Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv

Chloroplast gene expression is predominantly regulated at the posttranscriptional levels of mRNA stability and translation efficiency. The expression of psbA, an important photosynthesis-related chloroplast gene, has been revealed to be regulated via its 5’- untranslated region (UTR). Some cis-acting elements within this 5’UTR and the correlated trans-acting factors have been defined in Chlamydomonas. However, no in vivo evidence with respect to the cis-acting elements of the psbA 5’UTR has been so far achieved in higher plants such as tobacco. To attempt this, we generated a series of mutants of the tobacco psbA 5’UTR by base alterations and sequence deletions, with special regard to the stem-loop structure and the putative target sites for ribosome association and binding of nuclear regulatory factors. In addition, a versatile plastid transformation vector pKCZ with an insertion site in the inverted repeat region of the plastid genome was constructed. In all constructs, the psbA 5’UTR (Wt or modified) was used as the 5’ leader of the reporter gene uidA under control of the same promoter, Prrn, the promoter of the rRNA operon. Through biolistic DNA delivery to tobacco chloroplasts, transplastomic plants were obtained. DNA and RNA analyses of these transplastomic plants demonstrated that the transgenes aadA and uidA had been correctly integrated into the plastome at the insertion site, and transcribed in discrete sizes. Quantitative assays were also done to determine the proportion of intact transplastome, the uidA mRNA level, Gus activity, and uidA translation efficiency. The main results are the following: 1) The insertion site at the unique MunI between two tRNA genes (trnR-ACG and trnNGUU) is functional. Vector pKCZ has a large flexibility for further DNA manipulations and hence is useful for future applications. 2) The stem-loop of the psbA 5’UTR is required for mRNA stabilisation and translation. All mutants related to this region showed a 2~3 fold decrease in mRNA stability and a 1.5~6 fold reduction in translation efficiency. The function of this stem-loop depends on its correct sequence and secondary conformation. 3) the AU-box of the psbA 5’UTR is a crucial translation determinant. Mutations of this element almost abolished translation efficacy (up to 175-fold decrease), but did not significantly affect mRNA accumulation. The regulatory role of the AU-Box is sequencedependent and might be affected by its inner secondary structure. 4) The internal AUG codon of the psbA 5’UTR is unable to initiate translation. An introduction of mRNA translatability from this codon failed to direct the translation of reporter uidA gene, overriding the mutation of the AU-Box. 5) The 5’end poly(A) sequence does not confer a distinct regulatory signal. The deletion of this element only insignificantly affected mRNA abundance and translation. However, this mutation might slightly disturb the conformation of the stem-loop, resulting in a moderate decrease in translation efficiency (~1.5 fold). 6) The SD(Shine-Dalgarno)-like RBS (ribosome binding site) of the psbA 5’UTR appears to be an indispensable element for translation initiation. Mutation of this element led to a dramatically low expression of the uidA gene as seen by Gus staining. 7) The 5’end structural sequence of the rbcL 5’UTR does not convey a high mRNA stabilising effect to the psbA 5’UTR in a cycling condition of the light and the dark. Their distinct roles appear to be involved in darkness adaptation. Furthermore, with respect to the overall regulatory function of the psbA 5’UTR, two models are proposed, i.e. dual RBS-mediated translation initiation, and cpRBPs-mediated mRNA stability and translation. The mechanisms for mRNA stabilisation entailed by the rbcL 5’UTR are also discussed. Direct repeat-mediated transgene loss after chloroplast transformation and other aspects related to the choice of insertion site and plastid promoter are also analysed.

1. Im Rahmen dieser Arbeit wurden transgene und nicht-transgene Rapspflanzen auf ihre biochemischen Unterschiede untersucht. Weiterhin wurde das Abbauverhalten des künstlich eingefügten Gens im Vergleich zu zwei endogenen Kontrollgenen im Verlauf der Seneszenz, im verrottenden Pflanzenmaterial und im Boden überprüft. Verschiedene Mikroorganismen wurden einem Selektionsdruck durch BASTA ausgesetzt und unter diesen Bedingungen auf entstehende Resistenzen gegenüber dem Herbizid getestet. 2. Bei der Untersuchung der verschiedenen Seneszenzparametern ergaben sich für das Chlorophyll zwischen den transgenen und den nicht-transgenen Rapspflanzen keine Unterschiede. Die Bestimmungen von ACC und MACC sowie der Flavonoide hatten sich als nicht seneszenzrelevant für Brassica napus erwiesen. Bei der Analytik des Gesamtproteingehalts und der verschiedenen Aminosäuren zeigten die transgenen und nicht-transgenen Blätter ebenfalls analoges Verhalten. 3. Bei der Durchführung der quantitativen PCR wurden das rbcS-, das cab- und das pat- Gen über die gesamte Vegetationsperiode detektiert. Dabei war das pat-Gen immer in geringerer Menge nachgewiesen worden als die beiden Photosynthesegene. Der höchste Gehalt an den hier betrachteten Genen befand sich in den Stengeln. Auch im Rahmen dieser Untersuchungen zeigten die transgenen Pflanzen in ihrem Abbauverhalten keinen Unterschied zu den nicht-transgenen Pflanzen. Da das Fremdgen über gesamte Zeitdauer intakt vorlag, wäre theoretisch ein horizontaler Gentransfer möglich gewesen. Die Untersuchung des pat-Transkripts reflektierte ebenfalls den Abbau mit fortschreitender Seneszenz. Auch hier war die Detektion bis zum Ende der Vegetationsperiode möglich. Bei der Durchführung der Hybridisierung wurden für die Glutaminsynthetase zwei Transkripte detektiert. Beide Transkripte der Isoformen wurden im Verlauf der Seneszenz verstärkt exprimiert. Zusammenfassend zeigten die transgenen und die nicht-transgenen Blätter auch bei diesen Untersuchungen analoges Verhalten. 4. Das pat-Konstrukt konnte im Boden parallel zu den endogenen Pflanzengenen bis zu vier Wochen nach dem Unterpflügen der Rapspflanzen gegen Ende der Vegetationsperiode nachgewiesen werden. In den kompostierten Maispflanzen liess sich die kodierende Sequenz von 606 bp über einen Zeitraum von 23 Monaten detektieren. Während dieser Zeit stand es für einen horizontalen Gentransfer intakt zur Verfügung. Bei den Untersuchungen, unter Ausübung eines Selektionsdrucks auf verschiedene Agrobakterien-Stämme, Bacillus subtilis und Pseudomonas fluorescens, wurden keine spontanen Resistenzen erzielt. Auch konnte das 35S-pat- Gen-Konstrukt nicht erfolgreich in die Mikroorganismen transformiert werden. Aufgrund der im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse ist ein horizontaler Gentransfer als eher unwahrscheinlich einzustufen, kann aber vor allem in Anwesenheit eines Selektionsdrucks nicht ausgeschlossen werden.

