Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv

1.) Die weltweit als Bioindikator für den Luftschadstoff Ozon eingesetzte Tabaksorte Bel W3 reagiert mit typischen pergamentartigen Läsionen auf sommerliche Ozonwerte in Mitteleuropa. Es konnte demonstriert werden, dass eine Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), vor allem H2O2, der Ozoninduktion von Zelltod vorausgeht, wobei die Orte der H2O2-Akkumulation („Burst initiation sites“) mit denen der späteren Läsionen sehr gut korrelierten. Histologische Untersuchungen zeigten, dass dieser „oxidative Burst“ zunächst in den Zellen des Palisadenparenchyms, und zwar in Clustern in der Nähe von Blattadern, erfolgte. 2.) Bei einem Vergleich Ozon-empfindlicher Arten, Sorten und Ökotypen von Nutz- und Wildpflanzen zeigten sich deutliche Unterschiede in der Art der vorwiegend akkumulierten ROS. In neun Tomatensorten wurde H2O2-Akkumulation detektiert, wobei die Intensität mit der Ozonempfindlichkeit der Sorten korrelierte. In zehn Ökotypen von Arabidopsis thaliana L. ließ sich neben H2O2 vor allem O2 -. detektieren, wobei O2 -. mit dem Muster und der Quantität der Schäden korrelierte. Bei den Ozon-empfindlichen Wildpflanzen Rumex crispus L., R. obtusifolius L. und Malva sylvestris L. konnte ausschließlich O2 -. nachgewiesen werden. Blattquerschnitte der letztgenannten Pflanzenart erbrachten deutliche Unterschiede zu der Tabaksorte Bel W3: Obwohl beide Pflanzenarten amphistomatäre Blätter besitzen, konnte O2 -. zuerst in den Zellen des Schwammparenchyms detektiert werden. In allen Fällen erfolgte das Auftreten von Ozon-induziertem Zelltod verstärkt entlang der Blattadern; Bereiche des Zelltodes korrelierten jeweils mit vorheriger Akkumulation von ROS. 3.) In Freilandversuchen konnte zum ersten Mal die Ozon-induzierte Akkumulation von ROS vor dem Auftreten von Blattsymptomen in Wild- und Kulturpflanzen gezeigt werden. Berechnungen der kritischen Grenzwerte für Ozon (AOT40) ergaben, dass der zur Zeit für Kulturpflanzen und natürliche Vegetationen vorgegebene Wert von 3000 nl l -1 h für empfindliche Pflanzen wie die Tabaksorte Bel W3 zu hoch angesetzt ist. 4.) Täglich wiederkehrende Ozonexposition in Freiland- und Kammerversuchen führten in der Tabaksorte Bel W3 zu einer Akkumulation von H2O2 um schon bestehende Läsionen herum und daraus resultierend zu deren Vergrößerung. Es ist anzunehmen, dass existierende Bereiche pflanzlichen Zelltods die Nachbarzellen für ROS-Akkumulation und Zelltod empfindlicher machen. Als Verstärkungsfaktoren kommen erhöhte Produktionsraten von Ethylen, NO und Salicylsäure in Betracht. Entsprechend korrelierten die Gehalte der Ethylenvorstufe 1-Aminocyclopropan-1-carbonsäure und Salicylsäure mit Ozon-induziertem Zelltod. Erstmalig konnte eine Ozon-induzierte Akkumulation des pflanzlichen Signalstoffs NO nachgewiesen werden. Dessen Produktion erfolgte in Ozon-behandelten Blättern der Tabaksorte Bel W3 zum gleichen Zeitpunkt und mit sehr ähnlichem Muster, nämlich besonders in Palisadenparenchymzellen entlang Blattadern, wie H2O2, so dass beide Signalmoleküle bei der Ausprägung pflanzlichen Zelltods kooperieren könnten. 5.) Das Auftreten erhöhter ROS-Gehalte nach Ende der Ozonexposition sowie die Hemmung der ROS-Akkumulation und Ozon-induzierten Zelltods durch Enzym-Inhibitoren weisen auf eine aktive in planta Bildung von ROS in Ozon-empfindlichen Pflanzen hin. Als ROS-produzierende Enzyme kommen dabei verschiedene Oxidasen und Peroxidasen in Betracht. Zunächst wurde eine Beteiligung von Oxalatoxidase-Aktivität an dem Ozon-induzierten „oxidativen Burst“ für Tabak ausgeschlossen. 6.) Erstmals gelang der Nachweis zweier homologer Gene in Tabak zu der O2 -. -produzierenden NADPH-Oxidase (gp91phox) aus Makrophagen von Säugern. Beide Isoformen wurden kloniert; sie wurden in Anlehnung an die entsprechenden Isoformen in A. thaliana als Ntrboh (N. tabacum respiratory burst oxidase homologue) D und F bezeichnet. Die Sequenzen enthielten die für die Aktivität der NADPH-Oxidase wichtigen FAD-, NADPH Adenin- und NADPH Ribose-Bindungsstellen sowie konservierte Histidin-Reste für die Häm-Bindung. Wie die bisher veröffentlichten pflanzlichen NADPH-Oxidasen fanden sich in Ntrboh D und F N-terminale Verlängerungen mit zwei EF-Hand-Motiven, die als putative Ca 2+ -Bindungsstellen gelten. 7.) Während Ntrboh F in allen Geweben konstitutiv exprimiert wurde, zeigte sich die Isoform Ntrboh D in ihrer Expression abhängig vom Gewebe. Ozonbehandlung führte zu einer biphasischen Induktion der Expression von Ntrboh D in Blättern der Sorte Bel W3 mit Maxima nach 2 und 6 h nach Beginn der Exposition. Maximale Transkriptgehalte wurden durch einmalige Exposition mit 200 nl l -1 Ozon induziert, höhere Ozondosen brachten keine weitere Steigerung. Auch in der Ozon-toleranten Sorte Bel B ergab sich ein zu Bel W3 sehr ähnlicher biphasischer Verlauf der Transkript-Akkumulation. Die Isoform Ntrboh F zeigte in einigen Versuchen eine leicht erhöhte Expression gegen Ende und nach der Ozonexposition, also zeitlich zusammen mit dem Auftreten des zweiten Peaks der ROS-Bildung. Infiltration mit einem avirulenten Pathogen-Stamm (Pseudomonas syringae pv. syringae) bewirkte eine der Ozoninduktion vergleichbare Transkriptakkumulation von Ntrboh D. In der Apoplastenflüssigkeit von Tabakblättern fanden sich Isoformen von Superoxiddismutase (SOD), die durch Ozon in ihrer Aktivität induziert waren. 8.) Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Ozoneffekte in empfindlichen Pflanzen durch die pflanzeneigene Produktion von ROS verstärkt werden. ROS sind dabei an der Induktion eines Zelltodprogramms beteiligt. Es wird postuliert, dass die Ozoninduktion von Homologen der NADPH-Oxidase aus Säugern zusammen mit SOD für die Ozon-induzierte H2O2-Akkumulation und die extrem hohe Empfindlichkeit der Tabaksorte Bel W3 verantwortlich ist. Weitere Untersuchungen auf Protein- und Enzymaktivitätsebene müssen zeigen, welche Mechanismen für die Auslösung dieser Induktion in Bel W3, nicht aber in Ozon-toleranten Nutz- und Wildpflanzen, verantwortlich sind.

Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert ruhende primäre humane B-Zellen und induziert deren unbegrenzte Proliferation. Dieser Prozess der B-Zell-Immortalisation ist ein Modellsystem, das die pathogenetischen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt. In vitro gilt das virale latente Membranprotein 1 (LMP1) für die Immortalisation von B-Zellen als essentiell. LMP1 ist ein integrales Membranprotein, das als konstitutiv aktivierter Pseudorezeptor verschiedene Signalwege in der B-Zelle induziert und dabei analoge Funktionen zum zellulären CD40-Rezeptor wahrnimmt. Das Genom des EBV ist in dem Maxi-EBV-System einer genetischen Manipulation zugänglich. Zuerst habe ich verschiedene Mutanten des LMP1 Gens im Kontext des EBVGenoms etabliert und auf ihren Phänotyp untersucht. Überraschenderweise war es möglich, mit allen LMP1 mutierten EBVs proliferierende B-Zellklone zu generieren, dies gelang sogar mit einer „knock out“ Mutante des kompletten LMP1 Gens. Die zehn verschiedenen LMP1- Mutanten unterschieden sich gravierend in ihrer Effizienz, B-Zellen zu immortalisieren. So wurden bis zu 100 mal mehr Virionen benötigt, um z.B. mit der LMP1-„knock out“-Mutante proliferierende B-Zellklone zu etablieren. Eine solche B-Zelllinie wies in einem in vivo Experiment mit SCID-Mäusen im Gegensatz zu B-Zelllinien mit Wildtypvirus kein onkogenes Potential auf. Im Widerspruch zu den bisherigen Veröffentlichungen einer anderen Gruppe zeigen meine Ergebnisse, dass LMP1 für den Prozess der B-Zell-Immortalisation in vitro zwar kritisch, aber nicht zwingend notwendig ist. Für die Onkogenität von EBV in vivo ist LMP1 dagegen absolut essentiell. Die Zielgene des LMP1, die die verschiedenen Effekte wie B-Zell-Immortalisation, Onkogenität und Tumorentstehung vermitteln, sind nicht vollständig bekannt. Ein zweites Ziel dieser Arbeit war deshalb die umfassende Katalogisierung dieser Zielgene. Da LMP1 und der CD40-Rezeptor analoge Funktionen und gemeinsame Signalmediatoren und -wege aufweisen, sollten vergleichende Untersuchungen von LMP1- und CD40-regulierten Genen durchgeführt werden. Zu diesem Zweck wurde ein konditionales LMP1-System in humanen B-Zellen etabliert, das es erlaubt, LMP1-Signaltransduktion innerhalb eines sehr kurzen, definierten Zeitraums zu induzieren und differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Da der CD40-Rezeptor auf humanen B-Zellen konstitutiv exprimiert ist und durch Interaktion mit seinem Liganden aktiviert werden kann, konnte die Analyse CD40-regulierter Zielgene im selben Zellsystem erfolgen. Unter Anwendung von ATLAS Array-Filtern und Affymetrix Chips wurden 144 LMP1- und 28 CD40-regulierte Gene identifiziert. Schließlich konnte in Zellzyklusanalysen gezeigt werden, dass LMP1-Signale in humanen B-Zellen echte proliferative Effekte vermitteln und nicht nur anti-apoptotische Funktionen erfüllen.

Die 4-Cumarat:Coenzym A Ligase (4CL) ist ein Enzym des allgemeinen Phenylpropanstoffwechsels, das aktivierte Hydroxyzimtsäure-Ester zur Synthese spezifischer Phenylpropanoide bereitstellt. In vielen Pflanzen kommen strukturell und funktionell sehr ähnliche 4CL-Isoformen vor, weshalb diesem Enzym dort nur eine beschränkte regulatorische Funktion bei der Verteilung der unterschiedlich substituierten Zimtsäurederivate für nachfolgende Synthesen zugesprochen wird. Durch Isolierung der cDNA der von Knobloch und Hahlbrock (1975) partiell gereinigten Ligase 1 und der Vervollständigung der kodierenden Sequenz der Gm4CL4 konnte mit großer Wahrscheinlichkeit die Genfamilie der Sojabohne-4CLs komplettiert werden. Mit der cDNA der Gm4CL1 war außerdem erstmals eine 4CL-Sequenz verfügbar, die für eine Sinapinsäure-umsetzende 4CL kodiert. Zusammen mit den bereits beschriebenen 4CL-Isoenzymen 2 und 3 (Uhlmann und Ebel, 1993; Möllers, 1997) existieren in Sojabohne somit mindestens vier 4CL-Isoformen. Die unterschiedlichen Substratspezifitäten der rekombinanten Proteine, die Fähigkeit, die gesamte Gruppe der pflanzlichen Hxdroxyzimtsäuren zu aktivieren und die differentielle Synthese der Gm4CL-Isoformen nach Elicitor-Behandlung von Sojabohnezellkulturen bzw. Infektion von Sojabohnekeimlingen weisen auf eine bedeutende regulatorische Funktion der 4CL hinsichtlich der Bereitstellung unterschiedlich substituierter Zimtsäurederivate zur Synthese spezifische Phenylpropanoide in Sojabohne hin. Dabei scheinen Gm4CL1 und Gm4CL2 vor allem an der Synthese von Phenylpropanoiden beteiligt zu sein, die für Wachstum und Entwicklung der Pflanzen benötigt werden, während Gm4CL3 und Gm4CL4 aktivierte Zimtsäuren bereitstellen, die aufgrund von Umweltveränderungen benötigt werden. Die 4CL wird mit Acyl-CoA Ligasen, Peptidsynthetasen und Luciferase zur Familie der AMP-bindenden Proteine zusammengefaßt. Diesen Enzymen ist nicht nur der Mechanismus der AMP-Aktivierung gemeinsam, sondern sie besitzen auch Ähnlichkeiten in ihren Proteinstrukturen. Durch Bildung von Hybridenzymen zwischen Gm4CL1 und Gm4CL3 konnte der zentrale Sequenzbereich der 4CL als Substratspezifität-determinierende Region ermittelt werden. Mit Hilfe der Informationen, die von der Kristallstruktur der Phenylalaninaktivierenden Untereinheit der Gramicidin-S-Synthetase gewonnen wurden, konnten vier mögliche Substratbindemotive der 4CL identifiziert werden. Innerhalb eines dieser Motive unterscheidet sich die Gm4CL1 von allen anderen bisher klonierten 4CLs durch den Verlust eines Aminosäurerestes, wodurch die Gm4CL1 in der Lage ist, hochsubstituierte Zimsäurederivate zu aktivieren. Wird der entsprechende Aminosäurerest der Gm4CL2 (Gm4CL2dV345) und Gm4CL3 (Gm4CL3dV367) entfernt, können beide Deletionsmutanten Sinapinsäure umsetzen. Außerdem ist Gm4CL3dV367 in der Lage, 3,4-Dimethoxyzimtsäure zu aktivieren und zeigt eine deutlich erhöhte Affinität gegenüber Ferulasäure. Durch das Entfernen einer einzigen Aminosäure können somit hochsubstituierte Zimtsäurederivate umgesetzt werden. Die Möglichkeit, die Substratspezifität dieses zentralen Enzymes des Phenylpropanstoffwechsels zu modifizieren, eröffnet die Herstellung transgener Pflanzen mit gewünschtem Phenylpropanoid-Profil.

