Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv
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Zooplankton populations which perform diel vertical migration (DVM) only spend the night in surface water layers but migrate downwards into the lower water layers during the day. The intention of this study was to investigate effects of DVM of Daphnia on phytoplankton dynamics and Daphnia life history parameters in a lake. I conducted field and laboratory experiments in which I compared ‘migration’ with ‘no-migration’ situations. It is generally assumed that phytoplankton communities in the epilimnion of stratified lakes profit from the presence of DVM. This might be caused by less grazing due to intermittent grazing and/or less grazing due to lower population densities of migrating Daphnia populations (as they migrate into the colder, lower hypolimnion during the day which leads to a lower temperature-dependent population growth). In a first laboratory experiment I showed that an enhanced phytoplankton biomass could develop under a migration regime solely due to intermittent grazing. I further showed that edible phytoplankton species with higher intrinsic growth rates benefited more from intermittent grazing than edible species with lower intrinsic growth rates. Field experiments also indicated that phytoplankton biomass in the epilimnion was higher when subject to a migrating zooplankton population and that additionally different phytoplankton community compositions arose from different migration regimes (‘migration’/’no-migration’). For example edible algae were at an advantage when zooplankton migrated, whereas large, inedible algae species had an advantage when zooplankton populations did not migrate. In an additional laboratory experiment I also showed that these changes in phytoplankton composition had strong feedback effects on life history parameters of daphnids and that food conditions experienced by migrating daphnids were advantageous. In a further laboratory experiment I exposed two Daphnia species to either constant or regularly changing temperature regimes to study whether a fluctuating temperature regime – as experienced by migrating daphnids – implies costs for daphnids. Somatic growth rates of juvenile Daphnia in the regularly changing temperature regime were almost as low as under constant low temperature conditions indicating that a regular change in temperature involves high costs. The results of my study indicate that DVM has a strong modulating effect on zooplankton-phytoplankton interactions in a lake.
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Stress plays a role in the etiology of anxiety and mood disorders. To investigate these disorders, animal models are used, many of which incorporate a stressful stimulus. Especially psychological stressors may resemble stressful situations that in humans can lead to pathology. The study, described in this thesis, was undertaken to elucidate the effects the psychological stressor predator exposure has on behaviour, on neurochemical parameters in various brain regions and on neuroendocrine parameters in mice. Therefore mice of several strains were exposed to a rat. Also the effects of repeated predator exposure were assessed. Rat exposure lead to risk assessment behaviour, followed by coping strategies. Extracellular levels of serotonin and its metabolite were higher than baseline levels in the hippocampus, prefrontal cortex, lateral septum, but not in the caudate putamen. Also the levels of noradrenaline were clearly increased in the hippocampus. Plasma concentrations of ACTH and corticosterone were mildly elevated in three out of five examined strains. These strains also exhibited a slightly different behavioural profile. With re-exposure, less risk assessment took place, levels of free corticosterone were lower, but hardly any differences in neurochemical parameters were seen. Taken together, behavioural, neurochemical and neuroendocrine parameters form a complimentary picture indicating that rat exposure in its current form had mild arousing properties. Also in this mild form predator exposure elicited a selective activation of brain regions and neurochemicals. This highly differentiated response may be of utmost importance to coordinate and to fine-tune the specific neuroendocrine, behavioural and autonomic responses to this form of stress. It might be worthwhile to increase the stressful properties of the paradigm to further look into these mechanisms.
