Modulation inflammatorischer Prozesse mittels GPI-verankerter Chemokin-Analoga

Die direkte Rekrutierung von Effektor-Leukozyten aus dem peripheren
Blut in interstitielle Gewebe wird in Teilen von chemotaktischen
Zytokinen (Chemokinen) und ihren Rezeptoren kontrolliert. Diesen
Schritt zu blockieren stellt ein wichtiges Instrument der Kontrolle
einer Entzündungsreaktion dar. Das proinflammatorische Chemokin
CCL5/RANTES ist ein chemotaktisches Agens das über die CCR1-, CCR3-
und CCR5-Rezeptoren von „Gedächtnis“-CD4+ T-Zellen, Monozyten und
Eosinophile wirkt. Es wird von vielen Gewebetypen im Laufe einer
Entzündungsreaktion produziert. Die CCR1- und CCR5-Aktivierung
konnte als wichtiger Faktor für die Entstehung von akuten
Abstoßungsreaktionen mittels in-vitro und in-vivo Experimenten
identifiziert werden. Durch metRANTES, dem um ein Methionin
verlängerten CCL5-Protein welches einen potenten CCR1 und CCR5
Rezeptor-Antagonisten darstellt, konnte eine Abstoßungsreaktion
effektiv reduziert und in Kombination mit anderen Substanzen fast
völlig unterdrückt werden. Weitere Modifizierungen am
metRANTES-Protein verändern die für CCL5 charakteristische
Multimerisierung und seine GAG-Bindungskapazität. Das „protein
engineering“ genannte Verbinden eines Proteins mit einem GPI-Anker
bietet die Möglichkeit, durch Reintegration in die
Oberflächenmembranen unterschiedlicher Gewebe, Proteine an
definierte Lokalisationen zu bringen. Dort können sie, dank der
Fähigkeit, sich in die Membranen anderer Zellen wieder einzufügen
und die ursprüngliche Funktion wieder anzunehmen (Premkumar,
Fukuoka et al. 2001; Djafarzadeh, Mojaat et al. 2004), längere Zeit
als soluble Chemokine verbleiben. In dieser Arbeit wurden
unterschiedliche CCL5-Analoga, sowie ein virales Chemokin-Analogon,
um eine GPI-kodierende Sequenz erweitert und in einen
Expressionsvektor subkloniert. Mittels Transformation wurden sie in
Chinese Hamster Ovarial-Zellen (CHO-Zellen) exprimiert. Ihre
Expression an der Zelloberfläche konnte dank der FACS-Analyse
ermittelt werden und in einem gleichen Schritt wurde die Fähigkeit
verschiedener anti-RANTES Antikörper, an die N-terminal veränderten
Proteine zu binden, analysiert. Diese membranverankerten Proteine
wurden in höchstmöglicher Konzentration aus der Einheitsmembran
extrahiert und in einem weiteren Schritt durch unterschiedliche
Chromatographieverfahren isoliert. Dabei wurde die
Heparin-Chromatographie gefolgt von einer Size-exclusion
Chromatographie als Methode mit der besten Reinheit und Ausbeute
identifiziert. Zuletzt wurden die gereinigten, GPI-verbundenen
CCL5-Analoga mit „einfachen“ CHO-Zellen, sowie humanen
mikrovaskulären Endothelzellen inkubiert und ihre Reintegration an
der Zelloberfläche bewiesen. Die in dieser Arbeit hergestellten
GPI-gebundenen RANTES-Antagonisten eröffnen die Möglichkeit, in
weiteren in-vitro, sowie in-vivo Versuchen, die biologische
Aktivität dieses Chemokins gezielt zu blockieren oder (in einem
analogen Verfahren) zu verstärken. Dadurch kann die Bedeutung des
RANTES-Proteins in der Transplantatabstoßung, sowie in weiteren
Entzündungsreaktionen herausgearbeitet werden. Durch Perfusion des
Organs vor der Transplantation mit dem GPI-verbudenen
Chemokin-basierenden Antagonisten, erhofft man sich die Integration
des GPI-Ankers in die mikrovaskuläre Endothelialzellmembran und
somit die Präsentation des Antagonisten für die zirkulierenden
Leukozyten. Ein solches Vorgehen könnte dem Gefäßsystem während der
kritischen ersten Tage nach der Transplantation Schutz bieten und
somit signifikant die akute vaskuläre Verletzung, die mit einer
Verschlechterung der Überlebensprognose verbunden ist, vermindern
(Notohamiprodjo, Djafarzadeh et al. 2005).