The SIRPs are a recently discovered family of glycoproteins comprising more than 30 members belonging to the immunoglobulin superfamily. The two different structural subtypes, termed SIRP α and SIRP β, are distinguished by the presence or absence of a cytoplasmic domain, respectively. SIRP α1, the first member of the family to be purified, had been characterised as a negative regulator of signal transduction, and transformation assays had suggested that it also had tumour suppressive effects. Little or nothing is known about the possible function of either the other SIRP α homologues or the members of the SIRP β subtype. The Ig-like domains possessed in the extracellular domains of all SIRPs suggest they have binding partners outside the cell. Cell adhesion experiments using the extracellular domains of SIRP family members showed that SIRP α have adhesion molecule properties. This led to the identification of CD47 as one ligand for SIRP α, performed in collaboration with others21and confirmed here. Furthermore, these experiments suggested that SIRP α molecules have at least one further unknown ligand that is not CD47. The discovery that SIRP α was a cell adhesion molecule with a regulatory role in signal transduction was expanded by in vitro kinase experiments and experiments with inhibitors of tyrosine kinases. They showed that SIRP α associated with more than one kinase activity, and that cytosolic tyrosine kinases, probably of the srcfamily, were necessary for SIRP α to regulate tyrosine phosphorylation of a receptor. In contrast to SIRP α molecules, proteins belonging to the SIRP β subtype remain uncharacterised. Therefore a large part of this work concentrates on the SIRP β subtype, its associated proteins, localisation and possible function in a cell. In vitro association experiments revealed that SIRP β is part of a multiprotein complex at the cell membrane, where SIRP β1 interacted with DAP12, an adaptor protein with a transmembrane domain. DAP12 linked SIRP β to a cytosolic tyrosine kinase identified as Syk confirmed by western blot and PCR from cDNA preparations of the cell lines used in these experiments. The interaction of Syk with the complex required the tyrosine phosphorylation of DAP12. Coligating SIRP β molecules at the membrane with a SIRP β-specific monoclonal antibody recruited Syk to DAP12 where it could be activated by treatment with sodium pervanadate. In vitro kinase assays detected several unknown phosphorylated proteins associated with SIRP β/DAP12/Syk when Syk was activated that may represent signalling molecules operating downstream of the complex. Cotransfection experiments showed that SIRP α complexed with kinase activities that enabled it to inhibit both DAP12 tyrosine phosphorylation and Syk kinase activity. This suggested that both complexes at some point operated in close contact, so experiments were carried out to localise SIRP proteins in the cell. Fractionation experiments discovered that SIRP α and possibly SIRP β could be detected in fractions that contained GPI microdomains, or caveolae. Similar investigations with the SIRP β1/DAP12 complex revealed that DAP12 was dependent upon SIRP β for its direction to the plasma membrane where it was activated by tyrosine kinases. Membrane localisation of SIRP β was similarly reliant upon DAP12 expression, however, further experiments suggested that SIRP β may be secreted from the cell in the absence of DAP12. To address the potential role of SIRP β1/DAP12 complex in signal transduction, cell lines overexpressing SIRP β and DAP12 were analysed. Cell death assays suggested that the SIRP β1/DAP12 complex was a negative regulator of induced cell death, and that tyrosine kinases might be involved in this regulation. Cells overexpressing SIRP β and DAP12 showed an enhanced rate of acid production, corresponding to an enhanced rate of glucose metabolism. These observations suggests that, SIRP β1/DAP12 overexpression may be a factor that contributing to a transformed phenotype, works in opposition to SIRP α molecules. This work views the SIRPs as components of a cluster of different proteins at the cell membrane that recruit and use other cytosolic proteins, among them tyrosine kinases and phosphatases. It shows that SIRP α molecules may collaborate with SIRP β family members to modulate the signals generated by other receptors in signal transduction. This modulation may influence aberrant cellular processes that lead to disease.

Die an der Synthese von acylierten Flavonolglykosiden, den UV-B-Schutzpigmenten in der Kiefer und anderen Bäumen, beteiligten Hydroxycinnamoyl-Transferasen sind weitgehend unerforscht. Dies verwundert um so mehr, als Kenntnisse über den UV-B-Schutz bei Bäumen, die von großer ökologischer und ökonomischer Bedeutung sind, unter dem Eindruck sinkender stratosphärischer Ozonwerte und der damit prognostizierten erhöhten UV-B-Belastung auch in mittleren Breiten sehr wichtig geworden sind. Andererseits haben Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die an der Synthese von Blütenfarbstoffen (acylierte Anthocyane) und Phytoalexinen (acylierte Amine) beteiligt sind, in den letzten Jahren einige Fortschritte erbracht. In der vorliegenden Arbeit wird versucht, mit proteinbiochemischen und ökophysiologischen Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die Flavonolglykoside acylieren, hier eine Lücke zu schließen. Die Untersuchungen zu den Hydroxycinnamoyl-Transferasen lassen sich in drei Teile gliedern: (i) einen methodischen Teil, in dem mit der Entwicklung eines Enzymtests die Grundlagen für die beiden folgenden Teile erarbeitet wurden; (ii) ein physiologisch-ökologischer Teil, in dem Messungen von Enzymaktivitäten und Inhaltsstoffgehalten in Nadeln adulter Bäume im Freiland und von Keimlingen unter kontrollierten Bedingungen in Sonnensimulatoren vorgenommen wurden; (iii) ein proteinbiochemischer Teil, der eine Charakterisierung der Enyzme und die Reinigung der 3’’-HCT beinhaltet. (i) Für den Nachweis und die Quantifizierung der Aktivität der Hydroxycinnamyoltransferasen in Extrakten von Kiefernnadeln wurde ein Enzymtest entwickelt. Dafür wurde die Aufschlusstechnik und die HPLC-Methode, mit der die Enzymprodukte analysiert wurden, optimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass in der Kiefer drei verschiedene für die Glucose der Flavonolglykoside positionsspezifische Transferasen vorhanden sind. Von den Produkten dieser Enzyme konnten die Acylierungspositionen aufgeklärt werden, wobei sich herausstellte, dass die 3’’- und der 6’’-HCT an der Synthese der UV-B-Schutzpigmente beteiligt sind, während die Produkte der 4’’-HCT in der Kiefer noch nicht bekannt sind. (ii) In Sonnensimulatorexperimenten mit Kiefernkeimlingen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der 6’’-HCT durch UV-B induziert wurde, während die Aktivität der 3’’-HCT konstitutiv vorlag und durch UV-B nicht beeinflusst wurde. In den Freilandbäumen zeigte sich, dass die 6’’-HCT entwicklungspezifisch aktiv war, während die Aktivität der 3’’-HCT auch hier konstitutiv vorlag. Die Akkumulation der diacylierten Flavonol 3-glykoside konnte nur zu Beginn der Nadelentwicklung beobachtet werden und korrelierte mit der Aktivität der 6’’- HCT, woraus geschlossen werden kann, dass die 