Gallensäuren stellen potente Signalmoleküle dar, die schon in
geringen mikromolaren Konzentrationen, wie sie beim Menschen im
Serum beobachtet werden, zentrale Leberzellfunktionen auf
transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene beeinflussen.
Die hydrophoben und potentiell toxischen Gallensäuren
Lithocholsäure (LCA) und Chenodeoxycholsäure (CDCA) induzieren
Apoptose und Cholestase, während hydrophile Gallensäuren
hepatoprotektiv wirken können. Unter ihnen ist die antiapoptotisch
und anticholestatisch wirksame Ursodeoxycholsäure (UDCA) von
besonderer Bedeutung. UDCA stellt derzeit das einzige wirksame
Therapeutikum bei chronischen cholestatischen Leberkrankheiten dar.
Die vorliegende Arbeit untersuchte die Bedeutung intrazellulärer
Signaltransduktionswege für die choleretischen,
(anti-)cholestatischen und (anti-)apoptotischen Wirkungen
physiologischer Gallensäuren in verschiedenen experimentellen
Modellen. Hauptziel der Arbeit war die genauere Charakterisierung
(i) der für den klinisch bedeutenden anticholestatischen Effekt des
Taurinkonjugats der Ursodeoxycholsäure (TUDCA) verantwortlichen
Signaltransduktionswege, und (ii) der zentralen Stellung von
PI3-Kinasen in der intrazellulären Signalvermittlung der
biologischen Effekte hydrophiler und hydrophober Gallensäuren. Im
Modell der isoliert perfundierten Rattenleber untersuchten wir die
anticholestatische und hepatoprotektive Wirkung der TUDCA in der
intakten Leber unter Einsatz pharmakologischer Enzyminhibitoren.
Als Leberfunktionsparameter dienten quantitativer Gallenfluß,
Sekretion des Modellsubstrats der Konjugatexportpumpe Mrp2, GS-DNP,
in die Galle und als Marker der Leberzellschädigung die
hepatovenöse LDH-Freisetzung. Simultane Hemmung der cPKCa und der
PKA, nicht aber Hemmung von cPKCa oder PKA allein antagonisierte
bei Taurolithocholsäure (TLCA)-induzierter Cholestase die
protektive Wirkung der TUDCA. Gallenfluß und GS-DNP-Sekretion waren
unter gleichzeitiger Hemmung beider Signalwege signifikant
reduziert, wohingegen die LDH-Freisetzung deutlich erhöht war. Die
Ergebnisse zeigen, dass der posttranskriptionell vermittelte
anticholestatische Effekt der TUDCA im etablierten Modell
TLCA-induzierter Cholestase durch einen kooperativen cPKC- und
PKA-abhängigen Signalweg vermittelt wird. Mitogenaktivierte
Proteinkinasen Erk1/2- und p38-abhängige Signalwege hingegen, die
als Vermittler von TUDCA-induzierter Cholerese unter
nicht-cholestatischen Bedingungen beschrieben wurden, waren im
untersuchten Modell ohne Bedeutung für die anticholestatische
Wirkung der TUDCA. Mit Hilfe der neu etablierten Biotinylierung von
Membranproteinen konnten wir in Ntcp-transfizierten humanen
Hepatomzellen (HepG2-Ntcp) zeigen, dass TUDCA unter Cholestase die
Insertion von MRP2 in die Hepatozytenmembran anregt. Dieser für die
klinische Wirksamkeit der (T)UDCA potentiell bedeutende und im
Tiermodell von uns vorbeschriebene Wirkmechanismus konnte damit
erstmals in einem humanen Modell nachvollzogen werden. Ein weiterer
in vitro Ansatz untersuchte die Phosphorylierung von aus HepG2-Ntcp
immunopräzipitiertem MRP2 durch die als Gallensäureneffektoren
diskutierten Proteinkinasen cPKCa, nPKCe und PKA. Alle drei
Proteinkinasen phosphorylierten, durch den PKC/PKA-Inhibitor
Staurosporin hemmbar, MRP2. Diese Phosphorylierung könnte, wie für
die Gallensäurentransporter BSEP und NTCP bereits gezeigt, Einfluss
auf Aktivität und Membraninsertion von MRP2 haben. Der
funktionellen Bedeutung der PI3-Kinasen, welchen in den bisher
entschlüsselten Signalwegen sowohl hydrophober/toxischer wie auch
hydrophiler/protektiver Gallensäuren eine zentrale Rolle
zugesprochen worden war („PI3-Kinasen-Paradoxon“), galten unsere in
vitro Untersuchungen zur Aktivität der Isoformen der Klasse I
PI3-Kinasen p110a, p110b und p110g nach Stimulation von primären
Rattenhepatozyten mit TLCA, GCDCA, TCA und TUDCA in einem neu
etablierten isoformspezifischen Kinaseassay. Dabei zeigte sich für
jede Gallensäure ein für sie spezifisches Aktivierungsmuster
unterschiedlicher PI3-Kinase-Isoformen. PI3-Kinase p110g wurde
dabei spezifisch durch die cholestatisch und apoptotisch wirkenden
Gallensäuren TLCA und GCDCA aktiviert. In HepG2-Ntcp-Zellen
untersuchten wir daher die Bedeutung von p110g für
Gallensäuren-induzierte Apoptose nach deren pharmakologischer
Hemmung bzw. nach Transfektion mit siRNA gegen p110g. Die
apoptotische Wirkung u.a. der Gallensäuren TLCA und GCDCA war unter
beiden Methoden der p110g-Antagonisierung deutlich reduziert, wie
sowohl in einem Caspase3/7-Assay als auch morphologisch evaluiert.
Gallensäuren-unabhängige Apoptose, durch Etoposid bzw. TNFa
ausgelöst, war p110g-unabhänig. Die Bedeutung der Aktivierung der
PI3-Kinase-Isoform p110a durch TUDCA ist durch weitere
experimentelle Untersuchungen zu klären. Die Erkenntnisse der
vorliegenden Arbeit tragen zum Verständnis der komplexen
Signalgebung im Rahmen cholestatischer Leberschädigung und der
therapeutischen Wirkung der (T)UDCA bei und sind damit für die
Entwicklung neuer Therapiestrategien bei cholestatischen
Leberkrankheiten potentiell von Bedeutung.
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