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Actiniaria, Corallimorpharia, Zoanthidae and Ceriantharia belong to the most neglected marine taxa. Habitats that were difficult to access in the past, complicated and doubtful methods for identification, the lack of summarizing literature and the lack of specialists led soft-bodied hexacorals into a dramatic and increasing under-representation in both biodiversity assessments and in ecological studies. The taxonomic state of knowledge for this group is far behind this of other taxa of comparable importance. This global description of the situation is especially valid for the South East Pacific. Therefore important aspects of systematic work with soft-bodied hexacorals have been addressed in the presented dissertation and exemplified by Chilean sea anemones. The results have been presented in specialist journals and at relevant meetings. To fill existing gaps and to alleviate difficulties, traditional procedures have been combined with modern methods. The applied techniques were tested for their expenditure/benefit ratio. On this base a novel, efficient approach for systematic studies of soft-bodied hexacorals was elaborated. With this approach one of the most common shallow-water sea anemones of north and central Chile, which spread out remarkably during the last decades, was described as Anemonia alicemartinae. The two most common shallow-water sea anemone species of the south east Pacific, Phymactis papillosa and Phymanthea pluvia, were re-described and fundamentally revised. The four south-hemispheric genera Isoulactis, Isocradactis, Saccactis and Oulactis, which exhibit extraordinary morphology, were revised and put together in the genus Oulactis. The deep-water genus Actinostola was revised and the species Actinostola chilensis was re-described. Traditionally used characteristics to distinguish species of the genus Actinostola were critically tested and new, alternative features were proposed. The discovery of a colonial sea anemone disproved the common idea of Actiniaria as a purely solitary group. The phenomenon of coloniality in sea anemones was described in detail and phylogenetic consequences were discussed. Some biomechanical and evolutionary-ecological hypotheses, which were used to explain the absence of colonial sea anemones, were questioned by this discovery. The reproductive strategies of the addressed Chilean sea anemone species were summarized and appearance, habitat, bathymetric distribution and reproductive mode were compared. Existing hypotheses about links between these parameters were tested and discussed. A hypothesis on spreading tendencies of some Chilean sea anemone species was elaborated. The effects on populations of other invertebrates, especially on those of economic importance, were discussed on the basis of some examples. The distribution of Chilean species and their relation to the South West Atlantic and the Antarctic fauna was analysed and the discovered zoogeographic patterns were discussed. The problems with identification and taxonomy of soft-bodied hexacorals were summarized, analysed and discussed. A working protocol was proposed as a new standard. An illustrated identification guide, which includes all known species, was made for the better known Mediterranean soft-bodied hexacorals. The crisis in systematics of soft-bodied hexacorals may be overcome by consequent ap-plication of modern methods and the close cooperation of taxonomists, ecologists and mo-lecular biologists. New funding programs and a growing interest within the younger genera-tion give cause for the hope that soft-bodied hexacorals might receive the attention merited by their ecological importance in marine benthic communities.
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EBNA-2 is a multifunctional viral oncogene involved in the immortalisation of B-cells by EBV. EBNA-2 regulates transcription of viral and cellular genes in the proliferative phase of the viral life cycle, which in vitro results in the outgrowth of EBV positive B-cells into lymphoblastoid cell lines (LCLs). EBNA-2 transcriptional signalling is mediated by cellular DNA-binding proteins, such as RBP-J and PU.1, since EBNA-2 does not contain its own DNA-binding domain. In order to better characterise EBNA-2 signalling we conducted a mutational analysis of the viral LMP-1 promoter that is strongly induced by EBNA-2 in the EBV-immortalised B-cells. Our mutational analysis of the LMP-1 promoter confirmed that the PU.1 binding site is important for transactivation of the LMP-1 promoter by EBNA-2, whereas RBP-J binding to the LMP-1 promoter leads to repression and EBNA-2 binding to RBP-J is not required for transactivation. These results imply that EBNA-2 transactivates the LMP-1 promoter preferentially by an RBP-J independent mechanism. We further characterised EBNA-2 signalling by dissection of promoter targeting domains in the EBNA-2 protein. Two EBNA-2 mutants, the CR4del and WW mutant, preferentially activated RBP-J dependent and independent signalling indicating that EBNA-2 uses at least two separate signalling pathways. We introduced the characterised EBNA-2 mutants into the EBV genome and produced recombinant viruses carrying specific mutations in the EBNA-2 genes. Primary B-cells were infected with increasing titres of recombinant EBVs lacking the EBNA-2 ORF or carrying the WW or CR4del mutant. Viruses lacking the EBNA-2 ORF or carrying the WW mutant were not able to immortalise primary B-cells even at high viral titres. The CR4 region of EBNA-2 strongly influenced B-cell immortalisation efficiency and growth rate of the immortalised B-cells. These results indicate that EBNA-2 and the RBP-J signalling of EBNA-2 are absolutely essential for B-cell immortalisation by EBV. In contrast, the CR4 EBNA-2 region mediating RBP-J independent signalling is critical, but not absolutely essential for the process of EBV immortalisation.