6’’-HCT die Synthese der UV-B-Schutzpigmente reguliert, während die Rolle der 3’’-HCT unklar bleibt, da keine Akkumulation von monoacylierten Flavonolglykosiden beobachtet wurde. Die schnelle Akkumulation und nachfolgende Abnahme der diacylierten Verbindungen zeigen, dass diese Verbindungen für den UV-B-Schutz in den besonders gefährdeten jungen Nadeln verantwortlich sind. In älteren Nadeln sind andere langfristige Schutzmechanismen vorhanden, wobei vor allem zellwandgebundene Flavonoide und Hydroxyzimtsäuren in Frage kommen, da diese langsamer akkumulieren als die löslichen diacylierten Verbindungen. Der Vergleich der Keimlingsexperimente mit den Freilanduntersuchungen zeigt, dass die Primärnadeln der Keimlinge ein gutes Modell für sich entwickelnde Nadeln von adulten Freilandbäumen darstellen, da sie sich physiologisch vergleichbar verhalten. Die Keimlinge besitzen einige Vorteile gegenüber mehrjährigen Bäumen, da sie jederzeit verfügbar und in größerer Individuenzahl untersucht werden können. (iii) Mit teilweise gereinigten Enzymen konnte gezeigt werden, dass die Acylierung der Flavonolglykoside in einer festen Reihenfolge abläuft. Die Synthese der UV-B-Schutzpigmente erfolgt durch die Acylierung zuerst an 6’’-Position und dann an 3’’-Position. Für die 3’’- und die 4’’-HCT wurde ein apparentes Molekulargewicht von 45 bzw. 35 kDa und ein pI-Wert von 4.7 ermittelt. Diese Werte liegen in einem Bereich, der ebenso für HCT’s aus verschiedenen Pflanzen, die andere Substrate acylieren, festgestellt wurde. Für die 6’’- HCT wurde dagegen ein außerordentlich geringes apparentes Molekulargewicht von 9 kDa und ein relativ hoher pI-Wert von 7.7 bis 7.9 ermittelt. Weitere Untersuchungen sind nötig, um festzustellen, ob es sich dabei um eine proteolytische Spaltung des Enzyms handelt. Alle drei Transferasen zeigten gegenüber dem Akzeptorsubstrat eine hohe Spezifität für das Flavonolaglykon, wobei die Aktivität der 6’’-HCT bei größerer Polarität an 3’-Position (Quercetin) höher war, die der 3’’-HCT bei geringerer Polarität an dieser Position (Kämpferol und Isorhamnetin). Ähnlich hoch ist auch die Spezifität gegenüber dem Zuckerrest des Akzeptorsubstrats. Die höchste Aktivität wurde mit dem Glukosid festgestellt, das bisher auch nur in der Kiefer nachgewiesen wurde. Die Spezifität gegenüber dem Donorsubstrat zeigt zum einen eine Abhängigkeit von CoAEster, da keine Aktivität mit Glukose-Estern gemessen werden konnte. Zum anderen ist der aromatische Charakter des Donorsubstrats von entscheidender Bedeutung, da sowohl die CoA-Ester verschiedener Hydroxyzimtsäuren als auch Benzoyl-CoA als Substrate verwendet werden. Aliphatische CoA-Ester wie Acetyl- oder Malonyl-CoA werden von den HCT’s nicht als Substrate akzeptiert. Mit einer analytischen Reinigung der 3’’-HCT, die säulenchromatographische Schritte beinhaltete, wurden in sechs Schritten zwei Protein-Banden mit einer Größe von 24 und 28 kDa isoliert, die mit der Enzymaktivität korrelierten. Mit einer präparativen Reinigung mit nativer Elektrophorese konnten diese beiden Banden in ausreichender Menge erhalten werden, sodass eine Sequenzierung von Peptiden möglich war. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen mit den in Datenbanken vorhandenen Sequenzen zeigte, dass es sich um zwei unbekannte Peptide handelt. Die Resultate der Reinigung bilden die Grundlage für molekularbiologische Arbeiten, mit denen es möglich sein sollte, enzymspezifische Klone für die 3’’-HCT und, falls die Enzyme auf Sequenzebene verwandt sind, auch für die 6’’-HCT herzustellen. Damit könnte zum ersten Mal die Sequenz einer Flavonol 3-glukosid-Hydroxycinnamoyl-Transferase aufgeklärt werden. Mit Hilfe von molekularen Sonden ließen sich die vermutete epidermale Lokalisierung der Enzyme überprüfen und UV-B-Induktionskinetiken auf Ebene der mRNA durchführen. Dabei wären vor allem Experimente mit UV-B-Intensitäten sinnvoll, mit denen die obere Grenze der Anpassungsfähigkeit der Kiefer definiert werden kann.

A large number of actin-binding proteins regulates the dynamics of the actin cytoskeleton. Here we report the identification and characterization of two new proteins in Dictyostelium discoideum: the novel cytoskeleton protein villidin and a third profilin isoform. One goal of the project was to analyze the features of the villidin sequence in detail and to investigate the protein by molecular, biochemical and cell biological approaches. Villidin has a calculated molecular mass of 190,000 Da. Based on the domain structure of the protein, villidin can be assigned to the gelsolin/villin-family as well as to the WD-repeat family. In principal, the group of the WD-repeat proteins includes regulatory proteins which are involved in signal transduction and other important cellular processes. The N-terminus of villidin harbours between four and eight of the specific WD-repeats and forms probably a β-propeller structure. The WD-domain is followed by an intervening domain of 400 amino acids that leads to the second characteristic villidin domain at the C-terminus. This part of the sequence exhibits a similarity to villin, though the first of the six villin domains is absent in villidin. However the typical headpiece is present. Villidin mRNA and protein are expressed in low amounts during growth and early aggregation, they are increased during development and reach highest levels at the tipped aggregate stage. The protein is present in the cytosol as well as in the cytoskeletal and the membrane fraction. These biochemical results are in agreement with the immunofluorescence data. The endogenous villidin is homogeneously distributed throughout the cytosol and localizes at vesicular structures. Colocalization experiments lead to the assumption that these structures might belong to a still unknown population of vesicles. GFP fusion proteins with the villin homology domains show a similar distribution, whereas GFP fusions of the N-terminal part encompassing the WD-repeats are present in F-actin rich regions at the plasma membrane and on internal membranes during motility, pinocytosis and phagocytosis. Mutants lacking villidin do not show an aberrant phenotype during growth and development but are defective in motility and phototaxis in the multicellular slug stage. Based on this defect and the multidomain structure of the protein, villidin might be involved in signal transduction processes leading to phototactic movement. The second part of the project dealt with a new gene which codes for a third profilin isoform in D. discoideum. The well-known Dictyostelium profilin isoforms I and II are able to interact with G-actin, PIP2 and poly-L-prolin. As in the case of profilin I and II, profilin III is encoded by a single gene. In contrast to profilin I and II, the transcription of profilin III is not developmentally regulated. All three isoforms show the typical limited homology at the amino acid level. The recombinant Profilin III protein cosediments with poly-L-prolin, inhibits the actin-polymerisation and the PIP2 interaction of profilin III competes with the G-actin affinity. The low expression of Profilin III mRNA in growing and developing cells suggests a distinct role of profilin III because a low protein concentration argues against an actin sequestering function.

