Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv

Zur Strukturanalyse des Typ III-Sekretionssystems, kodiert von der Salmonella- Pathogenitätsinsel 2, wurden polyklonale Antikörper gegen rekombinante Proteine des Sekretionsapparates erzeugt. Zur Entfernung unspezifischer Bindungen wurden die polyklonalen Antiseren an eine CNBr-aktivierte Sepharose 4B, gekoppelt mit Salmonella- Lysaten, präadsorbiert. Anschließend konnten die Antiseren für verschiedene Immunoblotanalysen eingesetzt werden. Durch eine Membranfraktionierung mit N-Lauroyl-Sarcosin konnte die subzelluläre Lokalisation der Apparatsproteine SsaC, SsaN, SsaV und SsaB bestimmt werden. Dabei wurde SsaC in der äußeren, SsaN und SsaV in der inneren Membranfraktion nachgewiesen. SsaB war nur in der löslichen Fraktion detektierbar. Um mögliche Proteinkomplexe innerhalb des Sekretionsapparates zu identifizieren, wurde der membranpermeable Quervernetzer DSS eingesetzt. So konnten für das Sekretin-bildende Protein SsaC und für das putative Translokatorprotein SseD oligomere Strukturen nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung der Effekte von Mutationen in verschiedenen SPI2-Genen auf die Synthese einzelner Proteine des Sekretionsapparates wurde deutlich, dass das Zwei- Komponenten-Regulationssystem SsrAB sowie alle untersuchten Apparatsproteine eine essentielle Rolle in der Synthese bzw. im Aufbau des Sekretionsapparates spielen. Lediglich eine Mutation in ssaV oder ssaG hatte einen weniger starken Effekt auf die Synthese der Apparatsproteine, so dass SsaC in Wildtyp-Mengen detektiert werden konnte. Darüber hinaus wurde die Synthese einzelner Proteine des Sekretionsapparates auch in Abhängigkeit des pH-Wertes analysiert. Nach einer Absenkung des pH-Wertes auf pH 5,8 nahmen die Proteinmengen weitaus stärker zu als ohne pH-Wert-Veränderung. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass dieser Unterschied in den synthetisierten Proteinmengen, in Abhängigkeit des pH-Wertes, nicht auf eine verstärkte Transkription zurückzuführen ist und dass es sich um einen SPI2-spezifischen Effekt handelt. Die Kinetik des Aufbaus des Sekretionsapparates wurde anhand der Sekretion des putativen Translokatorproteins SseB bestimmt. 1 h nach der Absenkung des pH-Wertes auf pH 5,8 wurde eine intrazelluläre Akkumulation von SseB detektiert. Zu diesem Zeitpunkt konnte kein SseB auf der Zelloberfläche lokalisiert werden. Eine Sekretion von SseB wurde erst 3 h nach der Säure-Induktion beobachtet. Demzufolge muss der Sekretionsapparat in diesem Zeitraum vollständig aufgebaut und funktional intakt sein, um die pH-induzierte Sekretion zu ermöglichen. Das SPI2-Protein SsaB (SpiC) ist für die Sekretion der putativen Translokatorproteine SseB und SseC erforderlich. So könnte SsaB eine Komponente des Typ IIISekretionsapparates darstellen oder die Funktion eines Chaperones für die Effektorproteine, bzw. eines GSP-spezifischen Chaperones für das Sekretin-bildende Protein SsaC besitzen. Ebenso wäre es möglich, dass SsaB für die korrekte Lokalisation von SsaC in der äußeren Membran verantwortlich ist. Aus S. typhimurium konnten die als Nadel-Komplexe bezeichneten makromolekularen Strukturen, die den gesamten Sekretionsapparat darstellen, isoliert aber nicht eindeutig identifiziert werden. Da in einer SPI1-Mutante, die einen Defekt im Typ IIISekretionsapparat hat, keine Nadel-Komplexe mehr angereichert werden konnten, liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei den Nadel-Komplexen, isoliert aus S. typhimurium- Wildtyp, um die SPI1-Strukturen handelt.

Die Rolle der Transduktion beim horizontalen Gentransfer ist bislang wenig untersucht. Die Bedeutung, die diesem Mechanismus beim Austausch von genetischem Material in der Natur zukommt, kann nur geklärt werden, wenn möglichst umfassende Informationen über das Vorkommen von transduzierenden Bakteriophagen verfügbar sind. Zur Erforschung des Ausmaßes des phagenvermittelten Gentransfers war es notwendig, Methoden zu entwickeln, die nicht auf die Verfügbarkeit kultivierbarer Indikatorbakterien zum Nachweis von Phagen sowie Spender- und Empfängerstämme zum Nachweis der Transduktion angewiesen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur indikatorunabhängigen Identifizierung transduzierender Bakteriophagen entwickelt. In Phagenpartikel verpackte DNA wurde als Template für die PCR-Amplifikation von bakterieller 16S rDNA eingesetzt. Dabei wurden PCR-Primer verwendet, die eine Amplifikation der 16S rRNA-Gene der meisten Eubakteria ermöglichen. Die Sequenzierung der klonierten Amplifikationsprodukte ermöglichte die retrospektive Identifizierung der Wirtsbakterien. Zur Etablierung dieser Methode wurde der generell transduzierende Salmonella-Phage P22 eingesetzt. Erste Anwendungen auf verschiedene Umweltproben zeigten, daß dieser Ansatz den Nachweis generell transduzierender Bakteriophagen ohne Isolierung und Kultivierung der Wirtszellen ermöglicht. Daher ist es auch möglich, Phagen, die am Gentransfer beteiligt sind, ohne Selektion durch die derzeit kultivierbaren Wirte zu detektieren. Schon in den ersten Testanwendungen konnten Phagen von 26 verschiedenen Gramnegativen Bakterienspezies nachgewiesen werden, bei denen bisher keine transduzierenden Viren bekannt waren. Die Untersuchung einer Moorquellwasserprobe brachte Informationen über Phagen mit bisher unbekannten Wirtszellen. Die hier vorgestellte Methode kann als Prototyp des indikatorunabhängigen Nachweises generell transduzierender Phagen für prinzipiell alle Bakterienarten gelten. Unter Einsatz verschiedener 16S rDNA-Primerpaare ist der Suche nach transduzierenden Partikeln in der Umwelt nahezu keine Grenze gesetzt. Dieser Ansatz erlaubt sowohl die Überprüfung einer Probe auf das Vorkommen transduzierender Phagen mit unterschiedlichen Wirtsspezifitäten als auch die gezielte Suche nach am DNA-Transfer beteiligten Phagen spezieller Vertreter der Prokaryonten. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der bisher unbekannten Salmonella-Phagen 7D, PS79 und A12. Es konnte gezeigt werden, daß diese nicht mit P22 sowie anderen prominenten Bakterienviren verwandt sind und daher drei neue Phagenfamilien repräsentieren. Mikrobiologische Untersuchungen erbrachten, daß es sich dabei um zwei temperente und einen virulenten generell transduzierenden Phagen handelt. Bezüglich ihrer morphologischen und Nukleinsäure-Merkmale zählen sie zur Familie der Caudovirales. Die Phagen wurden in Hinsicht auf ihr Wirtsspektrum sowie auf phagenvermittelte Schutzmechanismen lysogener Zellen untersucht. Im Rahmen der molekulargenetischen Analyse konnte die Größe der Phagengenome ermittelt werden und für 7D und PS79 konnten Restriktionskarten für acht bzw. sieben Enzyme erstellt werden. Der Phage A12 entzog sich, wahrscheinlich aufgrund ausgeprägter DNASekundärstrukturen, einer ausführlichen Restriktionskartierung, so daß diese auf ein Enzym beschränkt werden mußte. Untersuchungen PS79-lysogener Zellen weisen darauf hin, daß der Prophage als extrachromosomale Replikationseinheit vorliegt. Für den Phagen 7D wurde die Integration durch ortsspezifische Rekombination sowie der Integrationsort auf dem Chromosom von Salmonella nachgewiesen. Die Charakterisierung der Phagen 7D, PS79 und A12 erbrachte neue Informationen über die Vielfalt generell transduzierender Bakteriophagen bei Salmonella. Insgesamt zeigen die erzielten Ergebnisse deutlich, daß der horizontale Transfer genetischen Materials durch Transduktion, insbesondere im Hinblick auf die Sicherheitsforschung im Zusammenhang mit der Freisetzung gentechnisch veränderter Organismen, nicht länger als vernachlässigbarer Faktor eingestuft werden kann.

