Immunmodulatorische Wirkungen von gerinnungsaktiven Substanzen auf die LPS-induzierte Zytokinsynthese von Monozyten

Blutgerinnung und Entzündung sind zwei stark miteinander verknüpfte
Vorgänge im menschlichen Körper. Es ist gängige Meinung, dass
während einer Sepsis die systemische Entzündung unweigerlich zu
einer Aktivierung des Gerinnungssystems und einer gleichzeitigen
Inhibition des blutgerinnungshemmenden Systems sowie der
Fibrinolyse führt. Durch die massive Aktivierung der Gerinnung
kommt es zu einer sogenannten Verbrauchskoagulopathie, bei der vor
allem die antikoagulatorische Kapazität stark reduziert ist. So ist
die Aktivität von ATIII und APC, zwei der wichtigsten körpereigenen
Gerinnungsinhibitoren, während der Sepsis erheblich vermindert.
Rekombinant hergestelltes APC hat als Xigris seit 2002 die
europäische Zulassung zur Behandlung der schweren Sepsis. In einer
klinischen Studie der Phase 3 wurde eine Reduktion der 28-Tage
Sterblichkeit durch die Gabe von APC bei Patienten mit schwerer
Sepsis festgestellt. Im Gegensatz zu APC zeigte ATIII in einer
Studie der Phase 3 an Patienten mit schwerer Sepsis keine Reduktion
der 28-Tage Sterblichkeit. Es ist generell akzeptiert, dass das
septische Mehrorganversagen durch die systemische Immunantwort des
Organismus auf eine Infektion und die daraus resultierende
überschießende systemische Freisetzung inflammatorischer Mediatoren
vermittelt wird. Die Freisetzung dieser Mediatoren erfolgt unter
anderem aus Monozyten. Durch den entzündlichen Stimulus während
einer Verletzung oder Sepsis wird auf Monozyten neben der
Freisetzung von Zytokinen auch TF induziert, der Rezeptor und
Aktivator von FVII. Der Komplex aus TF und FVIIa stellt den
Anfangspunkt der exogenen Gerinnung dar. Seit einigen Jahren wird
rFVIIa als „rescue therapy“ zur Kontrolle schwerer traumatisch
verursachter Hämorrhagien diskutiert. Dabei soll durch die Gabe von
rFVIIa die Gerinnung spezifisch am Ort der Verletzung verstärkt
werden. Da durch das Trauma und die damit verbundene
Entzündungsreaktion Monozyten vermutlich TF exprimieren, stellen
auch diese Zellen einen potentiellen Angriffspunkt für rFVIIa dar.
Das Ziel der vorgelegten Arbeit war, mögliche gerinnungsunabhängige
immunmodulatorische Eigenschaften dieser, in der Intensivmedizin
verwendeten, körpereigenen Substanzen zu untersuchen. Im Speziellen
sollte die Auswirkung der Pro- bzw. Antikoagulantien auf die
LPS-induzierte Zytokinfreisetzung von Monozyten untersucht werden,
ein wichtiger Bestandteil in der Entstehung von Sepsis und MODS.
Dazu wurde ein Versuchsmodell mit einer humanen, monozytären
Zelllinie, MonoMac6, etabliert. Die Produktion von IL-1β, IL-8 und
TNFα wurde intrazellulär mit Hilfe der Durchflusszytometrie
bestimmt. Im Zellkulturüberstand wurden die Konzentrationen von
IL-1β, IL-8, IL-10 und TNFα mit einem Luminex-100 System gemessen.
