Rad51 at damaged sites containing DNA double-strand breaks could be demonstrated. The accumulation of Rad51 at microirradiated sites was followed in cells fixed at increasing times after microirradiation. First Rad51 accumulations were visible 5 - 10 minutes after irradiation, and the number of cells with Rad51 accumulations increased until a plateau was reached 20 - 30 minutes after irradiation. In contrast, the majority of irradiated cells had accumulations of Mre11 protein already 5 - 10 minutes after irradiation. This is consistent with reports that nuclear Mre11 foci appeared early in the response to ionizing radiation, but absolute response times were faster after microirradiation than after ionizing radiation. Large-scale nuclear patterns were microirradiated, and Rad51 accumulations that reflected the shape of the irradiated patterns were found up to eight hours after irradiation. This conservation of the pattern of Rad51 accumulations, which reflect sites containing the damaged DNA, indicated that the chromatin in the irradiated cells performs no large scale reordering in response to DNA damage. The dynamics of chromosomes and chromosome territories In 1909 Theodor Boveri forwarded the hypothesis that arrangements of chromosome territories (CTs) are stably maintained during interphase, but subject to changes during mitosis. In the last decade several groups reported evidence for the stability of CT arrangements, but considerable movements of chromosomal subregions were also observed. The data concerning the maintenance or reordering of CTs during mitosis have been contradictory. Live cell imaging To follow the movements of chromosomes and CTs, a novel experimental approach was taken. Cells expressing a fusion protein of the core histone H2B with GFP (H2B-GFP) stably incorporate H2B-GFP into nucleosomes. In these cells chromatin regions were selectively marked by laser-photobleaching and followed by live cell microscopy. To this end, a live cell imaging system was established at a confocal laser-scanning microscope, which allows the observation of living cells for several days. Chromatin movements visualized by photobleached H2B-GFP To track possible movements in interphase cell nuclei, stripe patterns were bleached into nuclei at several stages of interphase. These patterns were retained for up to two hours, until they became invisible due to the replacement of bleached H2B-GFP by unbleached H2B-GFP, supporting the hypothesis that CT order is stably maintained during interphase. Nuclei, in which all chromatin except for a contiguous zone at one nuclear pole was bleached, were followed through mitosis. At prophase a number of unbleached chromosomal segments became visible. The segments showed a variable degree of clustering in metaphase. When daughter nuclei were formed, the segments locally decondensed into patches of unbleached chromatin. In all daughter cells the patches were separated by bleached chromatin, and clustered to a variable extent. These observations support the hypothesis that changes of chromosome neighborhoods occur during mitosis and that CT neighborhoods can profoundly vary from one cell cycle to the next.

The role of radial glial cells as guides for migrating neurons is well established, whereas their role as precursor cells is less understood. Here we examined the composition of radial glial cells and their proliferation in the mouse telencephalon during development. We found that almost all radial glial cells proliferate throughout neurogenesis. They consist of distinct subsets identified by the differential co?localization of the antigens RC2, the astrocyte-specific glutamate transporter (GLAST) and the brain lipid-binding protein (BLBP). In addition, from on late neurogenesis GLAST- and BLBP-antisera label precursor cells with non-radial, but stellate morphology and thereby cover almost the entire progenitor pool in the developing cerebral cortex. The subsets identified by differential expression of these antigens differ in their transcription factor expression and cell cycle characteristics. Moreover, we could show by morphologically tracing ventricular zone precursor cells, that cells with a radial morphology constitute the majority of precursor cells in the CNS during neurogenesis. Furthermore, we here present indications showing that radial glial cells divide without retracting their processes during M-phase, suggesting that radial glial cells can proliferate and guide migrating neurons at a time. The molecular signals regulating this crucial morphology of radial glial cells, however, are largely unknown. Here we show that radial morphology is impaired in the Reelin-deficient cerebral cortex of the reeler mouse correlated to a decrease in the content of BLBP in radial glial cells. These defects were restricted to the cerebral cortex, but did not occur in the basal ganglia that exhibit normal migration and radial glial cell differentiation in the reeler mouse. These defects could be rescued in vitro by addition of Reelin. Even in cultures of radial glial cells isolated by fluorescent-activated cell sorting Reelin lead to an increase in BLBP. These data therefore demonstrate a direct signalling of Reelin to radial glial cells, thereby regulating their bipolar morphology - most likely involving BLBP - in a region-specific manner.