Das Zytomegalievirus der Maus (MCMV) zählt zur Familie der Herpesviridae und hat verschiedene Strategien entwickelt, um dem Immunsystem des Wirts zu entgehen. Einer dieser Mechanismen beeinflusst die Antigenpräsentation durch MHC-Klasse-I-Moleküle und wird durch das virale Genprodukt von m152 vermittelt. Dieses kodiert für ein Glykoprotein von 40 kDa Größe und wird in dieser Arbeit m152/gp40 genannt. M152/gp40 blockiert den Transport von MHC-Klasse-I-Molekülen zur Zelloberfläche und erkennt nur Moleküle der Maus, nicht aber des Menschen. Diese speziesspezifische Erkennung von MHC-Klasse-IMolekülen ist bisher nur für m152/gp40 bekannt und es wurden daher in der vorliegenden Arbeit Eigenschaften von MHC-Klasse-I-Molekülen untersucht, welche diese Speziesspezifität begründen. Es konnte gezeigt werden, dass die Spezies des gebundenen ß2- Mikroglobulins, sowie die Anzahl der Glykosylierungen der schweren Kette keinen Einfluss auf die Erkennung von MHC-Klasse-I-Antigenen durch m152/gp40 haben. Die Eigenschaft von m152/gp40, MHC-Klasse-I-Moleküle des Menschen nicht zurückzuhalten, wurde genutzt, um mit Hilfe chimärer MHC-Klasse-I-Moleküle den Bereich, der von m152/gp40 erkannt wird, einzugrenzen. Dieser liegt hauptsächlich in der a1-Domäne, weil die a2- Domäne nur eine schwache Retention bewirkt. Zwar können MHC-Klasse-I-Moleküle, die nur den luminalen Bereich umfassen, von m152/gp40 zurückgehalten werden, doch akkumulieren diese im ER und nicht im „ER-Golgi intermediate compartment“ (ERGIC) / cis-Golgi, wie Wildtyp-H-2Kb. Es wird diskutiert, ob dies ein Hinweis auf einen aktiven Transportmechanismus von MHC-Klasse-I-Molekülen aus dem ER ins ERGIC ist. Neben der Untersuchung der Funktion von m152/gp40 aufgrund der Expression des Gens allein, wurde der Einfluss der drei viralen Genprodukte von m04, m06 und m152 auf die MHC-Klasse-I-Oberflächenexpression mit Hilfe von MCMV-Deletionsmutanten untersucht. Anhand der Analyse der Oberflächenexpression verschiedener MHC-Klasse-I-Allele nach Infektion mit Wildtyp-MCMV oder MCMV-Mutanten konnte gezeigt werden, dass in MCMV nur m06/gp48 und m152/gp40 die Oberflächenexpression von MHC-Klasse-IMolekülen reduzieren. Von den untersuchten Allelen werden H-2Kb und H-2Kk nur schwach zurückgehalten. Es wurde gezeigt, dass dies auf die Funktion von m04/gp34 zurückzuführen ist, wobei m04/gp34 generell die Funktion von m152/gp40 und kaum die Funktion von m06/gp48 behindert. Für weitere Allele konnte gezeigt werden, dass diese unterschiedlich stark von den einzelnen viralen Proteinen zurückgehalten werden. So wird H-2Dd nur von m06/gp48 und m152/gp40 gemeinsam gut zurückgehalten, wohingegen H-2Db von m152/gp40 alleine gut zurückgehalten wird. Eine mögliche Rolle der unterschiedlichen Oberflächenexpression von MHC-Klasse-I-Allelen nach MCMV-Infektion für die Inhibition von NK-Zellen wird diskutiert.

