Nicht-viraler Gentransfer in respiratorische Epithelzellen

In der vorliegenden Arbeit wurden A549 Zellen, als Modell für
Epithelzellen der Lunge, mittels nicht-viralen Gentransfers mit
pDNA bzw. mRNA kodierend für das sekretorische Protein mSEAP
transfiziert. Die höchste Transgen-Expression konnte durch den
mRNA-vermittelten Gentransfer erreicht werden, unabhängig von dem
verwendeten Genvektor. Die Messung der Aktivität von mSEAP im
Medium nach mRNA Transfektion mit Liposomen ergab eine
Konzentration von maximal 1 ng/50 µl nach 24h, 5 ng/50 µl nach 48h
und 7,5 ng/50 µl nach 72h. Für die pDNA Transfektion ergaben sich
Konzentrationen für mSEAP von 400 pg/50µl nach 24 h, 700 pg/50 µl
nach 48 h und 800pg/50 µl nach 72 h. Es konnte gezeigt werden, dass
es bei der Verwendung von mRNA - vor allem nach Transfektion mit
dem kationischen Lipid DMRIE-C - zu einer 9-fachen Steigerung der
Proteinsekretion in das Medium der kultivierten Zellen kommt.
Weiterhin waren ca. 45% der Zellen bei Verwendung von Lipoplexen
mit DMRIE-C/mRNA im Gegensatz zu 15% nach Transfektion von pDNA
positiv für mSEAP. Nach Transfektion der mRNA mit dem kationische
Polymer b-PEI konnten Konzentrationen von mSEAP im Medium von 10pg,
15pg und 50pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h gemessen werden.
Für die Magnetofektion von mRNA ergeben sich Mengen von ca. 150pg,
250pg und 400pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h. Dies
entspricht im Vergleich zur Verwendung von pDNA einer 3,3-fachen
Steigerung nach Transfektion von mRNA/b-PEI Komplexen, mit der
Methode der Magnetofektion einer 4-fachen Steigerung der
Proteinexpression. Die erhöhte Proteinexpression kann auf die
intrazelluläre Barriere des nukleären Imports von pDNA, welche bei
der Verwendung von mRNA nicht notwendig ist, zurückgeführt werden.
Die Unterschiede des endosomalen „Escape“ - und dem daraus
resultierenden Verhältnis freier mRNA zu komplexierter mRNA im
Zytoplasma - könnte eine Erklärung für die geringere Effizienz von
Polyethyleniminen im Vergleich zu kationischen Lipiden bei dem
Transfer von mRNA sein. Weiterhin konnte mit diesem Modell gezeigt
werden, dass humane alveolare Epithelzellen des Adenokarzinoms
(A549) - als Modell für humane Lungenepithelzellen - imstande sind,
zellfremde Proteine nach Transfer genetischen Materials zu
translatieren und zu sezernieren. Eine pulmonale Applikation von
therapeutischen Genen kodierend für sekretorische Proteine mittels
Vernebelung könnte als nicht-invasive Methode z.B. für die Therapie
von Hämophilie A oder B eine Rolle spielen. Weiterführende in vivo
Versuche könnten Aufschluss über Serumkonzentrationen des
sekretorischen Proteins nach pulmonaler Applikation bringen. Die
Verwendung von mRNA als therapeutischem genetischem Material zeigt
hierbei Vorteile gegenüber von pDNA, aufgrund der gesteigerten
Transgen -Expression, der verminderten Dosis an Transferreagenz,
sowie dem fast gänzlich ausgeschlossenen Risiko der insertionellen
Mutagenese.