Three functionally important centrosomal proteins from Dictyostelium were identified, cloned and characterized. The work focuses on the Dictyostelium-homologue of centrin and two proteins belonging to soluble gamma-tubulin complexes in other organisms.

Plastid chromosomes from the variety of plant species contain several conserved open reading frames of unknown function, which most probably represent functional genes. The primary aim of this thesis was the analysis of the role of two such ORFs, designated ycfs or hypothetical chloroplast reading frames, namely ycf9 (ORF62) and ycf10 (ORF229, cemA). Both were analyzed in Nicotiana tabacum (tobacco) via their inactivation using biolistic plastid transformation. A new experimental protocol, based on pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), was established to reliably assess the homoplastomic state of transformed plants. 1. Functional analysis of the ycf9 gene product: The inactivation of ycf9 in N. tabacum as well as in Chlamydomonas reinhardtii yielded a homoplastomic mutant phenotype after several rounds of regeneration under selective pressure. The mutant plants grew photoautotrophically, but displayed two clear phenotypes, a light-sensitive one, increasing with the light intensity, and a dwarf phenotype under low-light combined with temperatures below 20°C. The ycf9 gene product was exclusively located in PSII core complexes. This localization was based on the isolation of protein complexes released from thylakoids by controlled, partial lysis, followed by sucrose density gradient centrifugation or 2D gel electrophoresis. This finding revised data of the literature. Biochemical analysis indicated an involvement of the protein in the interaction of the light harvesting antenna II complex (LHCII) with PSII cores. In particular, PSII-LHCII supercomplexes could no longer be isolated from transplastomic tobacco plants. Furthermore, the minor chlorophyll a/b-binding proteins CP26, and to a lesser extent CP29, were substantially reduced under most growth conditions analyzed, in both, tobacco and photoautotrophically grown Chlamydomonas mutants (Swiatek et al. 2001). The gene was therefore renamed psbZ. The ∆psbZ-related alterations in the supramolecular organization of PSII complexes were accompanied by considerable modification in (i) the phosphorylation pattern of PSII subunits, (ii) the rate of deepoxydation of xanthophylls, and (iii) the kinetics and amplitude of non-photochemical quenching. The proposed position of PsbZ in close proximity to CP43 enables the protein to interact with PSII cores to elicit an adaptation process in response to excess light excitation. The molecular mechanism underlying this energy dissipation process remains to be investigated. 2. Functional analysis of the ycf10 gene product: Biolistic plastid transformation was also used to inactivate the ycf10 reading frame in tobacco. After several rounds of regeneration under selective pressure, homoplastomic plants were obtained. Northern analysis uncovered co-transcription of ycf10 within the psaI-ycf4-ycf10-petA gene cluster, with at least two promotor regions upstream of the psaI gene. The mutant plants grew photoautotrophically and developed dark green leaves with numerous pale green to white regions, the latter devoid of photosynthetic activity. The loss of ycf10 did not affect photosynthetic activity, as indicated by unaltered chlorophyll fluorescence. The tobacco ycf10 gene product was localized in the chloroplast inner envelope membrane. Neither protein composition of stroma or thylakoid fractions, nor the stability of the photosynthetic protein complexes were affected in the mutant plants. In contrast, CO2- dependent oxygen evolution was strongly reduced, with a maximum rate of Ci-dependent photosynthesis being approximately 50% lower than in wild-type plants. Two explanations can account for the observed phenomenon: (i) de-regulation of carbonconcentrating mechanisms in transformed cells, or (ii) an indirect effect on CO2-uptake in ∆ycf10 plants. 3. Pulsed-field gel electrophoresis is an ideal tool to verify the homoplastomic state of transformed plants: To enhance the sensitivity of detection of heteroplastomic states, and to distinguish between plastome-located wild-type segments in transplastomic material and promiscuous DNA, a new approach was developed. Customary Southern and PCR techniques are not sensitive enough or not discriminating the latter alternatives, respectively. Pulsed-field gel electrophoresis allows to isolate virtually contamination-free plastid DNA. Plastid DNA isolated this way lacked traces of nuclear and mitochondrial DNA at a detection level of 50 DNA molecules. This excludes that gene-specific PCR amplification products originate from promiscuous nuclear or mitochondrial gene copies. Therefore, PFGE appears to be an ideal tool to investigate the homoplastomic state of transformed plants, especially when combined with radiolabeled probes and Southern techniques.

Glucans, with the (1-3)-b-glucosidic linkage as major feature, are present in most of the higher plants, in many lower plants, as well as in microorganisms (Stone and Clarke, 1992). The synthesis of (1-3)-b-glucan in vivo is catalysed by the enzyme (1-3)-b-glucan synthase (EC 2.4.1.34; UDP-glucose:1,3-b-D-glucan 3-b-D-glucosyl transferase) using UDP-glucose as substrate. The (1-3)-b-glucan synthase was characterised in a number of fungi and plants, but not much work was done with oomycetes (Stone and Clarke, 1992), even though one of the earliest successful in vitro assays for glucan synthase activity was done using Phytophthora cinnamomi (Wang and Bartnicki-Garcia, 1976, Selitrennikoff 1995). In this work, the glucan synthase of the oomycete Phytophthora sojae was characterised, solubilized, and partially purified, and the cDNA for a protein co-purifying with the glucan synthase activity was cloned. The glucan synthase of P. sojae had several features that distinguish it from what is known for glucan synthases from fungi and plants (callose synthases). Its apparent Km value for UDP-glucose was higher than reported for other glucan synthases. The activity was GTP-independent and shown not to be activated by divalent cations like Mg2+ or Ca2+, and shown to be inhibited by some others, like Cu2+ or Zn2+. Some of these properties are shared with the glucan synthase from Achlya ambisexualis (Cabib and Kang, 1987), an organism that belongs to the same kingdom as P. sojae: the Chromista. It was also demonstrated by NMR analysis and enzymatic degradation that the sole product of the CHAPS-solubilized glucan synthase of P. sojae was composed of long linear (1-3)-b-glucan chains. The glucan synthase was purified by product entrapment. Two proteins, with apparent molecular masses of 108 and 50 kDa, were enriched and microsequenced. With the degenerated oligonucleotides derived from the sequenced peptides, PCR experiments were performed using as a template a cDNA library of actively growing P. sojae mycelium. No positive result could be obtained by using the oligonucleotides derived from the 108 kDa protein. In contrast, a full length cDNA (named Ps-P50) was cloned, using the oligonucleotides derived from the 50 kDa protein (P50). The deduced amino acid sequence of Ps-P50 cDNA contains sequence motifs homologous to the peptides sequenced from P50. This cDNA encodes a protein with a molecular mass of 49.991 Da with no homology found in the data bases. Diversity between the PCR product and the cDNA clone, and various different homologous ESTs indicates that Ps-P50 is a member of a gene family.