This study investigated the immunobiology of MOG-induced EAE in the DA rat, an animal model, which reproduces the immunopathology of the type II MS lesion (Lucchinetti et al., 2000). A newly established immunisation protocol results in a highly synchronised biphasic form of EAE, which mimics the disease course of secondary progressive MS, albeit in a strongly abbreviated time course (Figure 3.1.1). This study demonstrates that MOG-specific autoantibodies are responsible for initiating clinical relapse and driving disease progression. On the background of mild, sub-clinical inflammatory activity in the CNS, pathogenic antibodies enter the CNS and mediate demyelination, a process that in turn amplifies the local inflammatory response (Figure 3.1.14 A). It should however be noted that lethal clinical relapses may also occur in the absence of a pathogenic antibody response if an inflammatory lesion develops in a region of the CNS that is particularly sensitive to damage, or where it may perturb vital functions, such as the brain stem. Although antibodies have been shown to amplify the severity of ongoing clinical EAE (Schluesener et al., 1987; Linington et al., 1988; Lassmann et al., 1988), firm evidence for a role in driving relapse and disease progression was missing. This study has now established this principal, which in all probability is relevant to our understanding of the pathogenesis of severe, steroid non-responsive relapses in MS patients. However, this model of EAE is an artificial system, in which the role of antibody is only apparent because of the different kinetics of MOG-specific T and B cell responses. In MS we still have to answer two crucial questions, namely the identity of the autoantigens targeted by the demyelinating antibody response, and the factors that may trigger this response. MOG is the only myelin protein known to initiate a demyelinating antibody response in EAE, and MOG-induced EAE has provided a valuable tool to identify the role of pathogenic autoantibodies in immune mediated demyelination. However, there is a major discrepancy between the proportion of MS patients with pathogenic MOG-specific antibodies in their circulation (5%; Haase et al., 2000) and the frequency of patients with pathological changes suggestive of antibody-mediated pathomechanisms (>50%; Lucchinetti et al., 2000). This discrepancy may in part be accounted for by the absorption of the pathogenic antibodies into the CNS, which will lead to a dramatic reduction of the antibody titre in the periphery, as demonstrated in section 3.1.3.4 of this study. On the other hand, it is unlikely that MOG is the only target autoantigen, which is exposed on the myelin surface and can therefore initiate a demyelinating autoantibody response. The identification of potential targets is a prerequisite to develop diagnostic kits to identify those patients with pathogenic autoantibody responses and then provide an appropriate therapy such as plasma exchange, or immuno-absorption. As demonstrated in this study, DNA vaccination using a plasmid encoding a myelin antigen is one approach to generate high titre autoantibody responses directed against the native protein. The pathogenicity of this antibody response can then be assayed in the same animal by inducing EAE. This method circumvents problems such as purity, yield and denaturation, all of which complicate any study using antigens isolated from the CNS or generated using recombinant technologies. Coupling this approach to a proteomics based analysis of the myelin membrane and reverse genomics to identify candidate gene products provides the means to map out those protein antigens that can be targeted by a demyelinating autoantibody response. The feasibility of this concept is currently being tested in the rat using PLP and MAG as myelin components that may in certain circumstances provoke a pathogenic autoantibody response. Such an analysis will, however, not detect pathogenic antibody responses to glycolipid antigens, which are major target autoantigens in a number of diseases affecting the peripheral nervous system such as Guillain Barré syndrome (GBS). In GBS a pathogenic antibody response to gangliosides appears to be triggered by infections with particular serotypes of Campylobacter jejuni (Fredman, 1998; Willison and O´Hanlon, 1999). In the majority of patients these antibody responses are an acute phenomenon and disappear as the patients recover (Hahn, 1998). It is conceivable that a similar mechanism is responsible for the initiation of severe relapses in some MS patients, if an infection triggers a cross-reactive antibody response to a surface glycolipid epitope. This would induce an episode of acute CNS demyelination that would not be immediately responsive to immunosuppressive therapy, as tissue damage and amplification of the local inflammatory response would be driven by the pre- existing antibody response. Analysis of the autoantibody responses in MS should therefore be extended to examine lipid as well as protein autoantigens. Such studies should also not be restricted to myelin, but also address the question of responses to other structures such as the axon and oligodendrocyte progenitor cells. Such autoantibody responses are however only conditionally pathogenic, in other words their pathogenic potential is only expressed if they can enter the CNS across the blood brain barrier (BBB)(Litzenburger et al., 1998; Bourquin et al., 2000). In EAE the inflammatory insult to the CNS is responsible for the disruption of BBB function and the entry of antibody into the nervous system. MS is characterised by repeated episodes of CNS inflammation but what initiates and maintains this response is unclear. The observation, that DA rats develop a similar, although eventually self-limiting response in the CNS after immunisation with MOG-peptide in CFA provides a model to investigate the immuno-regulatory deficit(s) responsible for chronic CNS inflammation. The disease model is very reproducible with >90% of animals relapsing after peptide immunisation as opposed to

Im Unterschied zu den HLA-Klasse-Ia-Molekülen ist das nicht-polymorphe Klasse-Ib-Molekül HLA-G v.a. in der Plazenta exprimiert. Es wird postuliert, daß HLA-G die Immuntoleranz des mütterlichen Immunsystems gegen den „semiallogenen“ Fetus mitreguliert. In allen anderen Zellen und Geweben, in denen es gefunden wurde, ist die Menge im Vergleich zu klassischen Klasse-I-Molekülen um Größenordnungen geringer. Auch in der Genexpression unterscheidet sich HLA-G drastisch von allen übrigen Klasse-I-Molekülen. Am auffallendsten ist dabei das Auftreten verschiedener alternativer Spleißformen. Neben dem Volle-Länge-Transkript G1m gibt es eine Reihe verkürzter Isoformen: G2 (G2m, Da2-Domäne), G3 (Da2/Da3-Domäne), G4 (Da3-Domäne) sowie zwei Formen, die für lösliche Proteine kodieren, da die nicht-entfernte Intron-4-Sequenz zu einem vorzeitigen Translationsstop führt, G5 (G1s), G6 (G2s, Da2-Domäne, + In4). Die schwache Expression von HLA-G bestätigte sich auch für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Haut- und Muskelbiopsien sowie Gehirnproben. Transkripte für HLA-G und die verkürzten Isoformen waren in fast allen Proben nachweisbar, wobei das Volle-Länge-Transkript die dominante Form war. Bei den nach Krankheitsgruppen eingeteilten Hautbiopsien und den Muskelbiopsien mit definierten Diagnosen konnte keine Korrelation eines bestimmten Expressionsmusters mit einer bestimmten Krankheitsgruppe bzw. Diagnose festgestellt werden. Diese Heterogenität des Expressionsmusters sowie die selektive Hochregulation der Volle-Länge-Isoform G1m auf Transkriptions- und Proteinebene in Glioblastomzellinien und Myoblasten, die nur eine äußerst schwache konstitutive Expression von HLA-G aufweisen, nach Behandlung mit IFNg deutet auf eine differentielle Regulation hin. Um die einzelnen Isoformen getrennt voneinander untersuchen zu können, wurden Transfektanten für jede Form in der Klasse-I-negativen B-Zellinie 721.221 etabliert. Nur die Volle-Länge-Isoform G1m sowie deren lösliche Variante G1s konnten auf der Zelloberfläche bzw. im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Von den übrigen Isoformen konnten nur EndoH-sensitive Polypeptide gefunden werden, und auch Immunofluoreszenzfärbung mit einer Reihe von Klasse-I-Ak zeigte keine Zelloberflächenexpression. Es muß daraus geschlossen werden, daß die verkürzten Isoformen in der Zelle zurückgehalten werden. HLA-G kann auf zwei Wegen die Aktivität von Immuneffektorzellen regulieren: direkt über ILT2 und indirekt über HLA-E. Das MHC-Klasse-I-Molekül HLA-E wird durch Bindung eines Nonamers (P3-11) aus dem Signalpeptid verschiedener Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche von Zellen stabilisiert. Aus der Interaktion dieses funktionellen HLA-E/Peptid-Komplexes mit dem inhibitorischen Rezeptorkomplex CD94/NKG2A auf NK-Zellen resultiert ein Schutz dieser Zellen vor der NK-Lyse. Auch das entsprechende Peptid aus der Signalsequenz von HLA-G ist ein Ligand für HLA-E. Allerdings wurde gezeigt, daß die Stabilisierung von HLA-E auf der Zelloberfläche durch das Peptid G3﷓11 schwächer als mit anderen Klasse-I-Peptiden und auch weniger stabil ist. Effektive Inhibition der Lyse der NK-Zellinie NKL über diese Interaktion von HLA-E mit CD94/NKG2A findet man nur bei HLA-G1m-Transfektanten. Diese werden auch durch die direkte Interaktion von HLA-G1m mit einem weiteren inhibitorischen Rezeptor auf NKL - ILT2 - geschützt. In den 721.221-Transfektanten der verkürzten HLA-G-Isoformen war eine unphysiologisch hohe Konzentrationen an HLA-G-Polypetid notwendig, um die kritische Menge an HLA-E-Ligand für den Schutz dieser Zellen vor der Lyse durch NK-Zellen liefern zu können. Das war nur für eine äußerst stark exprimierende G3-Transfektante der Fall. Der Grund dafür liegt wahrscheinlich in einer ineffizienteren Prozessierung des Signalpeptids von HLA-G und einer im Vergleich mit anderen HLA-E-Liganden geringeren Bindungsaffinität des Peptids G3-11 für HLA-E. Eine Funktion der verkürzten HLA-G-Isoformen durch die direkte Interaktion mit Rezeptoren auf NK-Zellen konnte nicht nachgewiesen werden und ist wegen ihrer intrazellulären Expression auch unwahrscheinlich. Vielmehr deuten erste Daten, die zeigen, daß die Isoformen, direkt oder indirekt, mit dem TAP-Komplex assoziiert sind, auf eine mögliche Funktion im Rahmen der Antigenpräsentation hin. Worin diese besteht, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Daher ist anzunehmen, daß HLA-G in vivo hauptsächlich über HLA-G-bindende KIR immunregulatorische Funktionen wahrnimmt und durch indirekte Wirkung über HLA-E-CD94/NKG2A modulierend eingreift.