Die Biogenese von Mitochondrien erfordert den Eintransport cytosolisch synthetisierter Vorstufenproteine über die mitochondriale Außenmembran. Der TOM-Komplex in der Außenmembran erkennt die in die Mitochondrien zu importierenden Vorstufenproteine, bindet sie, ermöglicht den Transfer von zumindest Teilen davon über die mitochondriale Außenmembran und die Integration von Membranproteinen in die Außenmembran. Auf der Grundlage bestehender Untersuchungen des TOM-Holo-Komplexes wurden in dieser Arbeit verschiedene Subkomplexe des TOM-Komplexes aus Neurospora crassa isoliert, biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zudem wurde eine neue Komponente des TOM-Komplexes identifiziert: Tom5, eine kleine Komponente von etwa 5 kDa mit Sequenzhomologie zu Tom5 von Saccharomces cerevisiae. Der in dieser Arbeit isolierte TOM-Core-Komplex besteht aus den Protein-untereinheiten Tom40, Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5; gegenüber dem TOM-Holo-Komplex fehlen ihm die Rezeptorkomponenten Tom70 und Tom20. Der TOM-Core-Komplex weist eine Molekülmasse von ca. 400 kDa und eine Stöchimetrie der Komponenten Tom40 : Tom22 : Tom7 : Tom6 von 8 : 4 : 2 : 1-2 auf. Er kann in vitro präsequenzabhängig bis zu 8 Vorstufen-proteine pro Komplex binden. Elektronenmikroskopische Bilder des TOM-Core- Komplexes zeigen eine symmetrische Doppelringstruktur mit zwei durchgehenden Poren von etwa 2,1 nm Durchmesser. Der TOM-Core-Komplex bildet in Übereinstimmung damit Kanäle mit zwei Leitfähigkeits-niveaus, die zwei Poren entsprechen. Die Bevorzugung von Kationen und die Eigenschaft, durch mitochondriale, positiv geladene Präpeptide selektiv und spezifisch inhibiert zu werden, belegen die Rolle des TOM-Core-Komplexes bei der Proteintranslokation. TOM-Core-Komplex, dessen hydrophile Domänen von Tom22 und den kleinen Toms durch limitierte Proteolyse weitgehend abgedaut wurden, zeigte in den durchgeführten Untersuchungen nahezu identische Binde-, Kanal- und Struktureigenschaften wie der unbehandelte Core-Komplex. Die Grundstruktur der Proteintranslokase der mitochondrialen Außenmembran Zusammenfassung - 132 - kann somit hinreichend durch Tom40 und die membrandurchspannenden Domänen von Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5 stabil gebildet werden. Weiterführende Experimente mit isoliertem Tom40 bestätigten dies. So bildet isoliertes Tom40 oligomere Strukturen mit einer mittleren Molekülmasse von ca. 350 kDa. Tom40 zeigte sich in Transmissions-EM-Bildern überwiegend als Einlochpartikel. In Übereinstimmung hiermit weisen die vom Tom40- Komplex gebildeten Kanäle eine Leitfähigkeit von nur der Hälfte der Leitfähigkeit des TOM-Core-Komplexes mit zwei Poren auf. Ein kleiner Teil des isolierten Tom40 bildet Zweilochpartikel. Tom40 ist also in der Lage, die Grundstruktur des TOM-Komplexes zu bilden, wie sie für den TOM-Core-Komplex gefunden wurde. Infrarot- und Circulardichroismus-Spektren von isoliertem Tom40 führen zu dem Schluß, daß ein einzelnes Tom40-Protomer keinen Kanal mit β -Barrel-Struktur bilden kann, sondern daß dazu mehrere Tom40 zusammenwirken müssen.

In the current study tissue cultures of rapeseed (cv. “Drakkar”, cv. “Westar”) and sugarbeet (cv. ”Viktoria”, cv. “VRB”, cv. ”31-188”, cv. ”7T1308” and 47 other breeding lines, Appendix 1) have been investigated for the establishment of conditions that make possible plastid transformation in both species. Tobacco leaf protoplasts (cv. ”petite Havana”, cv. ”Wisconsin 38”) were used to develop a novel technique – the TAL (thin-alginate-layers) technique. The TAL technique in combination with new culture media resulted in very rapid protoplast development and fast shoot regeneration (in less than two weeks). This method was also successfully applied to improve protoplast culture of rapeseed and of the extremely recalcitrant species sugarbeet. Factors, which included protoplast source, mineral and organic composition of isolation and culture media, influence of growth regulators etc. were investigated and conditions for protoplast culture and regeneration were established for both species. According to reports in the literature, only protoplasts from guard cells could be regenerated into plants. Thus, an alternative and reproducible method of shoot regeneration from protoplasts isolated from hypocotyl derived callus was successfully developed. While no shoot regeneration was observed from guard cell protoplasts in our experiments, plant regeneration (efficiencies up to 30%) from callus protoplasts could be achieved for the first time in this study. The influence of different parameters on the efficiency of callus formation from etiolated hypocotyl explants was investigated. Protoplasts from callus and hypocotyl derived callus were used for the experiments on nuclear transformation in sugarbeet. Both, the PEG method and the biolistic method were successfully applied to obtain nuclear transformants as confirmed by molecular methods (PCR analysis and Southern blot hybridisation). The biolistic method was applied for plastid transformation experiments in sugarbeet. Species specific vectors containing the aadA cassette were constructed for plastid transformation in rapeseed and sugarbeet. However, difficulties to select plastid transformants were observed due to a high natural resistance to spectinomycin and streptomycin in rapeseed. In sugarbeet spectinomycin at a concentration of 100 mg/l was found efficient for selection and spectinomycin and streptomycin resistant colonies were obtained after callus bombardment. The presence of the aadA gene in antibiotic-resistant lines was proven by PCR analysis, but an integration of DNA into the plastome could not be verified so far. Efficient regeneration systems and methods of DNA transfer were established for rapeseed and sugarbeet and straightened the way for successful plastid transformation in either species.