Das Melanom ist aufgrund seiner frühzeitigen und häufigen Metastasierung sowie seiner Resistenz gegenüber Chemotherapeutika einer der bösartigsten Tumoren des Menschen. Trotz dieser großen medizinischen Bedeutung, ist über die molekularen Mechanismen der Tumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die in diesem Prozess eine Rolle spielen, von größter Wichtigkeit. PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in unserem Labor in einer mRNA differential display-Analyse auf der Suche nach Metastasierungs- assoziierten Molekülen im Melanom isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen TDAG51, das im Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In der vorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine Funktion im humanen Melanom beschrieben. Es wurden sechs monoklonale Antikörper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und die PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der Immunfluoreszenzfärbung auf lebenden Zellen, sowie immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht. Dabei konnten folgende Resultate erzielt werden: In 11 untersuchten Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge signifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus Melanomprimärtumoren. Die verminderte Expression von PHLDA1 ist somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien, die aus Melanommetastasen etabliert wurden. In normalem Haut- und Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu detektieren. Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozytären Läsionen eine PHLDA1- spezifische Färbung nachgewiesen werden. 80% der benignen Nävi, dagegen nur 41% der Primärtumore und 22% der Metastasen zeigten eine starke und gleichmäßige PHLDA1- Expression. Damit bestätigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus den Versuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die PHLDA1-Expression während der Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase herunterreguliert wird. Mit den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antikörpern konnte PHLDA1 als zytoplasmatisches Protein lokalisiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der zweite Translationsstartpunkt des offenen Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufklärung der Funktion von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1- Transfektanten und zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in einer immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der klonierten Transfektanten ergab ein langsameres Wachstum der PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte Klonierungseffizienz sowie ein reduziertes Vermögen Kolonien zu bilden. Außerdem zeigten die PHLDA1-Transfektanten während des Wachstums eine stärkere Kontaktinhibition. Die konstitutive PHLDA1-Expression in den stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den Zellzyklus. Dagegen konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem TdT-abhängigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay) gezeigt werden, dass die basale Apoptoserate in den PHDLA1-Transfektanten erhöht war. Auch die Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin erhöhte die Apoptoserate der PHLDA1- Transfektanten signifikant gegenüber der Neomycinvektor-Transfektanten. Um Aufschluss darüber zu bekommen auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die Apoptose beeinflusst, wurde nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1 im yeast two hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten Hefeklonen einer Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank, zwei Gene isoliert werden, die in Hefe spezifisch mit PHLDA1 interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47- Untereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei dem anderen Gen um das MRG-Gen (mammary-derived growth inhibitor-related gene). Translations- initiationsfaktoren werden mit der Blockade der Proteinbiosynthese während der Apoptose in Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass eine wachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome ausübt. Ob die beiden Proteine auch die physiologischen Bindungspartner von PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig geklärt. Das Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen Ergebnissen, läßt vermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in den Nävi für deren gutartigen Charakter mitverantwortlich ist. Im Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1- Expression schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden Deregulation des Wachstums und der Ausbildung der Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der PHLDA1-Expression und Apoptosesensitivität machen PHLDA1 zu einem interessanten Zielgen für die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim Melanom.

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit verschiedenartigen Aspekten zum Thema Opiatentzug. Dabei wurde die Funktionalität µ-Opioidrezeptor-gekoppelter G-Proteine in der intrazellulären Signaltransduktionskaskade im Entzug und unter chronischer Opiatverabreichung untersucht. Als Ergebnis dieser Studie, die mittels einer in situ [S35]-GTPγSAutoradiographie durchgeführt wurde, konnte die Erkenntnis bestätigt werden, nach der eine Adaption auf extern zugeführte Opioide nicht auf einer Veränderung von Rezeptoren oder deren Interaktion mit G-Proteinen beruht (Kapitel 2). Vielmehr scheinen intrazelluläre, durch Genexpression gesteuerte Mechanismen für eine erfolgreiche Adaption an veränderte Umweltbedingungen ausschlaggebend zu sein. Hierbei spielt eine veränderte Transkription von CREB und somit in Folge eine erhöhte Transkription der Adenylatcyclase eine tragende Rolle. Eine weitere Studie beschäftigte sich mit einem neuartigen Konzept zur Verstärkung von opioidagonistischen Wirkungen durch die Zugabe von Opioidantagonisten in geringer Dosierung (low dose Naloxon-Konzept, Kapitel 3). Hier konnte in verhaltensbiologischen Untersuchungen kein Effekt nachgewiesen werden. Insbesondere konnte nicht nachgewiesen werden, dass die Koverabreichung von low dose Naloxon während der Abhängigkeitsentwicklung Entzugserscheinungen moduliert. Beide Studien beschäftigen sich direkt und indirekt mit der in der Wissenschaft intensiv diskutierten Frage der Existenz von Gs-Proteingekoppelten Opioidrezeptoren, die neben den bereits bekannten Gi/o-Protein-gekoppelten Opioidrezeptoren in der Zellmembran lokalisiert sind. Ein autoradiographischer Nachweis hierzu steht bislang aus. Abhilfe könnte eine weiterentwickelte [S35]-GTPγSAutoradiographie schaffen, in der durch selektive Blockade der Gi/o-Protein-gekoppelten Opioidrezeptoren durch Pertussistoxin ein Nachweis Gs-Protein-gekoppelter Opioidrezeptoren in situ möglich sein müsste. Ein direkter Nachweis dieser Kopplung eröffnet völlig neuartige Perspektiven in der modernen Opioidpharmakologie, da durch selektive Liganden dieser Gs-Protein-gekoppelten Rezeptoren die Opiatwirkung in der klinischen Anwendung verstärkt werden könnte. Möglicherweise findet dieses Wirkprinzip bereits unbeabsichtigt seit Jahren Anwendung: der Opiatagonist Tilidin (Valoron N) kommt bei der Behandlung mittelschwerer bis schwerer Schmerzen zum Einsatz. Als Besonderheit ist diesem Präparat der Opiatantagonist Naloxon im Verhältnis 1:12,5 (Einzeldosis: 4 mg Naloxon/50 mg Tilidin) beigemischt, um eine missbräuchliche Anwendung zu unterbinden. Bei normaler therapeutischer Dosierung unterliegt der Naloxonanteil einem intensivenhepatischen Abbau, so dass Tilidin voll wirksam ist. Bei missbräuchlicher Einnahme hoher Dosen durch Opiatabhängige wird der Naloxonanteil nicht vollständig metabolisiert; Entzugssymptome werden provoziert oder bereits bestehende werden verstärkt. Tilidin selbst wird in der Leber zu Nortilidin und Binortilidin metabolisiert, wobei Nortilidin als der eigentliche Opiatagonist am Rezeptor angesehen wird (Schulz et al. 1978). Möglicherweise passieren aber geringste Spuren von Naloxon bei normalem therapeutischen Einsatz die Leber und könnten folglich im low dose -Bereich wirksam werden. Über die Wirkungsweise low dose Naloxon-vermittelter Verstärkung der analgetischen Wirkung von Opiaten können nur rein hypothetische Ansätze formuliert werden. Neben den bereits diskutierten Gs-Protein gekoppelten Opioidrezeptoren könnte auch ein Einfluss auf die Internalisierung von Opioidrezeptoren möglich sein. Hier steht, neben dem dringend nötigen Nachweis Gs-Protein gekoppelter Opioidrezeptoren, ein völlig neuartiges Forschungsgebiet der Opioidpharmakologie offen. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit konnte erstmals das Phänomen konditionierter Opiatentzug näher charakterisiert werden (Kapitel 4). Auch wenn es nicht gelang, aus der Vielzahl an Entzugserscheinungen die wichtigsten Kardinalsymptome zu konditionieren, so besteht dennoch kein Zweifel, dass Entzugssymptome ausreichend konditioniert werden können und dass diese konditionierten Symptome mit einer Aktivierung von Stressmechanismen verbunden sind. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass mit der Präsentation des konditionierten Stimulus eine massive neuronale Aktivität im Locus coeruleus ausgelöst wird. Dieses Kerngebiet ist seit Jahren ohne Zweifel für die Ausbildung der meisten körperlichen Entzugssymptome während eines Opiatentzugs verantwortlich (Aghajanian, 1978; Maldonado et al., 1992b). Gerade in den letzten Jahren kommt dem konditionierten Entzug die Aufmerksamkeit zu, die ihm möglicherweise in seiner Bedeutung im Rückfallverhalten zusteht. Neueste Studien (Schulteis et al., 2000) zeigen deutlich, dass konditionierte Entzugserscheinungen mit dem Kerngebiet assoziiert werden, die für die hedonistische Beurteilung eines Ereignisses ausschlaggebend sind. Obwohl in frühen Studien durch Befragung von Abhängigen kein Einfluss konditionierter Entzugserscheinungen auf Rückfallverhalten nachgewiesen werden konnte (McAuliffe, 1982), stellt sich berechtigterweise die Frage, ob von Drogensüchtigen bzw. entzogenen Patienten der Reflexbogen, der zum Rückfall führte, überhaupt als solcher erkannt und benannt werden kann. Gerade das stereotype Ablaufen suchtrelevanter Konditionierungs- und Sensibilisierungsmechanismen entzieht sich oftmals dem Bewusstsein des Suchtkranken (Zieglgänsberger und Spanagel, 1999). In frühen tierexperimentellen Studien waren Versuchstiere nicht in der Lage, die im konditionierten Entzug auftretenden Entzugserscheinungen durch Trinken von opioidagonistischer Lösung zu lindern (Stewart et al., 1984). Dabei stellt gerade die orale Verabreichung von z.B. Morphin auf Grund der schlechten Resorption aus dem Gastrointestinaltrakt eine schlechte Art der Verabreichung von Opiaten dar (Gellert und Holtzman, 1978). In einem konditionierten Entzugsgeschehen kommt daher der schnellen intravenösen Verabreichung von Opiaten tragende Bedeutung zu. Opiatsucht stellt sich als komplexes Krankheitsbild dar, zumal die Patienten nicht nur von einem Opiat abhängig sind, sondern meist Polytoxikomanen sind. Dennoch erscheint gerade der konditionierte Entzug als ein wichtiges Element im Rückfallverhalten, möglicherweise eben nur im Zusammenspiel anderer suchtrelevanter Parameter. Aufschluss inwieweit hier konditionierte Entzugs-erscheinungen eine tragende Rolle spielen, könnte ein Tierexperiment darstellen, in dem auf Entzug konditionierte Versuchstiere gelernt haben, sich über eine intracerebroventriculare Injektion Morphin zuzuführen. Nur ein schneller, unmittelbarer Wirkungseintritt von Morphin greift in den Reflexbogen ein, der von den meisten Patienten im Rückfall nicht kognitiv wahrgenommen wird. Kein anderer Stoff begleitet die Menschheit so lange wie der Saft der Kapseln des Schlafmohns und bei keinem anderen Stoff liegen Wohl und Wehe so eng beisammen. Opium und seine in der modernen Medizin angewandten Derivate stellen nach wie vor die potentesten Schmerzmittel dar. Bis heute gibt es keine vergleichbaren Analgetika. Die erstaunliche Kongruenz zwischen speziellen Rezeptoren im Gehirn und einem sekundären Pflanzenalkaloid bringt die moderne Opioidpharmakologie immer wieder in den Konflikt zwischen maximaler Schmerzlinderung und den fatalen Folgen dieser Therapie, die in Toleranz, Abhängigkeit und Entzug münden kann. Dennoch bemühten sich seit Menschengedenken Ärzte und Wissenschaftler um die Vorteile dieses Prinzips und so sollte es eines Tages gelingen, die schmerzlindernde Komponente der Opiate von den negativen Auswirkungen abzukoppeln.

Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Funktion der Untereinheit e (Sue) der mitochondrialen F1FO-ATP Synthase von Saccharomyces cerevisi-ae. Anhand der Resultate der durchgeführten Experimente wurden folgende Schlussfolgerungen gezogen: (1) Sue ist der Lage, ein Sue-Homodimeres zu bilden. Das Protein spielt eine zentrale Rolle bei der Assemblierung der F1FO-ATP Synthase zu einem stabilen Dimer. Sue-Disruptanten bilden entsprechend kein stabiles ATP Synthase-Dimeres aus. Die C-terminalen 36 Aminosäurereste von Sue, die gegenüber Untereinheiten e aus Säugerzellen zusätzlich vorhanden sind, sind für die Dimerisierung von Sue und der F1FO-ATP Synthase ohne Bedeutung. (2) Zwischen den Untereinheiten e und k, die beide im FO-Sektor der ATP Synthase lokalisiert sind, besteht eine enge räumliche Beziehung. Für die In-teraktion von Sue mit Suk ist der Bereich von Sue, der anderen Untereinheiten e aus Säugerzellen ähnelt, ausreichend. (3) Im Hefegenom wurde ein der Sequenz von Suk nahe verwandtes Le-seraster gefunden. Die Sequenzähnlichkeit auf Aminosäureebene beträgt 45%. Ein entsprechendes hypothetisches Protein wurde als Suk hom bezeichnet. Eine Deletion dieser Sequenz allein oder gemeinsam mit dem Gen für Suk blieb ohne Auswirkungen auf die oxidative Phosphorylierung, die Assemblie-rung der F1FO-ATP Synthase und die Expression von Untereinheiten des FO-Sektors der F1FO-ATP Synthase. (4) Die Dimerisierung der F1FO-ATP Synthase und somit auch die Funkti-on von Sue als Dimerisierungsfaktor erwies sich als essentiell für die Funkti-on weiterer Komponenten der Atmungskette: der Cytochrom c-Oxidase und des Cytochrom bc1-Komplexes. Die Assemblierung der ATP Synthase wirkt sich auf die Aktivitäten der beiden Komponenten des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes aus. Sie beeinflusst auch deren Assemblierung in den Supra-komplex beziehungsweise seine Stabilität. Die Anwesenheit der Region von Sue, die anderen Untereinheiten e aus Säugetierzellen ähnelt, reicht für die Bildung des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes aus. Das Dimer der ATPase Synthase ist demzufolge in den Suprakomplex einge-bunden. Allerdings hat der Assemblierungszustand des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes keinerlei Auswirkungen auf die Assemblierung der ATP Synthase. Dies deutet auf einen hierarchisch ablaufenden Prozeß der Bildung eines Suprakomplexes aus Cytochrom bc1-Komplex, Cytochrom c-Oxidase und F1FO-ATP Synthase hin. Die ATP Synthase nutzt zur Bildung von ATP den elektrochemischen Gra-dienten über die innere Mitochondrienmembran, an dessen Aufbau der Cy-tochrom bc1-Komplex und die Cytochrom c-Oxidase beteiligt sind. Eine Ein-bindung dieser Enzyme in einen Suprakomplex würde eine koordinierte Re-gulation der oxidativen Phosphorylierung ermöglichen. (5) Zwischen der Untereinheit Sue der F1FO-ATP Synthase und der Unter-einheit Cox2 der Cytochrom c-Oxidase konnte eine enge räumliche Bezie-hung nachgewiesen werden. Diese ist von der Funktionalität der F1FO-ATP Synthase abhängig. Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte somit folgende Erklä-rung für die Funktion der Untereinheit e der mitochondrialen F1FO-ATP Synthase gefunden werden: Sue dient als Dimerisierungsfaktor der F1FO-ATP Synthase. Die Dimerisie-rung von Sue und damit die Dimerisierung der ATP Synthase ist essentiell für die Stabilisierung des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes und die Funkti-on seiner Komponenten.