Ziel dieser Arbeit war es, die aus der Genomsequenz von M. jannaschii identifizierten Komponenten der Biosynthese und Inkorporation von Selenocystein biochemisch und molekularbiologisch zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: a) Die tRNASec von M. jannaschii konnte mit gereinigter Seryl-tRNA-Synthetase von E. coli korrekt in vitro mit L-Serin beladen werden. Die Umwandlung der Seryl-Gruppe in eine Selenocysteyl-Gruppe war mit gereinigter Selenocystein-Synthase und Selenophosphat- Synthetase von E. coli ebenfalls erfolgreich. In Extrakten von M. jannaschii konnte darüber hinaus die Selenocystein-Synthase-Aktivität nachgewiesen werden. Eine rekombinante tRNASec von M. maripaludis, bei der eine Base im Anticodon-"Loop"ausgetauscht worden war, konnte im heterologen Wirt E. coli Selenocystein inserieren. b) Die Natur und die Lokalisation des archaeellen SECIS-Elements konnte durch die heterologe Expression eines Selenoprotein-Gens von M. jannaschii in M. maripaludis bewiesen werden. Die heterologe Selenoprotein-Synthese war dabei abhängig vom Vorhandensein und der strukturellen Unversehrtheit des RNA-Elements in der 3'-nicht-translatierten Region der Selenoprotein-mRNA. c) Die biochemische Charakterisierung des heterolog in E. coli überproduzierten MJ0495- Proteins von M. jannaschii ergab Dissoziationskonstanten für Guanin-Nukleotide, wie sie für bakterielle SelB-Spezies typisch sind. Darüber hinaus diskriminiert das MJ0495-Protein zwischen der kognaten Ser-tRNASec und Sec-tRNASec; letztere wird mit höherer Affinität gebunden. MJ0495 stellt deshalb den Selenocystein-spezifischen Translationsfaktor in Archaea (aSelB) dar. Das in der nicht-translatierten mRNA-Region liegende SECIS-Element wird allerdings (im Unterschied zu SelB von E. coli) nicht von aSelB gebunden. d) Es konnten mehrere SECIS-bindende, und ein aSelB-bindendes Protein identifiziert werden, die möglicherweise für die notwendige Kommunikation zwischen aSelB und dem SECISElement sorgen. e) Durch die Proteomanalyse konnte gezeigt werden, dass in M. maripaludis einige Proteine in Abhängigkeit von der Selenversorgung gebildet werden. Dabei wurden auch solche Proteine selenabhängig synthetisiert, die kein Selenocystein enthalten.

1. Der Aufbau des Membranpotentials und die ATP-Synthese in H. halophilus wurden durch Cl- nicht beeinflußt. Zusammen mit den Ergebnisse früherer Studien gibt es keinen Hinweis darauf, daß Cl- an der primären Bioenergetik von H. halophilus beteiligt ist. 2. Es wurde ein unter Hochsalzbedingungen induziertes, Cl--abhängiges Transportsystem für das kompatible Solut Betain identifiziert und charakterisiert. Dieses System transportiert Betain mit einer maximalen Geschwindigkeit von Vmax.= 14,0 ± 0,2 nmol/min x mg Protein und hat einen Km-Wert für Betain von 72,8 ± 10,4 µM. Die Ergebnisse der durchgeführten Hemmstoffstudien deuten darauf hin, daß die Betain-Aufnahme in H. halophilus über einen primären Transportmechanismus erfolgt. 3. Die Beweglichkeit von H. halophilus auf Weichagarplatten zeigt eine klare Cl--Abhängigkeit. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte festgestellt werden, daß die Flagellenbildung in H. halophilus Cl--abhängig ist. Das Flagellin wurde gereinigt, und es wurde ein spezifisches Antiserum dagegen hergestellt. 4. Immunologische Analysen ergaben, daß die Synthese des Flagellins Wachstumsphasen-abhängig war. In der log-Phase und in der frühen stationären Phase wurden große Mengen an Flagellin nachgewiesen, während die Flagellinkonzentration in der späten stationären Phase zurückging. Interessanterweise war die Flagellinsynthese zu jedem Zeitpunkt des Wachstums Cl--abhängig; in Abwesenheit von Cl- war kein Flagellin nachzuweisen. Dies ist der erste Nachweis einer Cl--abhängigen Proteinproduktion in einem Prokaryonten. 5. Es wurde eine Plasmid-Genbank aus chromosomaler DNA von H. halophilus generiert, die 5807 Klone mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 4415 Bp enthält. Dies entspricht einer Wahrscheinlichkeit von 99,8%, daß sämtliche Bereiche des Genoms von H. halophilus abgedeckt wurden. Die für das Flagellin (fliC) und die β-Untereinheit der F1FO-ATP-Synthase (atpD) aus H. halophilus kodierenden Gene wurden mit Hilfe von Koloniehybridisierungen in der Genbank identifiziert. Anschließend wurden Teile dieser Gene kloniert und sequenziert. 6. Northern-Blot- und RT-PCR-Analysen zeigten, daß die Transkription von fliC durch Cl- um den Faktor 2 stimuliert wird. Dies ist der erste Nachweis einer durch Cl- stimulierten Transkription eines Gens mit bekannter Funktion. 7. Versuche zur Substitution von Cl- durch kompatible Solute ergaben, daß Glutamat, Succinat und Fumarat die Cl--Abhängigkeit des Wachstums von H. halophilus aufheben können. Für Glutamat wurde gezeigt, daß dies auf die nicht Cl--abhängige Aufnahme von Glutamat zurückzuführen ist. Für die Beweglichkeit und die Flagellinsynthese wurde gezeigt, daß Glutamat Cl- nicht effektiv substituieren kann. 8. Mit Hilfe von 2D-gelelektrophoretischen Studien konnten 5 weitere Cl-- abhängig synthetisierte Proteine in H. halophilus nachgewiesen werden. Die Identifizierung dieser Proteine erfolgte durch N-terminale Sequenzierung und nachfolgender Suche nach ähnlichen Proteinen in Datenbanken. Zwei davon, YvyD und SodA, gehören zum σB-Regulon von B. subtilis. YvyD ist von besonderem Interesse, da es als σ-Faktor modulierendes Protein an der Cl-- abhängigen Signaltransduktionskette, die von der Wahrnehmung des Reizes zur Genexpression führt, beteiligt sein könnte. Ein drittes Protein (YhfK) ist Aspartatund Glutamat-Semialdehyd-Dehydrogenasen sehr ähnlich. Das vierte Protein ist der ATP-bindenden Untereinheit verschiedener ABC-Transporter sehr ähnlich. Das fünfte identifizierte Protein, LuxS, ist in Gram-negativen an der Biosynthese von Autoinduktoren beteiligt. 9. Teile der Gene, die in H. halophilus für YvyD bzw. LuxS kodieren, wurden mit Hilfe von degenerierten Oligonukleotiden per PCR amplifiziert, kloniert und sequenziert. 10. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, daß 11 von 44 darauf untersuchten Arten Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien eine Cl-- abhängige Osmotoleranz aufweisen. Dies waren: Aeromonas hydrophila, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Paracoccus denitrificans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Thermus thermophilus und Vibrio fischeri.