A. A fundamental property of hearing is the decomposition of complex sounds into perceptually distinct frequency components. Each receptor cell in the cochlea and most centrally located neurons respond only to a limited range of frequencies. The individual frequency channels are spatially organized on the cortical surface. This consistent topographical pattern provides a framework for the investigation of other functional organization principles, e.g., the functional properties of neurons in the six cortical layers and the responsiveness of neurons to complex sounds. The frequency specific features of inhibition should play an important role in shaping a neuron’s response to complex behaviorally relevant stimuli. Physiological and immunocytochemical evidence indicates a layer-dependent organization of inhibitory circuits in the neocortex. To investigate the contribution of GABAergic inhibition to frequency tuning in the different cortical layers, single and multi units were recorded in near-radial penetrations before and during iontophoretic application of the GABAA-receptor antagonist bicuculline in the auditory cortex of the lightly anaesthetized gerbil (Meriones unguiculatus). Bicuculline generally increased the spontaneous neuronal activity and enhanced and prolonged onset responses to sound. Application of bicuculline often resulted in a shift of the most sensitive frequency of the neurons’ receptive fields and a decrease of threshold (5.5 dB). A broadening of the frequency tuning evident by lower Q40dB values was observed in 63% of the units. In units with several peaks in their tuning curve or clearly separated response areas, bicuculline application removed inhibitory gaps in the receptive fields and created single-peaked tuning curves. The influence of bicuculline on the receptive field size was not significantly layer-specific but tended to be most pronounced in layers V and VI. In layer VI, "silent" neurons were frequently found that responded to sound only when GABAergic inhibition was antagonized. From the analysis of postembedding GABA immunocytochemistry, the proportion of GABAergic neurons was found to be maximal in layers I and V, and the number of GABAergic perisomatic puncta (axon terminals) on cell somata peaked in layer V. The influence of bicuculline was compared with the effects of two-tone suppression. It was found that in some units, the effects of suppression could be partially mediated by intracortical GABAergic inhibition. In some units in layers IV, V, and VI, additionally to the initial excitatory activity in response to stimulus onset, a second, long-lasting excitatory response occurred several hundred milliseconds after the stimulus. This late response was not dependent on stimulus duration and could be enhanced or elicited by GABAA blockade. The fact that several, rhythmically occurring late responses were elicited by the application of bicuculline suggests that recurrent excitatory networks can become entrained by small modifications of inhibition. B. In the natural environment, acoustic signals like animals’ communication sound or human speech is often masked by background noise. Amplitude fluctuations are often superimposed upon environmental sounds on their path of transmission which can lead to a distinct temporal structure of the sound. Furthermore, many natural background sounds are often temporally structured. Vertebrates have evolved mechanisms to exploit amplitude modulations in background noise to improve signal detection. Psychophysical and behavioral experiments have shown that amplitude-modulated background noise (comodulated noise) is less effective as a masker than unmodulated noise bands of the same bandwidth, a phenomenon called comodulation masking release (CMR). This phenomenon has been extensively studied in human psychoacoustics. However, the underlying neural mechanisms are still debated. Animal models in which a direct comparison of the neuronal response and the behaviorally measured performance is possible could increase our understanding of the underlying mechanisms. CMR could be demonstrated behaviorally and neurophysiologically in a songbird, however, models for mammals are still lacking. In behavioral experiments, Kittel et al. (2000) demonstrated CMR in the gerbil. In the present study, using acoustic stimuli that were identical with those of a behavioral experiment, a neural correlate of CMR was described in the auditory cortex of the gerbil and compared with the behavioral data. In this study of neural mechanisms of masking release in the primary auditory cortex of the anaesthetized gerbil, I determined neural detection thresholds for 200-ms test tones presented in a background of band-pass amplitude modulated (50 Hz) noise maskers of different bandwidth (between 50 and 3200 Hz). Neural release from masking caused by comodulated band-pass noise was evident at the level of the gerbil’s primary auditory cortex. On average, the largest masking release (median 6.9 dB) was found for a masker bandwidth of 3200 Hz. This is less than the median masking release of 15.7 dB observed in the behavioral study in the gerbil. For most masker bandwidths, however, a small fraction of the neurons exhibited a masking release that was close to or even larger than the behavioral masking release. The observation that the release from masking increased as a function of the masker bandwidth indicates that spectral components remote from the signal frequency enhance the signal detection. However, there was no correlation between the neurons’ filter bandwidths and the amount of masking release. Thus, neuronal masking release in the gerbil primary auditory cortex could be attributed to both signalmasker interactions across different frequency channels and also to mechanisms that act within a single frequency channel. The gerbil appears to be a suitable animal model for additional studies comparing behavioral and physiological performance in the same species. These studies could increase our understanding of the perceptual mechanisms that are useful for the analysis of auditory scenes.

