Chemokinrezeptorexpression im kutanen T-Zell Lymphom und gezielte Beeinflussung der chemokinvermittelten Zellrekrutierung

Die Rekrutierung von Zellen ist ein komplexer, in mehreren
Schritten ablaufender Mechanismus, der eine zentrale Bedeutung für
zahlreiche biologische Prozesse, wie z.B. Entzündung,
Transplantatabstoßung, Tumormetastasierung und Stammzell¬migration
hat. Die Migration von Zellen aus dem Blutstrom oder einem
Reservoir in ein Zielgewebe bzw. Zielorgan und umgekehrt wird durch
zahlreiche spezifische und unspezifische Reize ausgelöst und
orchestriert. Dies erfolgt zu einem großen Teil durch von
Chemokinen regulierte Mechanismen. Chemokine sind chemotaktische
Zytokine, welche an spezifische auf der Zelloberfläche exprimierte
Chemokinrezeptoren (CCR) binden. Zellen mit entsprechenden
Chemokinrezeptoren wandern entlang eines Chemokingradienten zum
jeweiligen Ziel, z.B. einem Entzündungsherd oder einem Zielorgan.
Erstes Ziel dieser Arbeit war die Analyse der
Chemokinrezeptorexpression im kutanen T-Zell Lymphom (CTCL), einem
Non-Hogkin-Lymphom mit primärer kutaner Manifestation. Der Nachweis
von Chemokinrezeptoren erfolgte in vitro mit der
Polymerasekettenreaktion (PCR), der Durchflusszytometrie und mit
Migrations-versuchen. Der Chemokinrezeptornachweis auf
Hautschnitten von CTCL-Patienten erfolgte mit der Immunhistochemie.
Erstmals konnte der hautassoziierte Chemokinrezeptor CCR10 im
Rahmen des CTCL nachgewiesen werden. Außerdem gelang der Nachweis
der Chemokinrezeptoren CCR4, CCR7 und CXCR3 in Hautschnitten und
Lymphknotenbiopsien. CXCR3 wurde erstmals im Sezary Syndrom, einer
fortgeschrittenen und aggressiven CTCL-Unterform, beschrieben. In
der Immunhistochemie wurde die stärkste CCR10-Expression in Sezary
Syndrom-Hautschnitten festgestellt. In Biopsien von befallenen
Lymphknoten zeigte sich ein auffälliges CCR10-Verteilungsmuster:
CCR10-positive Zellen wurden im Lymphsinus nachgewiesen, drangen
aber nur vereinzelt in den Lymphknoten ein. In peripheren,
nicht-kutanen Lymphomen wurde CCR10 nicht nachgewiesen und ist
somit vermutlich exklusiv auf dem primär kutanen CTCL exprimiert.
Es ist davon auszugehen, dass CCR10 den Epidermotropismus vor allem
in aggressiveren Stadien reguliert. Die Bedeutung von CCR10 für die
lymphatische Metastasierung des CTCL ist noch nicht geklärt. CCR10
könnte in der Zukunft als Faktor für die klinische Einstufung des
CTCL oder als Ziel für eine gezielte Tumortherapie dienen. Die
gezielte Tumortherapie ist u.a. mit Chemokinantagonisten möglich.
Sie erlauben die gezielte Beeinflussung der chemokingesteuerten
Rekrutierung von Leukozyten, Stammzellen oder Tumorzellen. Deshalb
wurde ein membranbindender Antagonist des Chemokins CCL5, als
potentielles Agens für die lokale Therapie von Tumoren oder von
Transplantatabstoßungen, generiert. Das Chemokin CCL5 und seine
Rezeptoren spielen in der akuten Transplantatabstoßung und in der
Tumorprogression, z.B. im Mammakarzinom, eine zentrale Rolle. Der
CCL5-Antagonist Met-RANTES inhibiert in
Transplantatabstoßungsmodellen die Rekrutierung von Leukozyten. Der
akute Entzündungsprozess und der daraus resultierende chronische
Gefäßschäden werden so vermindert. Auch in einem Tumormodell ist
ein Effekt auf die lokale Tumorprogression wahrscheinlich. Der in
dieser Arbeit hergestellte CCL5-Antagonist Met-RANTES(Dimer)-GPI
soll eine lokale Therapie ohne systemische Nebenwirkungen
ermöglichen. Durch die erstmals beschriebene Bindung eines
Chemokins oder Chemokinderivats an einen
Glykosylinositolphosphatidyl (GPI)-Anker soll der Antagonist
effektiv in die Zellmembranen von Endothelzellen inkorporiert
werden, länger auf dem Endothel verbleiben und die benötigte
Proteinmenge vermindern. Zunächst wurde durch die Erweiterung des
signalgebenden N-Terminus von CCL5 der CCL5-Antagonist Met-RANTES
generiert. Ein Aminosäureaustausch erzeugte ein dimerisierendes
Molekül, welches einfacher als die zur Polymerisierung neigende
Wildform zu isolieren war. Das Protein wurde mit der PCR mit einem
GPI-Anker fusioniert und in Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen
subkloniert. Met-RANTES(Dimer)-GPI wurde erfolgreich aus den
CHO-Zellen isoliert und mit der Säulenchromatographie gereinigt. In
in vitro-Versuchen wurde Met-RANTES(Dimer)-GPI effektiv in die
Oberfläche von humanen Endothelzellen reinkorporiert und hemmte die
transendotheliale Migration von Monozyten, welche bei der
Transplantat¬abstoßung und bei der Tumorprogression eine wichtige
Rolle spielen. Mit Met-RANTES(Dimer)-GPI präperfundierte
Transplantate zeigen möglicherweise einen geringeren vaskulären
Schaden bei der akuten Transplantatabstoßungsreaktion. Im
Tumormodell soll eine Hemmung der Tumorinfiltration durch
Monozyten, welche eine beschleunigte Tumorprogression verursachen,
erreicht werden. Im Vergleich zu nicht GPI-gebundenen
CCL5-Antagonisten würde eine lokale fokussierte Therapie ermöglicht
und eine eventuell geringere zu applizierende Proteinmenge bei
längerer Verweildauer erzielt. Die Ergebnisse dieser Arbeit
erlauben zunächst einen genaueren Einblick in die Pathogenese des
CTCL. Der Chemokinrezeptor CCR7 wird vor allem von
fortgeschrittenen Formen mit lymphatischer Infiltration exprimiert.
CCR10 wird erstmals im Zusammenhang mit dem CTCL beschrieben und
vor allem von fortgeschrittenen Unterformen exprimiert. Desweiteren
wurde ein membranbindender Chemokinantagonist hergestellt. Erstmals
wird die Kombination eines Chemokins oder Chemokinderivats mit
einem GPI-Anker beschrieben. Der Antagonist erlaubt eine hohe
lokale Applikation ohne systemische Zirkulation des Agens. Mögliche
Einsatzgebiete sind die gezielte Tumortherapie oder die Behandlung
der Transplantatabstoßung.