In der vorliegenden Dissertation wurde mit licht- und elektronenmikroskopischen Methoden die Tunika von Cystodytes dellechiajei (Ascidiacea, Aplousobranchia) histologisch und cytologisch untersucht. Diese koloniebildende Ascidie kommt in zwei Farbvarianten (violette und graugrüne Kolonien) im Mittelmeer vor. Beide Farbvarianten enthalten pharmakologisch interessante, intensiv farbige Pyridoacridinalkaloide. Bisher lagen allerdings noch keine Informationen darüber vor, in welchen Organen der Tiere diese Sekundärstoffe lokalisiert sind bzw. welche Zellen sie produzieren. Daher wurden zunächst die Gewebeelemente der Ascidie charakterisiert. Eine mittelgroße Kolonie enthält ca. 100 Zooide, die vollständig in eine gemeinsame Tunika eingebettet sind. Die Tunika bildet mit über 98 % das Hauptvolumen der Kolonien, während Zooidgewebe nur einen Volumenanteil von 1,25 % ausmachen. Die Kolonien werden nach außen von einer 70 - 100 nm dicken Cuticula abgeschlossen, darunter befindet sich eine subcuticuläre Schicht aus sehr dicht angeordneten Matrixfasern (Faserabstände < 0,5 µm). Die Tunikamatrix besteht aus drehrunden Fasern (Ø 15-25 nm) die in Streutextur ein dichtes Geflecht bilden. Eine histochemische Analyse der Matrix zeigte, daß sie zu einem großen Teil aus Mukopolysacchariden aufgebaut ist. Die Zooide liegen in individuellen, nach oben offenen Hohlräumen, die von einer dichten Schicht aus Matrixfasern ausgekleidet sind. Jedes Zooid besitzt zudem eine Kapsel aus überlappend angeordneten, scheibenförmigen Kalkschuppen. Die Zooide sind durch individuelle Kanäle mit der Meerwasserumgebung verbunden. Jeder Kanal besitzt an seinem distalen Ende eine sechslappige Öffnung aus Tunikagewebe, die geöffnet und verschlossen werden kann. Die Tunika enthält sechs verschiedene Zelltypen: Blasenzellen, Pigmentzellen, granuläre und vakuolisierte filopodiale Zellen, kompartimentierte Zellen und Morulazellen. Blasenzellen besitzen eine große Vakuole (Ø ca. 60 µm), die mit Schwefelsäure (pH 1) gefüllt ist. Blasenzellen bilden den Hauptanteil des Tunikavolumens. In violetten Pigmentzellen konnten pharmakologisch aktive Pyridoacridinalkaloide (= violette Pigmente) nachgewiesen werden. Das Pigment der grünen Kolonien wurde chemisch bisher nicht identifiziert. Die cytotoxischen Stoffe werden über ein komplexes System aus Fibrillen und Pigmentkörnern in der Vakuole angereichert. Violette und grüne Pigmentzellen unterscheiden sich in Anzahl und Größe der Pigmentkörner, besitzen aber denselben Grundaufbau aus fibrillären und granulären Elementen innerhalb der Vakuole. Je nach physiologischem Zustand der Pigmentzellen kommen verschiedene Bautypen von Pigmentzellen vor: Oligojunktionale, polyjunktionale und agranuläre Pigmentzellen. Beim polyjunktionalen und agranulären Typ liegt eine Überproduktion an Netzwerkfibrillen vor, während der oligojunktionale Typ ein ausgewogenes Verhältnis an Netzwerkfibrillen und Pigmentkörnern enthält. Die Mehrzahl der Pigmentzellen ist oligojunktional, daher wird dieser Typ auch als „Grundtyp” bezeichnet. Filopodiale Zellen haben mehrere lange cytoplasmatische Ausläufer, die netzwerkartig die Tunika durchziehen. Granuläre filopodiale Zellen enthalten zahlreiche eosinophile Granula mit verschieden elektronendichtem Inhalt. Vakuolisierte filopodiale Zellen besitzen keine oder nur sehr wenige Granula. Beide Typen der filopodialen Zellen phagocytieren in der Tunikamatrix vorkommende Bakterienzellen. In filopodialen Zellen wurden häufig große lysosomale Kompartimente nachgewiesen. Filopodiale Zellen könnten einen universalen Zelltyp darstellen, der aus den Zooiden in die Tunika einwandert und sich dort in die übrigen Tunkazelltypen umwandelt. Kompartimentierte Zellen enthalten große lysosomale Kompartimente, die mit myelinartigen Membrankörpern und granulärem Material gefüllt sind. Die kompartimentierten Zellen enthalten häufig große Mengen an Bakterien des Typs A. In der Tunika wurden darüber hinaus große Mengen an stäbchenförmigen Bakterienzellen drei verschiedener Strukturtypen (Typ A, B, C) nachgewiesen. Bakterienzellen des Typs A sind Gram-positive Stäbchen, Zellen der Typen B und C sind Gram-negativ. Filopodiale Zellen phagocytieren vor allem Bakterien des Typs B und C, während in kompartimentierten Zellen große Mengen an Bakterien des Typs A nachgewiesen werden konnten (intrazelluläre Bakteriendichten bis 1011 Zellen/ml). Aus Tunikagewebe wurden drei verschiedene Bakterienstämme isoliert, kultiviert und mikroskopisch untersucht. Alle drei Stämme sind Gram-negativ und unbegeißelt, sind also wahrscheinlich dem in der Tunika nachgewiesenen Typ B zuzuordnen. Die Isolate bilden häufig pleomorphe Zellen aus, die meisten Zellen sind jedoch stäbchenförmig. Die Tunika der Larven von C. dellechiajei ist vierschichtig. Nur die innerste Schicht, das ”inner compartment” enthält granuläre filopodiale Zellen, Pigmentzellen und Blasenzellen. Kompartimentierte Zellen und Morulazellen fehlen. Darüber hinaus enthält das inner compartment Mischformen zwischen granulären filopodialen Zellen und Blasen- bzw. Pigmentzellen und Ansammlungen stäbchenförmiger, Gram-negativer Bakterienzellen.