Diese Arbeit bietet einen Einblick in die Variabilität von Phagengenomen und die Anpassungsfähigkeit des Systems Phage. Dazu wurde die modulare Architektur der Phagengenome unter verschiedenen Gesichtspunkten analysiert: • In einer natürlichen Phagenpopulation aus Naturisolaten von Salmonella typhimurium wurde die Modulzusammensetzung innerhalb einer bestimmten Gruppe von Genen, der Lysisgenkassette, untersucht. Hierbei existiert prinzipiell ein großes Variationspotential, das jedoch in der Natur bei weitem nicht in dem Maße genutzt wird, wie es auf Grund der Anzahl der existierenden modularen Allele zu erwarten wäre. Offensichtlich spielen auch Selektionsvor- oder -nachteile eines Allels oder einer Allelkombination, der zeitliche Aspekt sowie die jeweilige Isolationsbedingung des Phagen eine Rolle. • Durch Simulation von Superinfektionen unter Laborbedingungen wurde die Häufigkeit untersucht, mit der unterschiedliche superinfizierende Phagen durch Rekombination auf den Genpool eines Prophagen zurückgreifen. In diesem Zusammenhang wird die Rolle der zweiten Immunitätsregion ImmI von P22 untersucht. • Zur Untersuchung der Evolution bei Phagen im klassischen Sinn auf Nukleotidebene wurden die Gene 3 der Verpackungsregion verschiedener lambdoider Phagen analysiert. Insgesamt zeigt sich, dass trotz des enormen Variationspotentials, das den lambdoiden Phagen aufgrund der Vielzahl der nachgewiesenen Allele in den einzelnen Kassetten zur Verfügung steht, insgesamt bis heute nur ein geringer Teil der theoretisch denkbaren Modulkombinationen nachgewiesen werden konnte.

Der Grundgedanke der zur vorliegenden Untersuchung führte, bestand darin, die Strukturen in den Wänden der Testaepidermiszellen repräsentativ für die ganze Tribus Lactuceae mit einem geeigneten, neu zu entwerfenden Präparationsverfahren zu untersuchen und sie damit der Systematik zur Verfügung zu stellen. Wichtig ist in diesem Zusammenhang, nicht nur das Vorhandensein diverser Strukturen in der Testaepidermis zu erkennen, sondern auch ihre Stabilität zu erforschen. Wichtig war auch zu klären, ob die oft sehr unterschiedlichen Strukturen durch Übergangsformen miteinander verbunden werden können – dies war nicht immer möglich. Da der Umfang der Tribus sehr groß ist, war es nötig, sich nach einem ersten Überblick auf einige interessante Bereiche zu konzentrieren, die dann besonders intensiv untersucht wurden. Andererseits wurden bei einigen größeren Gattungen oft nur einige wenige Arten untersucht, da das Umfeld der Gattung keine neuen Erkenntnisse erwarten ließ. Es wurden über 300 Arten von ca. 90 (von insgesamt ca. 100) Gattungen der Lactuceae und weitere 18 Arten anderer Tribus (Liabeae, Arctoteae, Vernonieae) überprüft, wobei von vielen Arten mehr als ein Beleg für die Präparation herangezogen wurde, so dass insgesamt ca. 400 Belege erfolgreich ausgewertet werden konnten. Die gewonnenen Ergebnisse sollen zwar in Bezug zu anderen Arbeiten gesehen werden, jedoch nicht an bisherige Vorstellungen angepasst werden, auch wenn dadurch einige Ungereimtheiten bestehen bleiben müssen. Die Ergebnisse sollen, so wie sie sich aus der Zielsetzung der Arbeit ergeben haben, in erster Linie zur Diskussion anregen. Es wird nicht angestrebt, mit der Untersuchung dieses Merkmalskomplexes die ganze Systematik der Lactuceae zu revolutionieren. Da aber der hohe systematische Wert dieser Strukturen in der Testaepidermis durch diese Untersuchungen bewiesen wurde, sollten diese Daten doch bei zukünftigen Revisionen eine nicht zu vernachlässigende Rolle spielen. Für eine Übersicht der Verteilung der unterschiedlichen Strukturen auf die Tribus wurden schematisch die bei den untersuchten Gattungen gefundenen Strukturen auf das Tribuskonzept von BREMER (1994) aufgetragen. Es konnte gezeigt werden, dass die Strukturen in der Testaepidermis im Allgemeinen äußerst stabil sind, da sie anscheinend durch die Evolution nur wenig beeinflusst werden und damit einen hohen systematischen Wert besitzen. Es bereitet außerdem keine Probleme, auch sehr altes Herbarmaterial zu untersuchen, wodurch der für diese Art der Untersuchung nutzbare Bestand eines Herbars sehr hoch ist. Insgesamt konnten vier Hauptstrukturtypen der Testaepidermiszellwände unterschieden werden (unstrukturierter, fenestrater, retikulater und helicoider Typ) denen man aber eine gewisse natürliche Variationsbreite zugestehen muss. Daneben gibt es einige Strukturtypen, die oft nur für eine einzige Gattung charakteristisch sind (Cichorium –, Taraxacum –, Lapsanastrum –, Krigia wrightii – und Pyrrhopappus – Typ). Bis auf zwei Ausnahmen, Cicerbita alpina (L.) Wallr. und Krigia biflora (Walter) S.F.Blake, konnten keine Variationen der Zellwandstrukturen innerhalb einer Art, geschweige denn innerhalb eines Individuums, festgestellt werden. Die Stabilität der Strukturen über die Gattungsebene hinaus ist bewiesen worden; manchmal sind bestimmte Strukturen für ganze Subtribus charakteristisch. So scheinen die Scorzonerinae auch nach dieser Untersuchung monophyletisch zu sein, da keine andere Gattung innerhalb der Tribus außer der monotypischen Gattung Rothmaleria den helicoiden Typ zeigt. Anderseits scheinen jedoch die Hypochaeridinae heterogen zusammengesetzt zu sein, weil im Wesentlichen ein Teil dem fenestraten Typ, ein anderer Teil dem davon sehr gut zu unterscheidenden retikulaten Typ zuzuordnen ist. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass man im Allgemeinen relativ wenig Unterschiede innerhalb und zwischen den Subtribus Crepidinae, Hieraciinae, Sonchinae und Lactucinae finden kann, obwohl es in diesen Subtribus auch einige Gattungen gibt, welche nicht in das übliche Schema der sonst auftretenden Strukturen passen. Wie Übergänge zwischen den verschiedenen Strukturen zu verstehen sind, konnte gut an der Gattung Scorzonera gezeigt werden. Jedoch ließen sich nicht, wie erwartet, alle Probleme lösen: Es gibt viele Gattungen, bei welchen man aussagekräftige Ergebnisse bekommen kann – bei vielen jedoch muss man sich damit abfinden, dass auch mit diesen Untersuchungen manche Probleme nicht zu lösen sind. Es müssen auch gewisse Variationsbreiten der Merkmale akzeptiert werden. So sind zum Beispiel Unterschiede zwischen nicht oder nur leicht strukturierten Zellwänden nicht sehr gewichtig; ebenso können die verschiedenen Varianten des fenestraten Typs nicht unbedingt als trennendes Merkmal verwendet werden, obwohl sie gewisse Präferenzen für bestimmte Subtribus zu haben scheinen. Einige Gattungen sind durch ihre Strukturen von den anderen Gattungen deutlich isoliert: dazu zählen insbesondere Cichorium, Taraxacum und Lapsanastrum [zusammen mit Youngia japonica (L.) DC.]. Auch die drei Gattungen Krigia [Ausnahme: K. virginica (L.) Willd.], Pyrrhopappus und Phalacroseris kann man nicht mit den restlichen Microseridinae verbinden. In einigen Fällen konnte aufgrund der Strukturen eine Fehlplatzierung aufgedeckt werden: Rothmaleria hebt sich strukturell von den übrigen Catananchinae ganz deutlich ab; möglicherweise handelt es sich bei den drei Gattungen der Catananchinae um Palaeoendemiten, die vermutlich nicht näher miteinander verwandt sind. Auch die Strukturen von Youngia japonica (L.) DC. haben mit den bei anderen Youngia–Arten gefundenen nichts gemein; die Strukturen sind jedoch sehr mit denen der Gattung Lapsanastrum verwandt. Gezeigt werden konnte auch, dass die nun monotypische Gattung Lapsana mit ihren ehemaligen ostasiatischen Arten, der jetzigen Gattung Lapsanastrum, keine Ähnlichkeiten in den Strukturen der Testaepidermis hat. Somit konnte die Spaltung dieser Gattung deutlich befürwortet werden. Die Gattung Taraxacum zeigt strukturell in all den untersuchten Arten dieselben Strukturen, steht damit aber sehr isoliert innerhalb der Crepidinae da. Da es keine Übergänge zu anderen Gattungen der Crepidinae gibt, würde man klassischerweise die Möglichkeit in Betracht ziehen, dass es sich bei Taraxacum um eine ursprünglichere Gattung handeln könnte. Dies widerspricht jedoch einigen molekularbiologischen Untersuchungen, die die Gattung Taraxacum eher für einen jungen Zweig innerhalb der Lactuceae halten. Sehr schwierig zu deuten sind auch die Ergebnisse in der Gattung Krigia, welche dort näher diskutiert wurden. Nach den klassischen Methoden der Systematik würde man nach der Untersuchung dieser Gattung eher ein hohes Alter einräumen, jedoch halten molekularbiologische Analysen die Arten dieser Gattung eher für relativ jung. Die großen genetischen Unterschiede zwischen den einzelnen Arten werden auf eine stark erhöhte Mutationsrate in dieser Gattung zurückgeführt. Somit bietet diese Arbeit auch die Chance, zusammen mit molekularbiologischen Untersuchungen die Möglichkeiten von einerseits modernen morphologisch– anatomischen und andererseits molekularbiologischen Methoden gegeneinander abzuwägen, um eventuell synergistische Effekte zu erzielen. Die Stabilität dieser Strukturen stellt damit automatisch die Frage nach deren Ursache. Haben diese Strukturen eine ökofunktionelle Bedeutung, z. B. einen Einfluss auf das Keimverhalten der Achänen? Es scheint zwar, dass Vertreter der Lactuceae, die in humideren Regionen vorkommen (z. B. Hieracium, Sonchus) eine Tendenz zu wenig Struktur bzw. zum fenestraten Typ haben, an aridere Bedingungen angepasste Vertreter (z. B. Cichorium, Reichardia, Scorzonerinae) eher zu stärker strukturierten Typen haben; jedoch liegen quantitative Untersuchungen hierüber noch nicht vor. Einige Gattungen (z. B. Scolymus, Cichorium, auch Rothmaleria) stehen beispielhaft für das Phänomen, dass es einige wenige Taxa gibt, die anscheinend kaum Verwandtschaft zu anderen Taxa der heutigen Lactuceae zeigen. Dies ist aber eigentlich typisch für ein natürlich gewachsenes System, in dem es immer nur ein kleiner Teil neu entstandener Arten geschafft hat, sich weiter zu entfalten. Viele Zweige sind oft wieder ausgestorben; nur einige wenige ursprüngliche Arten haben es geschafft [vielleicht auch aufgrund ihrer damaligen zufälligen Einnischung in (damals) extreme, aber stabile Habitate (z. B. Trockengebiete)], sich bis in die Neuzeit hinüberzuretten, hatten bisher aber scheinbar kein Potential zu stärkerer Radiation, vielleicht auch aufgrund der speziellen Einnischung. Es ist deshalb nicht ausgeschlossen, dass man es auch bei den Lactuceae mit einigen Palaeoendemiten zu tun hat, die systematisch schwer einzuordnen sind. Ich begrüße deshalb den Ansatz von BREMER (1994), gewisse Gattungen nicht auf Biegen und Brechen in vorhandene Verwandtschaftskreise zu pressen. Erfreulich ist, dass KAMARI & GREUTER (2000) trotz intensiver Untersuchung der neubeschriebenen Gattung Phitosia zu dem Schluss kommen, erst einmal von einer Einordnung in eine Subtribus Abstand zu nehmen und weitere Untersuchungen abzuwarten. Aufgrund der strukturellen „Ausreißer“ in einigen Subtribus sollte man auch das bisherige Subtribuskonzept in einigen Fällen überdenken. Inwieweit entspricht die aktuelle Gliederung der Tribus in Subtribus tatsächlich auch den verwandtschaftlichen Verhältnissen? Wie auch einige anderen Gattungen mit sehr charakteristischen, nur auf sie zutreffenden Strukturen gezeigt haben, könnten bereits ausgestorbene „missing links“ existiert haben. Denn nur selten kann man Bindeglieder finden, die zwischen den verschiedenen Strukturen vermitteln. Andererseits könnten, wenn nur wenige Mutationsereignisse dafür notwendig wären, natürlich auch solche Strukturänderungen schlagartig erfolgen. Diese Arbeit soll mit den hier gewonnenen Ergebnissen Bewegung in etablierte Systemvorstellungen bringen und dazu verleiten, mit anderen Methoden die hier aufgeworfenen Fragen zu beantworten und die hier vorgestellte Methode der Merkmalsgewinnung in anderen Gruppen der Angiospermae zu versuchen.