In vitro-Experimente wurden am isolierten Hirnstamm von Fröschen durchgeführt. Die einzelnen Nervenäste der Bogengänge und der Lagena wurden auf jeder Seite des Gehirns getrennt elektrisch stimuliert. Afferente und kommissurale Antworten wurden intrazellulär in vestibulären Neuronen zweiter Ordnung (2°VN) gemessen. Das Projektionsmuster eines Teils dieser 2°VN wurde durch antidrome Stimulation der okulomotorischen Kerne und des zervikalen Rückenmarks bestimmt. Bei der Hälfte aller identifizierten 2°VN konnte ein monosynaptisches EPSP nach Stimulation des ipsilateralen Lagena-Nerven registriert werden. Etwa ein Viertel dieser Neurone erhielt einen monosynaptischen Eingang ausschließlich von der Lagena, die anderen drei Viertel der Neurone erhielten zusätzlich noch ein monosynaptisches EPSP von einem oder mehreren ipsilateralen Bogengängen. In den Neuronen mit einem konvergenten monosynaptischen Eingang von der Lagena und einem der drei Bogengänge stammte der Bogengangs-Eingang entweder vom anterioren vertikalen oder vom posterioren vertikalen Bogengang, aber nie vom horizontalen Bogengang. Kommissurale Eingänge nach Stimulation des kontralateralen Lagena-Nerven waren erregender Natur und wurden in vertikalen Bogengangs-Neuronen und in Lagena-Neuronen, nicht aber in horizontalen Bogengangs-Neuronen angetroffen. Diese bemerkenswerte Spezifität der monosynaptischen Konvergenz für Lagena- und vertikale Bogengangsinformationen stimmt mit der Koaktivierung der entsprechenden vestibulären Sinnesorgane bei natürlichen Bewegungen überein. Die andere Hälfte der registrierten 2°VN erhielt ein monosynaptisches EPSP ausschließlich nach Stimulation der ipsilateralen Bogengangs-Nerven. Die Mehrheit (91%) dieser 2°Bogengangs-Neurone erhielt einen monosynaptischen Eingang von nur einem der drei ipsilateralen Bogengänge, der Rest entweder von zwei (8%) oder von allen drei Bogengängen (1%). Die meisten 2°Bogengangs-Neurone (79%) mit einem monosynaptischen Eingang von nur einem Bogengang erhielten eine kommissurale Hemmung vom kontralateralen Bogengang der gleichen Drehebene (koplanar) und eine kommissurale Erregung von einem oder zwei der anderen beiden kontralateralen nicht-koplanaren Bogengänge. Die koplanaren hemmenden Signale wiesen disynaptische (78%) oder trisynaptische Latenzen auf. Im ersten Fall wurde die Hemmung direkt, also ohne weitere Verschaltung von einem 2°Bogengangs- Neuron im gegenüberliegenden vestibulären Kern vermittelt. Im zweiten Fall war ein zusätzliches Interneuron dazwischen geschaltet. Erregende kommissurale Eingänge nach Stimulation des gesamten VIII. Hirnnerven sind auf erregende Signale der kontralateralen nicht-koplanaren Bogengänge und einer daraus resultierenden Maskierung der kommissuralen bogengangs-spezifischen Hemmung zurückzuführen. Somit sind auch beim Frosch die funktionellen Strukturen vorhanden, die als neuronale Grundlage für eine „push-pull- Organisation“ bei Kopfbewegungen bei der Katze dienen. Axone von 2°Bogengangs-Neuronen projizierten absteigend zum Rückenmark, aufsteigend zu den okulomotorischen Kernen oder über Axonkollaterale ab- und aufsteigend. Axone von 2°Lagena-Neuronen projizierten ausnahmslos zum Rückenmark, nicht aber zu den okulomotorischen Kernen. Diese elektophysiologischen Untersuchungsergebnisse sind kompatibel mit in vivo-Studien, die zeigen dass Informationen über vertikale Linearbeschleunigung bei Vertebraten praktisch keine Bedeutung für den makulo-okulären Reflex haben.

Programmierter Zelltod oder Apoptose ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Störungen in der Regulierung dieser Prozesse können zu zahlreichen Erkrankungen führen, unter anderem zu Autoimmunerkrankungen und Krebs. In den letzten Jahren konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden, daß Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Apoptoseprozesse spielen. So wird Cytochrom c, ein Protein aus dem mitochondrialen Intermembranraum, durch einen pro-apoptotischen Stimulus als ein Caspase-Aktivierungsfaktor ins Cytosol freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird die initiale Charakterisierung eines neuen murinen Proteins (mDAP-3) beschrieben. mDAP-3 wurde identifiziert bei dem Versuch molekulare Marker der Nierenentwicklung mit Hilfe einer modifizierten „differential display“ Polymerase Kettenreaktion zu finden. Die 1,7 kb große mDAP-3 mRNA kodiert für ein ca. 45 kDa großes Protein, das als funktionelles Motiv eine ATP/GTP-Bindungsstelle (P-Loop) besitzt. Die Analyse der Aminosäurensequenz von mDAP-3 ergab eine 81 %ige Identität zu dem humanen DAP-3 (Death Associated Protein 3), einem positiven Apoptose Mediator. Northern-Blot-Analyse von 20 µg Gesamt-RNA aus 11 Organen adulter Mäuse zeigte eine abundante mDAP-3 Expression in Niere, Herz, Leber, Thymus, Muskel, Milz, Darm und Bauch, mit einem Expressionsmaximum in Testis. Eine geringe bis fast fehlende Expression konnte in der Lunge und im Ovar gezeigt werden. Die Überexpression eines mDAP-3/EGFP Fusionproteins in murinen Mesangialzellen (MMC) führte zu einer Apoptoseinduktion bei 27,6% ± 2,6% (n=3) der Zellen gegenüber einer Apoptose Inzidenz von 11,9% ± 2,8% bei MMCs die mit einem Kontrollvektor transfiziert wurden. Die pro-apoptotische Funktion von mDAP-3 ist dabei abhängig von der Funktionalität des P-Loops. Die Überexpression eines P-Loop mutierten mDAP-3/EGFP Fusionproteins führte zu keiner Apoptoseinduktion. Sowohl das murine als auch das humane DAP-3 bleiben während der Apoptose intra-mitochondrial und werden nicht in das Cytosol freigesetzt. Für die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation von mDAP-3 wurde ebenfalls das mDAP-3/EGFP-Fusionsprotein verwendet. Murine-Tubuluszellen (MTC) zeigten nach Transfektion mit dem Fusionsprotein ein punktiertes Signal im Fluoreszenz-Mikroskop. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen nach Transfektion mit dem EGFP-Expressionsvektor alleine das für EGFP typische diffuse, zytosolische Fluoreszenzsignal. Sowohl im Fluoreszenz-Mikroskop als auch im konfokalen Laser-Scann-Mikroskop lokalisierte mDAP-3/EGFP zusammen mit einem mitochondrialen Farbstoff, jedoch nicht mit einem lysosomalen. Diese Ergebnisse weisen auf eine mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 hin. Zellfraktionierungen bestätigten die mitochondriale Lokalisation von mDAP-3. Das endogene mDAP-3 Protein konnte nur in der mitochondrialen Fraktion, nicht jedoch in der endoplasmatischen Reticulum- oder der zytosolischen-Fraktion, nachgewiesen werden. Proteinase-K-Behandlung isolierter Mitochondrien führte zu keiner Reduktion der mDAP-3 Proteinmenge im Western-Blot. Dies ließ auf eine intra-mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 schließen. Digitonin-Behandlung isolierter Mitochondrien zeigte eine Freisetzung von mDAP-3 aus den Mitochondrien bei relativ hohen Digitonin Konzentrationen (0,3%). Ganz im Gegensatz dazu wurde Cytochrom c bereits bei 0,075% Digitonin freigesetzt. Diese Daten weisen auf eine mDAP-3 Lokalisation in der mitochondrialen Matrix hin. Da die DAP-3 Proteinfamilie in Eukaryonten sehr konserviert ist und auch in nichtapoptotischen Organismen wie S. cerevisiae vertreten ist, muß DAP-3 eine weitere Funktion neben der pro-apoptotischen besitzen. Um die Rolle von DAP-3 näher zu definieren wurde eine Disruption des mDAP-3 Hefe-Orthologs YGL129c (yDAP-3) durchgeführt. Die yDAP-3 Nullmutanten zeigten keinen Wachstumsverlust auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wie Glycerol oder Lactat. Dies deutet darauf hin, daß yDAP-3 für die mitochondriale Atmung nicht zwingend notwendig ist. Allerdings zeigten Hefen bei einer yDAP-3 Disruption einen signifikanten und progressiven Verlust ihrer mitochondrialen DNA (mtDNA) (46% in ∆yDAP-3 vs. 3% im Wildtyp). Dieser Verlust der mtDNA, der auf eine Funktion von yDAP- 3 für die mitochondriale Biogenese hinweist, ließ sich durch eine Transfektion der ∆yDAP-3 Hefen mit dem murinen DAP-3 teilweise verhindern. Damit konnte bewiesen werden, daß die Funktion, die DAP-3 für die Biogenese der Mitochondrien ausübt, unter Eukaryonten konserviert ist. Diese Daten identifizieren mDAP-3 als einen der ersten pro-apoptotischen Faktoren der mitochondrialen Matrix. Weiterhin kann eine duale Funktion für die Mitglieder der DAP-3 Proteinfamilie postuliert werden. Zum Einen spielen sie eine wichtige, evolutionär konservierte Rolle für die Biogenese von Mitochondrien, zum Anderen besitzen sie in mehrzelligen Organismen eine zusätzliche pro-apoptotische Funktion.