Proteolytische Prozesse spielen eine wichtige Rolle während der Biogenese von Mitochondrien und bei der Qualitätskontrolle mitochondrialer Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von Proteinen in der Innen- und Außenmembran von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae untersucht. Ein erster Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Mechanismen der Proteolyse in der mitochondrialen Innenmembran. Dazu wurde der Abbau einer mutanten Variante des polytopischen Membranproteins Oxa1 verfolgt. Es zeigte sich, dass die m-AAA-Protease den Abbau von Oxa1ts vermittelt, während keine Hinweise auf eine Beteiligung der i-AAAProtease erhalten wurden. In Abwesenheit der m-AAA-Protease wird Oxa1ts ebenfalls proteolytisch durch eine (oder mehrere) bislang nicht identifizierte Metallopeptidase(n) gespalten. Allerdings ist kein vollständiger Abbau von Oxa1ts durch diese Peptidase(n) zu beobachten. Vielmehr akkumulieren proteolytische Intermediate in den Mitochondrien. Nach den vorliegenden Untersuchungen kann die endoproteolytische Aktivität der Metallopeptidase(n) entweder eine Vorraussetzung für die Proteolyse durch die m-AAAProtease sein oder aber einen Bestandteil eines molekularen Ersatzsystems zum Abbau von mitochondrialen Innenmembranproteinen in Abwesenheit der m-AAAProtease darstellen. Während der Proteolyse durch AAA-Proteasen wird eine Dislokation von Membranproteinen beobachtet. Daher wurde eine mögliche Beteiligung von Translokationsporen der Innenmembran an Abbauvorgängen untersucht. Eine Rolle der TIM17/23-Translokase konnte ausgeschlossen werden. Des weiteren konnte auch für die OXA1-Pore keine essentielle Bedeutung für die Dislokation von Membranproteinen während der Proteolyse nachgewiesen werden. Eine Inaktivierung der Proteine Mba1 und Pnt1, die an Insertion von mitochondrialen Proteinen in die Innenmembran beteiligt sind, führte jedoch zu einer Beeinträchtigung von Abbauprozessen in der Innenmembran. Diese Befunde weisen auf eine Rezeptor- oder Chaperon-Funktion von Mba1 und Pnt1 während des Abbaus durch die AAA-Proteasen hin. In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde genetisch und biochemisch nach Komponenten gesucht, die den Abbau von Proteinen der mitochondrialen Außenmembran vermitteln. Ein Fusionsprotein, HA-DHFRWT-Tom6, das eine lösliche entfaltete Domäne in das Cytoplasma exponiert und im TOM-Komplex assembliert ist, wurde als Modellsubstrat verwendet. Während in isolierten Mitochondrien kein Abbau stattfindet, unterliegt das Protein in vivo deutlicher Proteolyse. Dieser Prozess wurde als ATP-abhängig charakterisiert. Eine Beteiligung des vakuolären Proteolyse-Systems, der i-AAA-Protease sowie des Ubiquitin- Proteasom-Abbauweges konnte unter den verwendeten experimentellen Bedingungen ausgeschlossen werden. Zur Identifizierung von Komponenten, die an der Proteolyse von Außenmembranproteinen beteiligt sind, wurde eine genetische Durchmusterung durchgeführt. Eine temperatursensitive Mutante des essentiellen Außenmembranproteins Tom40, das unter nicht-permissiven Bedingungen rasch abgebaut wird, wurde verwendet, um nach stabilisierenden Mutanten zu suchen. Die identifizierten Mutanten unterdrückten zwar den Wachstumsdefekt, führten aber zu keiner Stabilisierung von Tom40ts, weshalb keine am Abbau beteiligten Komponenten identifiziert werden konnten. Allerdings wurde durch die Isolierung eines Suppressors ein Bereich innerhalb des Proteins Tom40 beschrieben, der für die Assemblierung von Tom40 in den TOM-Komplex essentiell ist.

1.Die A1-ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal-c2 kloniert und in Escherichia coli exprimiert.Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt.Die spezifischen Antiseren gegen die A1-ATPase- Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC,AhaE und AhaF wurden für die Studien dieser Arbeit eingesetzt. 2.Die für die hydrophile Domäne der A1-ATPase kodierenden Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG des methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden in den Überexpressionsvektor pGEM-4Z hinter die lac und T7-Promotoren kloniert.Dieses Konstrukt wurde pTL2 genannt.pTL2 enthält zusätzlich 162 Bp stromaufwärts von ahaE 3.Die auf pTL2 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert und die A1-ATPase funktionell synthetisiert.Die spezifische ATPase-Aktivität im zellfreien Extrakt von E. coli DK8 (pSÖ1)betrug 186 mU/mg Protein.Die Synthese der A1-ATPase-Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC und AhaF konnte nachgewiesen werden.AhaE und AhaG konnten nicht detektiert werden. 4.Die A1-ATPase wurde aus dem Zellextrakt von E. coli DK8 (pTL2)über Ultra- zentrifugation,Ammoniumsulfatfällung,Gelfiltration an BioPrep SE 1000/17, Ionenaustauschchromatographie an BioScale DEAE und einer zweiten Gelfiltration an Sephacryl S-300 HR bis zur apparenten Homogenität gereinigt. 5.Das gereinigte Enzym wies eine molekulare Masse von 355 kDa auf und setzte sich aus 5 verschiedenen Untereinheiten zusammen.Die einzelnen Untereinheiten AhaA (65 kDa),AhaB (55 kDa),AhaC (41 kDa),AhaD (28 kDa)und AhaF (9 kDa)wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert und wiesen im ATPase-Komplex eine Stöchiometrie von A3B3CDF auf.AhaE und AhaG waren nicht im Komplex enthalten. 6.Der ATPase-Testpuffer wurde für die heterolog exprimierte A1-ATPase optimiert (50 mM MES-HCl,40 mM Na-Acetat,30 mM NaHSO3,8 mM MgSO4,4 mM ATP,pH 5,2).Na-Acetat und Sulfit stimulieren die A1-A7.Die gereinigte A1-ATPase aus M. mazei Gö1 hydrolysierte Mg-ATP (im Verhältnis 2:1)als bevorzugtes Substrat mit einem V von 13 ± 3 U/mg Protein und einem K von 1,3 ± 0,3 mM für ATP. 8.DES,Hexestrol und Dienestrol wurden als spezifische Inhibitoren der archäellen A1-ATPase identifiziert.Die I Werte dieser Hemmstoffe betrugen 5 µmol Hexestrol/mg Protein,3 µmol DES/mg Protein und 6 µmol Dienestrol/mg Protein. 9.Quervernetzungsexperimente konnten belegen,dass die Kopien der Untereinheit AhaA in direkter Nachbarschaft zueinander stehen.Dies trifft auch für die Kopien der Untereinheit AhaB und für die Untereinheiten AhaA und AhaB untereinander zu.Zudem konnte eine direkte Nachbarschaft der Untereinheiten AhaA und AhaD festgestellt werden. 10.Die A1-ATPase besitzt eine dreifache Achsensymmetrie.Der Kopfteil der A1-ATPase ist hexagonal geformt und setzt sich aus sechs peripheren und einer zentralen Masse zusammen. 11.Die über Röntgenkleinwinkelstreuung ermittelten Dimensionen der A1-ATPase sind:Gesamtlänge =17,8 nm,Länge Kopfteil =9,4 nm,Stiellänge =8,4 nm, Stieldurchmesser =6 nm,Kopfdurchmesser (variabel,abhängig vom Substrat)= 10,06 nm,Kopfradius (variabel,abhängig vom Substrat)=5,03 nm. TPase,wohingegen sich alkoholische Lösungsmittel die ATPase-Aktivität hemmten.