Während der Abspaltung von der E. coli-Linie wurde durch die Aufnahme der Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 der Grundstein für die Entwicklung vom Kommensalen zum Pathogen gelegt. Die hier kodierten Effektoren vermitteln ebenso wie einige außerhalb von SPI1 gelegene Effektoren (z. B. SopE2) zentrale Virulenzeigenschaften. Zusätzlich zu diesen konservierten Genen gibt es einige variable Effektoren wie SopE, die erst in jüngerer Zeit erworben wurden und auch heute noch durch horizontalen Transfer zwischen verschiedenen Salmonella-Stämmen weitergegeben werden. Sie dienen wahrscheinlich der Optimierung der Wechselwirkung mit dem Wirt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die G-Nukleotidaustauschfaktoren SopE und das zu 69 % homologe SopE2 eine differenzielle Substratspezifität gegenüber den RhoGTPasen Cdc42 und Rac1 besitzen. Während SopE und SopE2 vergleichbar gut an Cdc42 binden, wird Rac1 von SopE deutlich stärker gebunden als von SopE2. Die schwächere Bindung von Rac1 an SopE2 führt in der Folge zu einer deutlich schwächeren Aktivierung von Rac1. Zellkulturversuche haben gezeigt, dass diese biochemischen Unterschiede zumindest in einigen Zelltypen zu unterschiedlichen Antworten (z. B. Morphologie des Aktinzytoskeletts) führen. Es ist zu vermuten, dass die Unterschiede der molekularen Eigenschaften von SopE und SopE2 einen Selektionsvorteil für S. typhimurium-Stämme darstellen, die beide SopE-Homologe besitzen. Bei der Analyse der Kristallstruktur des SopE ⋅Cdc42-Komplexes zeigte sich, dass SopE eine von der Struktur zellulärer GEFs unabhängige Lösung gefunden hat, den Nukleotidaustausch an RhoGTPasen zu katalysieren. In einer Mutagenesestudie konnten diejenigen Aminosäuren identifiziert werden, die das katalytische Zentrum von SopE bilden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen dafür, dass das katalytische Zentrum von SopE durch das 166 GAGA 169 -Motiv repräsentiert ist. Dieses Motiv weist keine Ähnlichkeiten zur katalytischen DH-Domäne eukaryontischer Rho-GEFs auf. Das deutet darauf hin, dass SopE durch konvergente Evolution entstanden sein muss. In ähnlicher Weise wie in dieser Arbeit könnten auch in Eukaryonten durch funktionelle Analysen noch weitere, bisher unbekannte GEF-Familien identifiziert werden, deren Untersuchung das Verständnis der zellulären Signaltransduktionswege weiter fördern könnte.

The attelabid genus Euops SCHOENHERR is demonstrated to constitute a monophyletic group based on the following synapomorphies: 1) mycetangia of the female for storage of fungus spores consisting of three different reservoirs and associated setose structures, 2) a patch of modified setae of the female venter, usually associated with exocrinous glands, 3) enlarged eyes. Systematics, evolutionary history and biology of Curculionoidea and Attelabidae are summarized. The "Papuan region" is treated herein as comprising the provinces of Maluku and Irian Jaya of Indonesia, Papua New Guinea, and the Solomon Islands. A summary of the natural history of this region is given. Approximately two years were spent in the field to supplement the sparse material available from museum collections for this study. Selected, monophyletic species groups of Euops are treated in a monographic way: the spinosus-group (ten species described as new), the pygmaeus-group (one species redescribed, 13 species described as new), the quadrifasciculatus-group (four species redescribed, six species described as new), the simulans-group (three species redescribed, 19 species described as new), and the subgenus Neosynaptops (two species redescribed, seven species described as new). These monographs are attached to the present summary as appendices. New standards are proposed for taxonomic descriptions of Euops species: the transfer apparatus of the male genitalia proved to be of critical importance for the diagnosis of species. Other characters of male and female genitalia, of the mouthparts, the metanotum, and the proventriculus are useful in phylogenetic reconstruction and in the diagnosis of species groups. These and other characters are described for the first time. Methods for their appropriate preparation and examination by SEM and light microscopy are proposed. The literature published on Euops is reviewed and a bibliography is given. At the commencement of this study (1998), 134 species and 10 subspecies of Euops were recognized as valid worldwide. A synopsis of Papuan Euops is given. Before the commencement of this study 24 valid species of Papuan Euops, based on inadequate descriptions, were known to science. These are redescribed to meet the new standards. Where necessary, lectotypes are designated. One species (E. picipes VOSS) is placed into synonymy. One subspecific name (Euops femoralis f. ruficornis Voss) is elevated to species level. 52 species are added by formal descriptions. At present (2002), 76 described species are reported for the Papuan region, constituting 40 % of the world fauna (189 described species). Another 108 undescribed species from the Papuan region are listed. These could not be described herein but they will be so in later publications. Thus, at present 184 Euops species are known from the Papuan region constituting 58 % of the world fauna (320 ascertained species). Cladistic analyses are performed for each of the monographed species groups. An overall analysis is done using selected species. Five other genera of Attelabidae were included as outgroup representatives. The monophyly of the recognized species groups of Euops was confirmed except for the simulans-group which is difficult to define at its base. A clade comprising Apoderus, Lamprolabus and Euscelophilus is supported mainly by derived characters of the prementum, plesiomorphic in Attelabus and in Euops. It is predicted that the rank of the "Apoderinae" will have to be downgraded after a phylogenetic analysis of the Attelabidae. The worldwide distribution of Euops is a paleotropical one. This could reflect an ancient Gondwanic pattern or a more recent one through rapid dispersal. Evidence for and against each hypothesis is discussed. Within the Papuan region most species groups of Euops are strictly confined to the area of the Sahul shelf. Off-shore islands, such as Maluku or the Solomons, have a depauperate fauna. The areas of endemism observed are usually not compatible with geological terrains. Rapid dispersal overland is postulated. The Philippines and Sulawesi adjoining to the West have a speciose but uniform fauna, belonging exclusively to the subgenus Suniops. The fauna of Maluku consists of equal parts of Suniops species arrived from the west and of other species of Papuan Euops groups from the east. There is little overlap between the Papuan fauna of Euops and a moderately rich Australian one. The origins of the highly secluded Papuan fauna of Euops remain obscure. Although Euops occupies an altitudinal range from sea level to 3535 m, there is a maximum of diversity between 700 m and 800 m altitude. Diversity remains at a high level to an altitude of 1600 m or further, with an increase in the endemism of species. This pattern is different from groups such as birds and ants, whose diversity decreases evenly along an altitudinal gradient. It is suggested that this fact should be considered in priority assessments for conservation measures. A table of the association with host plants is given. Species of the pygmaeus-group are reported to feed exclusively on the fresh leaf flush of Nothofagus. Species of its presumed adelphotaxon, the quadrifasciculatus-group, are recorded from Myrtaceae. Such a pattern is unusual among phytophagous insects and different scenarios for a host switch are discussed. Preliminary data on the association with fungi are provided. Fungi isolated from the mycetangia of different Euops species exhibit different mycological characters (e.g. coloration) and presumably belong to different species. They all belong to the genus Penicillium. It was found that spores obtained from the mycetangia can be stored for extended periods in sterilized water. Future studies should make use of this fact to export fungus samples and to cultivate them under more favourable laboratory conditions than usually available in tropical countries. A trend curve of the discovery of Euops species in the Papuan region is discussed. It reveals that the saturation phase is not yet reached. It is estimated that the area studied harbours at least 300 species of Euops, making it the most diverse region for this genus in the world.