Die Lyme Borreliose ist die häufigste durch Zecken übertragene Infektionskrankheit des Menschen auf der Nordhemisphäre. Der Erreger Borrelia burgdorferi s. l. wird in drei humanpathogene Arten, B. burgdorferi s. s., B. garinii und B. afzelii unterteilt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Struktur von Borrelia afzelii am Beispiel des Stamms PKo, dem Hautisolat eines Patienten, mit Hilfe elektronenmikroskopischer Methoden untersucht. Raster- und transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen an Borrelien des B. afzelii Stammes PKo wurden zur Aufklärung der Ultrastruktur der Borrelienzelle unter in vitro Kultur- Bedingungen durchgeführt. In Abhängigkeit vom Kulturalter zeigen die Borrelien starke strukturelle Veränderungen, die rasterelektronenmikroskopisch gut zu untersuchen sind. Während der log-Phase nimmt die Anzahl der Schraubenwindungen zu und somit auch die Länge der Borrelien. Gegen Ende der log- Phase verlieren die Borrelien ihre typische Schraubengestalt. Im Lichtmikroskop (Dunkelfeld) kann man gleichzeitig einen Verlust der Beweglichkeit beobachten. Allerdings bedeutet der Verlust der Beweglichkeit nicht wie bisher angenommen gleichzeitig den Tod der Borrelien, da sich nach dem Überimpfen in frisches Kulturmedium wieder bewegliche schraubenförmige Borrelien bilden. Die Untersuchungen zur Ultrastruktur der Borrelienzelle wurden an Borrelien aus der log-Phase der Kultur durchgeführt. Die Borrelienzellen sind zu diesem Zeitpunkt 10–20 µm lang und besitzen 3–9 Schraubenwindungen. Ultradünnschnitte zeigen, daß die Borrelien aus einem Protoplasmazylinder bestehen, der von einer 4 nm dünnen Zellmembran begrenzt wird. An ihn schließt sich im Abstand von 5 nm die Zellwand an. Die Borrelienzellen sind von einer äußeren Membran umgeben, die den periplasmatischen Raum umschließt. Diese Membran ist zu einem Tunnel aufgewölbt in dem die Endoflagellen liegen. An jedem Zellende befinden sich 7–9 Flagellenansatzstellen, die in der Längsachse der Borrelienzelle angeordnet sind. Jede der Flagellen inseriert nur an einem Zellende. Im mittleren Bereich der Borrelienzelle kommt es zu einer Überlappung der Flagellen der beiden Zellenden. Die Überlappungsregion ist jedoch nur undeutlich abzugrenzen. Auf Grund dieser Untersuchungen konnte ein detailliertes, maßstabsgetreues Modell einer Borrelienzelle rekonstruiert werden. Ein weiteres Untersuchungsziel war die Aufklärung der Lokalisation wichtiger immundominanter Proteine. Mit Hilfe von Immun-Gold-Markierungen konnte durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie gezeigt werden, daß die Proteine p17 (Osp17), p35 (Osp35) und p58 (Osp58) auf der Oberfläche der äußeren Membran der Borrelienzelle lokalisiert sind. Durch die Optimierung der Markierungsmethode konnte das Signal so weit gesteigert werden, daß die gleichmäßige Verteilung dieser Proteine über die gesamte Zelloberfläche dargestellt werden konnte. Auf Grund ihrer Lokalisation auf der Oberfläche der Borrelienzelle kommen diese Proteine grundsätzlich als Vakzinekandidaten in Frage. Die Lokalisation typspezifischer und konservierter Epitope der beiden immunologisch heterogenen Oberflächenproteine OspA und OspC konnte durch Immun-Gold-Markierungen mit Hilfe typspezifischer und breitreaktiver monoklonaler Antikörper nachgewiesen werden. Typspezifische und konservierte Epitope beider Proteine befinden sich auf der Oberfläche der äußeren Membran. Die Lokalisation breitreaktiver Epitope von OspA und OspC auf der Oberfläche der Borrelienzelle läßt den Einsatz dieser Proteine als Impfantigene auch im europäischen Raum erfolgversprechend erscheinen. Des weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit eine Methode entwickelt werden, die es erlaubt kokkoide Morphotypen der Borrelienzelle zu erzeugen. Durch die Inkubation von Borrelien in Aqua dest. gelingt es innerhalb weniger Minuten auf reproduzierbare Weise diese Formvarianten der Borrelien zu erzeugen. Mittels Vitalfärbungen konnte gezeigt werden, daß es sich bei den kokkoiden Morphotypen um lebende Formvarianten der Borrelienzelle handelt. Diese Formvarianten sind nicht kultivierbar. Nach dem Überführen in Kulturmedium sind nach 4–5 Tagen nur noch schraubenförmige Borrelienzellen zu beobachten. Bei den kokkoiden Morphotypen handelt sich um eine kugelförmige Anschwellung der äußeren Membran in der sich der Protoplasmazylinder in engen Windungen aufrollt. Der vom aufgerollten Protoplasmazylinder umgebene Raum ist weitgehend strukturlos. Die Flagellen befinden sich auf der von der äußeren Membran abgewandten Seite es Protoplasmazylinders. Die Rekonstruktion von Serienultradünnschnitten ergab, daß diese kokkoiden Morphotypen jeweils von einer einzelnen Borrelienzelle gebildet werden; Protoplasmazylinder, Zellwand und äußere Membran bleiben intakt. Darüber hinaus konnte am Beispiel von Osp17, Osp35 und OspC gezeigt werden, daß die Oberflächenproteine der schraubenförmigen Borrelienzelle auch bei den kokkoiden Morphotypen auf der Oberfläche lokalisiert sind. Diese drei Proteine sind auch auf den kokkoiden Morphotypen gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt. Allerdings kommt es bei der Bildung der kokkoiden Morphotypen im Vergleich zu den schraubenförmigen Borrelienzellen zu einer deutlichen Reduktion der Oberfläche. Diese Formvarianten