LMP1 ist das Hauptonkogen des humanen DNA-Tumorvirus EBV (Epstein-Barr Virus). LMP1 ist essentiell für die Immortalisierung von B-Zellen durch das Virus. Darüber hinaus transformiert LMP1 Nagerfibroblasten in Kultur. LMP1 agiert wie ein konstitutiv aktives Rezeptormolekül in der Plasmamembran und induziert intrazelluläre Signaltransduktion durch die Bindung von Signalmolekülen der TNF-Rezeptor Familie. Die bekannten LMP1 Signalwege können die biologischen Funktionen von LMP1 jedoch nur teilweise erklären. In meiner Arbeit sollten daher neue Komponenten der LMP1 Signaltransduktion identifiziert werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit konnte TRAF6 als essentielles und spezifisches Signalmolekül für die Induktion von p38 MAPK durch LMP1 auf einem MKK6-abhängigen Signalweg identifiziert werden. In TRAF6 defizienten Maus-Fibroblasten ist eine signifikante p38 MAPK-Aktivierung durch LMP1 von der ektopischen Expression von TRAF6 abhängig. Darüber hinaus ist TRAF6 ebenfalls in der Aktivierung von NF-κB, jedoch nicht von JNK1/AP-1 durch LMP1 involviert. Das PxQxT-Motiv in CTAR1 ist zusammen mit Tyrosin 384 in CTAR2 essentiell für die Aktivierung des LMP1p38 MAPK-Signalweges. Dominant- negatives TRADD, das direkt an CTAR2 bindet, inhibiert die Induktion von p38 MAPK durch LMP1. Zusammengefaßt zeigen diese Ergebnisse zum ersten Mal eine Rolle von TRAF6 als essentielles Signalmolekül in der Signalkaskade eines transformierenden Onkogens, das unterhalb von TRADD und TRAF2 agiert. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte JNK2 als eine weitere, durch LMP1 induzierte MAPK in B-Zellen identifiziert werden. Im Zuge dieser Arbeit wurden dominant-negative Mutanten von JNK1 und JNK2 hergestellt, deren Expression eine Aktivierung von AP-1 durch LMP1 inhibieren und damit eine Rolle von JNK1 und 2 in der Induktion von AP-1 beweisen. In einem konditionalen LMP1-System in B-Zellen induzierte NGF-R:LMP1 die Degradation des p53 Proteins. Dieser Effekt ist spezifisch für p53, erfolgt innerhalb weniger Minuten und ist dominant über der p53-stabilisierenden Wirkung von UV-Strahlung. Somit konnte erstmals ein EBV-spezifischer Mechanismus aufgedeckt werden, der zu einer Deaktivierung des Tumorsuppressors p53 beitragen könnte.

Die Proteintranslokase in der mitochondrialen Außenmembran (TOM-Komplex) ist verantwortlich für die Erkennung von mitochondrialen Präproteinen und deren Translokation über die mitochondriale Außenmembran. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Klonierung und Charakterisierung von bislang nicht identifizierten Komponenten des TOM-Komplexes in Neurospora crassa sowie in der Charakterisierung der Bindung von Präproteinen an den isolierten TOM-Komplex. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: Es wurden zwei bislang unbekannte, ca. 6 bzw. 7 kDa grosse Komponenten des Neurospora crassa TOM-Komplexes, Tom6 und Tom7, identifiziert. Deren Gene wurden mittels Durchmusterung einer cDNA-Phagenbibliothek sowie einer sortierten genomischen DNA-Bibliothek identifiziert und sequenziert. Das TOM6-Gen umfasst drei Exons und zwei Introns, während das TOM7-Gen vier Exons und drei Introns enthält. Die Aminosäuresequenzen von Neurospora crassa Tom6 und Tom7 weisen eine hohe Ähnlichkeit zu denen von Tom6 und Tom7 aus anderen Organismen auf. Dabei erstreckt sich der homologe Bereich bei Tom7 über die gesamte Aminosäuresequenz, während er bei Tom6 auf den carboxyterminalen Bereich beschränkt ist. Für beide Proteine wurde jeweils eine potentielle Transmembrandomäne an ihrem Carboxyterminus vorausgesagt. Sowohl Tom6, als auch Tom7 sind integrale Bestandteile des TOM-Core-Komplexes und befinden sich in engem Kontakt zu anderen Komponenten des TOM-Komplexes. Es konnte mit Hilfe von chemischen Quervernetzungsexperimenten gezeigt werden, daß sich Tom6 und Tom7 im TOM-Komplex von Neurospora crassa in direkter räumlicher Nähe zu Tom 40 befinden. Außerdem konnte ein direkter Kontakt zwischen Tom6 und Tom22 nachgewiesen werden, welcher durch Bindung des Präproteins pSu9-DHFR moduliert wird. Ein weiterer Schwerpunkt bei der Charakterisierung von Neurospora crassa Tom6 und Tom7 bestand in der Untersuchung des Imports dieser Proteine in Mitochondrien sowie deren Assemblierung in bereits bestehende TOM-Komplexe. Sowohl Tom6, als auch Tom7 konnten in vitro in Mitochondrien importiert werden und in bereits bestehende TOM-Komplexe assemblieren. Dabei benutzen sie teilweise den generellen Importweg von Präproteinen in Mitochondrien. Der Import von Tom6 umfasst zwei nicht miteinander gekoppelte Schritte. Zunächst findet eine vom Carboxyterminus vermittelte Interaktion mit Komponenten des TOM-Komplexes statt, es folgt die Assemblierung in den TOM-Komplex. Die Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex setzt eine spezifische Interaktion des aminoterminal an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereichs mit anderen TOM-Komponenten voraus. Daneben ist eine Interaktion der Transmembrandomäne von Tom6 mit dem aminoterminal an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereich von Tom6 essentiell für die korrekte Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex. Im Gegensatz zu anderen Außenmembranproteinen kommt bei Neurospora crassa Tom6 positiv geladenen Aminosäuren im an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereich keine Bedeutung für den Import zu. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung einiger Aspekte der Bindung des mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Präproteins pSu9-DHFR an den isolierten TOM-Komplex unter Anwendung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie. Die Bindung dieses Präproteins an den TOM-Komplex ist reversibel und wird spezifisch von der Präsequenz vermittelt. Die apparenten Bindungskonstanten betragen 1,3 nM für den TOM-Holokomplex sowie 3,4 nM für den TOM-Core-Komplex. Ein wichtiges Merkmal der Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex sind elektrostatische Wechselwirkungen, da eine Erhöhung der Ionenstärke im Reaktionspuffer eine drastische Verminderung der Bindung zur Folge hatte. Des weiteren geht die Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex einher mit der Entfaltung der DHFR. Eine Verhinderung der Entfaltung der DHFR durch Komplexierung mit Methotrexat führte zu einer stark verminderten Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex.

