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  3. Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Podcast
  4. Zur Vielfalt allgemein transduzierender Bakteriophagen in bakteriellen Gemeinschaften sowie innerhalb der Spezies Salmonella enterica serov. typhimurium
Die Rolle der Transduktion beim horizontalen Gentransfer ist
bislang wenig untersucht. Die Bedeutung, die diesem Mechanismus
beim Austausch von genetischem Material in der Natur zukommt, kann
nur geklärt werden, wenn möglichst umfassende Informationen über
das Vorkommen von transduzierenden Bakteriophagen verfügbar sind.
Zur Erforschung des Ausmaßes des phagenvermittelten Gentransfers
war es notwendig, Methoden zu entwickeln, die nicht auf die
Verfügbarkeit kultivierbarer Indikatorbakterien zum Nachweis von
Phagen sowie Spender- und Empfängerstämme zum Nachweis der
Transduktion angewiesen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine
Methode zur indikatorunabhängigen Identifizierung transduzierender
Bakteriophagen entwickelt. In Phagenpartikel verpackte DNA wurde
als Template für die PCR-Amplifikation von bakterieller 16S rDNA
eingesetzt. Dabei wurden PCR-Primer verwendet, die eine
Amplifikation der 16S rRNA-Gene der meisten Eubakteria ermöglichen.
Die Sequenzierung der klonierten Amplifikationsprodukte ermöglichte
die retrospektive Identifizierung der Wirtsbakterien. Zur
Etablierung dieser Methode wurde der generell transduzierende
Salmonella-Phage P22 eingesetzt. Erste Anwendungen auf verschiedene
Umweltproben zeigten, daß dieser Ansatz den Nachweis generell
transduzierender Bakteriophagen ohne Isolierung und Kultivierung
der Wirtszellen ermöglicht. Daher ist es auch möglich, Phagen, die
am Gentransfer beteiligt sind, ohne Selektion durch die derzeit
kultivierbaren Wirte zu detektieren. Schon in den ersten
Testanwendungen konnten Phagen von 26 verschiedenen Gramnegativen
Bakterienspezies nachgewiesen werden, bei denen bisher keine
transduzierenden Viren bekannt waren. Die Untersuchung einer
Moorquellwasserprobe brachte Informationen über Phagen mit bisher
unbekannten Wirtszellen. Die hier vorgestellte Methode kann als
Prototyp des indikatorunabhängigen Nachweises generell
transduzierender Phagen für prinzipiell alle Bakterienarten gelten.
Unter Einsatz verschiedener 16S rDNA-Primerpaare ist der Suche nach
transduzierenden Partikeln in der Umwelt nahezu keine Grenze
gesetzt. Dieser Ansatz erlaubt sowohl die Überprüfung einer Probe
auf das Vorkommen transduzierender Phagen mit unterschiedlichen
Wirtsspezifitäten als auch die gezielte Suche nach am DNA-Transfer
beteiligten Phagen spezieller Vertreter der Prokaryonten. Ein
weiteres Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der bisher
unbekannten Salmonella-Phagen 7D, PS79 und A12. Es konnte gezeigt
werden, daß diese nicht mit P22 sowie anderen prominenten
Bakterienviren verwandt sind und daher drei neue Phagenfamilien
repräsentieren. Mikrobiologische Untersuchungen erbrachten, daß es
sich dabei um zwei temperente und einen virulenten generell
transduzierenden Phagen handelt. Bezüglich ihrer morphologischen
und Nukleinsäure-Merkmale zählen sie zur Familie der Caudovirales.
Die Phagen wurden in Hinsicht auf ihr Wirtsspektrum sowie auf
phagenvermittelte Schutzmechanismen lysogener Zellen untersucht. Im
Rahmen der molekulargenetischen Analyse konnte die Größe der
Phagengenome ermittelt werden und für 7D und PS79 konnten
Restriktionskarten für acht bzw. sieben Enzyme erstellt werden. Der
Phage A12 entzog sich, wahrscheinlich aufgrund ausgeprägter
DNASekundärstrukturen, einer ausführlichen Restriktionskartierung,
so daß diese auf ein Enzym beschränkt werden mußte. Untersuchungen
PS79-lysogener Zellen weisen darauf hin, daß der Prophage als
extrachromosomale Replikationseinheit vorliegt. Für den Phagen 7D
wurde die Integration durch ortsspezifische Rekombination sowie der
Integrationsort auf dem Chromosom von Salmonella nachgewiesen. Die
Charakterisierung der Phagen 7D, PS79 und A12 erbrachte neue
Informationen über die Vielfalt generell transduzierender
Bakteriophagen bei Salmonella. Insgesamt zeigen die erzielten
Ergebnisse deutlich, daß der horizontale Transfer genetischen
Materials durch Transduktion, insbesondere im Hinblick auf die
Sicherheitsforschung im Zusammenhang mit der Freisetzung
gentechnisch veränderter Organismen, nicht länger als
vernachlässigbarer Faktor eingestuft werden kann.

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