Zusätzlich wurde für rFVIIa der Einfluss auf die LPS-induzierte
IL-1β-, IL-6-, IL-8- und TNFα-Synthese von CD14+ Monozyten in PBMCs
durchflusszytometrisch erfasst. In der vorgelegten Arbeit konnte
eine limitierende Wirkung von APC und ATIII auf die LPS-induzierte
Zytokinproduktion von Monozyten festgestellt werden. APC
verminderte die IL-1β-, IL-10- und TNFα-Ausschüttung signifikant,
wobei Überstandsmessungen die eindeutigsten Ergebnisse zeigten. Der
Effekt von ATIII ließ sich durchflusszytometrisch besser bestimmen,
als aus dem Überstand. Es zeigte sich eine signifikant verminderte
LPS-induzierte IL-1β- und TNFα-Produktion der Monozyten. Zusätzlich
wurde der Effekt von Heparin auf die ATIII-Wirkung untersucht, da
es mehrere Hinweise auf eine negative Beeinflussung der
ATIII-Therapie in der Sepsis durch gleichzeitige Gabe von Heparin
gibt. In der vorgelegten Arbeit konnte interessanter Weise kein
antagonisierender Effekt von Heparin auf die immunologische Wirkung
von ATIII festgestellt werden. Neben dem positiven Effekt durch die
Wiederherstellung der Antikoagulation während der Sepsis, kann APC
auch zur Wiederherstellung des Gleichgewichts zwischen Pro- und
Antiinflammation beitragen. APC vermindert sowohl die Synthese
pro-, als auch die antiinflammatorisch wirkender Mediatoren, was
eine Erklärung für die Wirksamkeit bei dem sehr heterogenen
Kollektiv der Sepsispatienten sein könnte. ATIII reduziert nach
unseren Ergebnissen lediglich die Synthese der proinflammatorischen
Zytokine TNFα und IL-1β, nicht aber die von IL-10. Geht man davon
aus, dass APC deshalb wirksam ist, weil es sowohl eine
überschießende Pro- als auch Antiinflammation dämpfen kann, wäre
das eine Erklärung für das Fehlen des klinischen
Wirksamkeitsnachweises für ATIII bei Patienten mit schwerer Sepsis.
Für rFVIIa ergab sich ein messbarer, aber nicht eindeutig
charakterisierbarer immunmodulatorischer Effekt auf die
LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten. Bei MonoMac6 Zellen
zeigte sich ein leicht begrenzender Effekt auf die IL-8- und
TNFα-Produktion. Die Behandlung von PBMCs mit rFVIIa ergab keine
veränderte LPS-induzierte Zytokinfreisetzung von CD14+ Monozyten.
In verschiedenen Versuchsabläufen wurden MonoMac6 Zellen zur
Erhöhung der TF-Expression vor der Inkubation mit rFVIIa mit TNFα
oder LPS behandelt. Dabei zeigte sich je nach Messmethode und
Vorbehandlung außer einer geringen Steigerung der TNFα-Synthese
LPS-vorbehandelter Monozyten kein Effekt. Zusätzlich wurde eine
Transfektion der MonoMac6 Zellen mit TF durchgeführt. In Versuchen
mit dieser Zelllinie ergab sich eine erhöhte TNFα-Synthese unter
rFVIIa-Einfluss. Dieses Ergebnis ist jedoch mit Vorsicht zu
betrachten, da die Reaktion der transfizierten Zellen auf LPS
alleine im Kontrollexperiment nicht der des Wildtyps entsprach.
Eine rFVIIa-induzierte Bildung von Thrombin kann ebenfalls in die
Immunreaktion eingreifen, dies illustriert die in der vorgelegten
Arbeit unter Thrombineinfluss gemessene, stark verminderte
LPS-induzierte IL-10 Ausschüttung. Allerdings konnte der direkte
immunmodulatorische Effekt von rFVIIa weder mit der Komplexbildung
aus TF und rFVIIa noch mit der von rFVIIa vermittelten Produktion
von Thrombin in Verbindung gebracht werden. Die immunmodulatorische
Wirkung von rFVIIa auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von
Monozyten konnte mit den in der vorgelegten Arbeit verwendeten
Modellen nicht abschließend geklärt werden und lässt noch viel Raum
für weitere Untersuchungen. Transfektionsversuche mit anderen
monozytären Zelllinien oder die Selektion von TF-exprimierenden
Immunzellen aus kritisch kranken Patienten wären mögliche
Versuchsansätze für die Zukunft. Auch ein geeigneter Stimulus zur
Induktion von TF auf isolierten humanen Monozyten, der nicht
gleichzeitig die Zytokinsynthese anregt, würde vielversprechende
Möglichkeiten bieten.