Plasma-Kallikrein (PK) ist eine Serinprotease, die als inaktives Zymogen Plasma- Prokallikrein (PPK) in der Leber gebildet und in den Blutstrom sezerniert wird. Dort erfolgt die Konvertierung zum aktiven Enzym im Kontaktphasen-System der Blutgerinnung. Neben der Funktion im Kontakt-System spielt diese Protease sowohl in der Fibrinolyse als auch im Kallikrein-Kinin-System eine zentrale Rolle. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass PPKmRNA auch außerhalb der Leber exprimiert wird. Daraus ist zu schließen, dass dort ebenfalls PPK-Protein gebildet wird und dass diesem extrahepatischen, gewebeständigen PPK bzw. PK spezielle lokale Funktionen zukommen. Dieser Befund bildet die Grundlage dieser Dissertation. Mit dem langfristigen Ziel die physiologische und pathophysiologische Rolle des extrahepatisch gebildeten PPK aufzuklären, sollte in dieser Arbeit zunächst mittels einer quantitativen PCR-Technik (TaqMan) untersucht werden, in welchem Umfang PPK-mRNA und die mRNAs der übrigen Komponenten des Kontaktphasen-Systems in humanen Zellen bzw. Geweben exprimiert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte im zweiten Teil der Arbeit untersucht werden, ob bzw. inwieweit das PPK-Gen gewebespezifisch reguliert werden kann. Hierzu sollten die regulatorisch bedeutsamen Regionen des PPK-Gens charakterisiert werden. Mittels der TaqMan-Technologie konnte die PPK-mRNA-Expression in allen untersuchten humanen Geweben quantifiziert werden. In neun Geweben liegt die mRNA-Expression im Vergleich zur Leber zwischen 1 % und 68 % und in sechs Geweben zwischen 0,1 % und 1 %. Diese Ergebnisse sprechen für eine ubiquitäre, aber teils sehr unterschiedliche Expression der PPK-mRNA in humanen Geweben. Die mRNAs von hochmolekularem Kininogen (HK), niedermolekularem Kininogen (LK), Faktor XI (FXI) und Faktor XII (FXII) werden dagegen nur in wenigen Geweben exprimiert. Die Transkripte von HK, LK und FXI findet man außerhalb der Leber nur noch in Nierengewebe in signifikanter Menge, während FXII-mRNA nahezu ausschließlich in der Leber synthetisiert wird. Ein gemeinsames Merkmal aller Transkripte ist, dass sie in Lebergewebe am stärksten expimiert werden. Zellstimulationsversuche mit HepG2-Zellen ergaben, dass die PPK-mRNA-Synthese mittels Lipopolysacchariden (LPS) kurzfristig induziert werden kann, was für eine wesentliche Funktion von PPK bzw. PK bei Entzündungsreaktionen spricht. Im Gegensatz hierzu bewirkt Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) eine Herabregulation der PPK-Transkription. Untersuchungen zur Stabilität der mRNAs von PPK und dem Haushaltsgen GAPDH mit den Transkriptionsinhibitoren Actinomycin D, α-Amanitin und DRB zeigten, dass die mRNAAbbaurate in HepG2-Zellen vom jeweils eingesetzten Transkriptionsinhibitor abhängt. Bei allen Transkriptionsinhibitoren wurde das PPK-Transkript im Vergleich zu GAPDH deutlich schneller (Faktor 3-5) abgebaut. Dies weist darauf hin, dass die PPK-mRNA-Spiegel in den Zellen durch ständige Neusynthese aufrechterhalten werden, um eine kontinuierliche Produktion von PPK zu gewährleisten. Mittels der RLM-RACE Methode wurden in Leber-, Pankreas-, Nieren- und Testisgewebe die PPK-Transkriptionsstartpunkte (TS) identifiziert. Während in der Leber und im Pankreas nur TSs in Exon 1 des PPK-Gens benutzt werden, findet man in Nieren- und Testisgewebe TSs sowohl in der upstream-Region als auch in Intron 1. Weiterhin wurden in Nierengewebe drei am 5´-Ende verkürzte PPK-Transkripte detektiert, die aufgrund dieser Deletion keine Signalpeptid- Sequenz enthalten und dadurch eine intrazelluläre Lokalisation der entsprechenden PPK-Isoform bedingen. Die Consensussequenz-Analyse für die Transkriptionsinitiation zeigt, dass jedem experimentell ermittelten Transkriptionsstart eine TATA-Box oder/und ein Initiator-Element assoziiert ist. Außerdem konnte durch die RLM-RACE-Analysen die Existenz eines weiteren untranslatierten Exons im 5´-Bereich des PPK-Gens ausgeschlossen werden. Unter Anwendung der Genome Walker Technik wurde die Promotorregion (P-1729) stromaufwärts von Exon 1 kloniert und mittels Reportergen-Studien analysiert. In HepG2-Zellen zeigt dieses Gensegment eindeutig transkriptionsaktivierende Kapazität. Durch die Generierung von neun Verkürzungsvarianten konnten der Core-Promotor (-158 bis +22), Enhancerbereiche (-1675 bis -1494) und Silencerregionen (-1304 bis -674) charakterisiert werden. Die Transkriptionsfaktoren-Analyse ergab, dass bei der Regulation durch die P-1729 Region neben ubiquitär exprimierten auch streng gewebespezifische Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle spielen. Reportergen-Untersuchungen des Intron-1-Bereichs in HEK 293-Zellen zeigten, dass auch diese Region des PPK-Gens transkriptionsaktivierende Kapazität besitzt. Ebenso zeigt aber auch der P-1729 Bereich in HEK 293-Zellen Promotoraktivität. Somit können innerhalb eines Zelltyps beide Promotorbereiche funktionell aktiv sein, wodurch eine alternative Regulation der PPK-Transkription ermöglicht wird.