besitzen somit nur eine reduzierte Angriffsfläche für die Antikörper des Wirts. Sie stellen also möglicherweise Formen dar, die es den Borrelien ermöglichen dem Abwehrsystem des Wirts auszuweichen. Außerdem wurde die Adhäsion von Borrelien zweier unterschiedlicher Spezies an humane Astrozyten untersucht. Dafür wurde außer dem bereits erwähnten B. afzelii Stamm PKo der B. garinii Stamm PBi eingesetzt. Hierbei handelt es sich um ein Isolat aus dem Liquor eines Patienten. In einem über 24 Std. Zeitdauer durchgeführten Koinkubationsversuch konnte mittels Lichtmikroskopie gezeigt werden, daß beide Stämme an die Astrozyten adhärieren. Borrelien des B. afzelii Stamms PKo adhärieren jedoch insgesamt weit häufiger als solche des B. garinii Stamms PBi. Bei den rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen zeigte sich, daß eine Vielzahl von Borrelien beider Stämme mit den Zellausläufern am Rand der Astrozyten und auf deren Oberfläche in Kontakt treten. Die Fähigkeit der Borrelien an die Astrozyten zu adhärieren spielt möglicherweise eine Rolle beim Übertritt von der Blutbahn ins Gehirn. Eine deutlich Reaktion der Astrozyten auf den Kontakt mit den Borrelien in Form von Oberflächenveränderungen ist nicht zu erkennen. Bei beiden Stämmen können im Rahmen der rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen Borrelien gefunden werden, die in die Zellen eindringen. Dieses Eindringen kann mit Hilfe von Ultradünnschnitten durch die Koinkubationspräparate im TEM bestätigt werden. Hierbei konnten Borrelien sowohl in Vesikeln, als auch frei im Zytoplasma derAstrozyten gefunden werden. Die intrazellulär liegenden Borrelien waren auch nach 24 Std. noch intakt. Es sind keine Degenerationsformen zu erkennen. Durch das Eindringen in die Astrozyten gelingt es den Borrelien möglicherweise über längere Zeit im Wirt zu überdauern.

Horizontale, vertikale und torsionale kanal-okuläre und entsprechende makulo-okuläre Reflexe wurden bei Fröschen getrennt untersucht. Ziel der Untersuchung war es einerseits, die räumlichen Vektoren der Richtungen von Bestantworten zu bestimmen und andererseits, die Vektororientierungen beider Reflexe zueinander in Beziehung zu setzen. Hierzu wurden die Summenaktionspotentiale von drei verschiedenen Augenmuskelnerven (M. lateralis rectus, M. inferior rectus, M. inferior obliquus) während Translations- bzw. Drehbeschleunigungen unter Ausschluß visueller Reizung untersucht. Sinusförmige Translationsbeschleunigungen wurden in horizontaler, vertikaler und schräger Richtung ausgeführt. Sinusförmige Drehbeschleunigungen wurden um eine erdvertikale Achse ausgeführt. Vor jeder Messung wurde die Kopfposition systematisch in der Nick- bzw. Kippebene verändert, um diejenigen Richtungen zu bestimmen, die maximale Antworten im Augenmuskelnerven auslösten. Anhand dieser Daten und anhand bekannter, kopffester Koordinaten der Bogengänge konnten die Richtungen der maximalen Antworten bei Translations- und Drehbeschleunigungen für die getesteten Augenmuskelnerven berechnet und in Bogengangskoordinaten ausgedrückt werden. Horizontale lineare Translationsbeschleunigungen riefen Antworten in den jeweiligen Augenmuskelnerven hervor. Jedem der getesteten Nerven konnte ein fächerförmiger Sektor auf dem kontralateralen Utrikel zugeordnet werden, aus dem die Antworten stammten. Die Antworten waren nur erregender Art, ein unterstützender hemmender makulo-okulärer Reflex konnte nicht festgestellt werden. Sakkulus oder Lagena steuerten keine vertikale Komponente zum makulo-okulären Reflex bei. Die Sektoren des M. lateralis rectus bzw. des M. inferior obliquus hatten einen Öffnungswinkel von 60° bzw. 45° und lagen in der rostralen Hälfte des Utrikels. Beide Sektoren überlappten und lagen in der Ebene der horizontalen Bogengänge. Der Sektor des M. inferior rectus war vergleichsweise schmal (5° Öffnungswinkel), lag in der kaudalen Hälfte des Utrikels und war um 6° gegenüber den horizontalen Bogengängen nach oben geneigt. Bei Drehbeschleunigungen traten maximale Antworten im Nerven des M. inferior obliquus auf, die sich aus der Konvergenz von Signalen vom kontralateralen anterioren und ipsilateralen horizontalen Bogengang (Konvergenzverhältnis 50 : 50) ergaben. Der Abduzensnerv antwortete maximal bei Rotationen in einer Ebene, bei der eine Konvergenz von Signalen aus dem kontralateralen horizontalen und anterioren Bogengang im Verhältnis 80 : 20 aktiviert wurde. Die Antworten im Nerven des M. inferior rectus waren maximal, wenn der Kopf in der Ebene des kontralateralen posterioren Bogengangs gedreht wurde. Ein Vergleich der Vektororientierungen der maximalen Antworten bei Translations- bzw. Drehbeschleunigungen zeigte, daß diese beiden Vektoren bei jedem der untersuchten Augenmuskelnerven jeweils etwa senkrecht zueinander standen. Mit dieser Anordnung können sich makulo-okuläre und kanal-okuläre Reflexe bestmöglich unterstützen: Die Richtung der Bestantworten bei Drehbeschleunigungen bleibt dieselbe, unabhängig davon, ob kanal-okuläre Reflexe isoliert oder zusammen mit makulo-okulären Reflexen aktiviert werden. Die hier gefundenen Unterschiede in der Organisation zwischen makulo- und kanal-okulären Reflexen sowie die gemeinsame räumliche Abstimmung der beiden Reflexe könnten ein allgemeines Organisationsprinzip bei Vertebraten darstellen.