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Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurde zum ersten Mal die Keimbahn eines Käfers erfolgreich genetisch transformiert. Der von uns zu diesem Zweck in Zusammenarbeit mit Ernst Wimmer entwickelte Transformationsmarker 3xP3-EGFP hat inzwischen sein Potential als spezies-unabhängiges Markergen auch in weiteren Invertebraten-Spezies unter Beweis gestellt und damit das Spektrum transformierbarer Taxa beträchtlich erweitert. In Tribolium konnten Transformationsereignisse mit 3xP3-EGFP für drei verschiedene Transposons - Hermes, Minos und piggyBac - erzielt werden. Die Effizienz betrug dabei 1,4% (Hermes), 11,4% (Minos) bzw. 56% (piggyBac) der fertilen G0 und gehört damit zu den höchsten Werten, die in der Literatur für Insekten berichtet wurden. Bei Minos konnte die Effizienz durch die Verwendung von Transposase mRNA statt einem DNA Helper-Plasmid weiter auf 32,4% gesteigert werden. Für piggyBac und Minos wurde ferner in Zusammenarbeit mit anderen Labors gezeigt, daß es sich bei den meisten Transposoninsertionen um unabhängige Einzelintegrationen handelt, die auf verschiedene Chromosomen verteilt sind und stabil weitervererbt werden. Die Größe zusätzlich transferierter Fremd-DNA kann dabei bei piggyBac mindestens bis zu 9,5 kb betragen. Schließlich konnte noch ein piggyBac Element durch Helperinjektion mit einer Rate von 28,1% remobilisiert werden. Zusammen mit der Anfälligkeit für enhancer trap Effekte können daher mit diesem System alle relevanten Transposon-basierenden Techniken zur funktionellen Genomanalyse angewandt werden. Als erste praktische Anwendung wurden D. melanogaster Sequenzen für anteriore und posteriore mRNA-Lokalisierung (bicoid-3’UTR und oskar-3’UTR), sowie ein bicoid-abhängiger Minimalpromotor in Tribolium eingeführt. Allerdings konnten durch diese Ansätze keine Komponenten oder Mechanismen eines ggf. konservierten maternalen Systems nachgewiesen werden. Ein Konstrukt mit 5,2 kb der upstream Sequenzen von Tc’hunchback mit lacZ als Reportergen war hingegen in der Lage, das endogene hunchback-Muster größtenteils nachzubilden. Das frühere Ergebnis von Christian Wolff mit Tc’hunchback in Drosophila, wonach dieses Fragment alle wesentlichen regulatorischen Elemente enthält, konnte daher in transgenen Käfern bestätigt werden. Zusätzlich zu dem als sehr riskant eingestuften Transformations-Projekt wurde parallel ein weiteres Projekt durchgeführt, die Analyse der homöotischen Mutanten wurm und überlänge. In beiden Mutanten ist vor allem die Identität der posterioren Segmente ab A9 verändert. In wurm sind die Segmente A9-A11 nach A8 transformiert und die telsonalen Anhänge Urogomphi und Pygopodien fehlen. In überlänge ist nur A9 wie A8 ausgebildet und demzufolge nicht mit dem Telson fusioniert. Es fehlen nur die Urogomphi. überlänge bildet zusätzlich ein ektopisches Stigma im ersten thorakalen Segment. Es wurde gezeigt, daß es sich bei den betroffenen Genen um zwei verschiedene Loci handelt, die beide nicht im homöotischen Komplex liegen. Obwohl der Phänotyp von wurm weitgehend der RNAi-Phänokopie von Abdominal-B entspricht, konnte also keiner dieser beiden Loci einem bekannten Hox-Gen zugeordnet werden. Als mögliches Kandidatengen für diese Loci wurde daher das Tribolium-Homolog des regionsspezifischen homöotischen Gens spalt kloniert. Die Expression von spalt entspricht weitgehend der von Dm’spalt, mit einer anterioren und einer posterioren Domäne, einer dorsalen Expression an den seitlichen Rändern des Keimstreifs, sowie einem komplexen Muster im Nervensystem. Mit Hilfe der kürzlich entwickelten Technik der parentalen RNAi wurde die Funktion dieses Gens untersucht. In sal–– Phänokopien finden sich, wie in Drosophila, anteriore und posteriore Veränderungen von Segmentidentitäten. So wird das abdominale Segment A9 in Richtung anteriore abdominale Segmente transformiert. Dadurch tritt ein zusätzliches Stigma auf und die Pygopodien gehen verloren, das Segment fusioniert aber weiterhin mit dem Telson. Im Gegensatz zu Drosophila wird aber anterior nicht das Labium verändert, sondern die Identität der Maxille wird partiell in Richtung Mandibel transformiert: statt dem Enditen der Maxille wird ein mandibel-ähnlicher Zahn gebildet. Damit kommt offenbar auch spalt nicht als Locus in Frage, der in wurm oder überlänge seine Funktion verloren hat. Möglicherweise spielen diese beiden Loci eine Rolle als den HOX-Genen übergeordnete regulatorische Gene, oder als Co-Faktor von Abd-B. Damit sind wurm und überlänge als interessante (und aus Drosophila nicht bekannte) Spieler im homöotischen System der Insekten identifiziert, was weitere Untersuchungen als sehr lohnend erscheinen läßt. Vor allem aber hat dieses Teilprojekt die Evolution des spalt-Gens erhellt, das in weniger abgeleiteten Insekten offenbar eine essentielle Rolle bei der Spezifizierung von Mandibel versus Maxille spielt. Diese Funktion ist in Drosophila vermutlich im Zuge der Reduktion der Mandibel verloren gegangen.
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In der Biomedizin haben Tiermodelle eine unentbehrliche Bedeutung erreicht. In den letzten Jahren wurde eine Methode zur Generierung von Tiermodellen eingeführt, welche auf willkürlichen genetischen Manipulationen mittels der mutagenen Substanz ENU basiert. Hierbei wurden relevante Mausvarianten ausschließlich aufgrund ihres Phänotyps selektiert und zur Gründung einer neuen Mauslinie verpaart. Da es sich hierbei um einen hypothesenfreien Ansatz handelt, wurde für die Verhaltensphänotypisierung ein komplexer Versuchsaufbau gewählt, welcher es erlaubte, eine Vielzahl von Verhaltensdimensionen in einem Test zu untersuchen. Aufgrund der schnellen und zuverlässigen Untersuchungsmöglichkeiten schien das mHB besonders gut geeignet als Hochdurchsatzverfahren im Rahmen des ENU-Projektes. Mit dieser Methode wurde eine dominante Mausvariante identifiziert, welche sich durch eine beeinträchtigte Objekterkennung von wt Tieren unterschied. Basierend auf diesem F1-Tier wurde die RO-Linie gegründet. Im Laufe der vorliegenden Arbeit wurde die RO-Linie über sieben Generationen gezüchtet und im mHB verhaltenscharakterisiert, um vor allem die Penetranz und Stabilität des Phänotyps über mehrere Generationen zu untersuchen. Dabei wurde gezeigt, dass RO-Mäuse einen sehr selektiven Verhaltensphänotyp darstellten, der sich ausschließlich in der Objekterkennung von wt-Tieren differenzieren ließ. Die Penetranz des Phänotyps lag mit 46% in einem idealen Bereich für einen dominanten Vererbungsgang. Zur weiteren Analyse des Verhaltensphänotyps von RO-Mäusen wurden diese in zwei selektiven Verhaltenstests, dem Objekterkennungstest und einem räumlichen Lerntest, untersucht. Während sich der Verhaltensphänotyp in dem selektiven Objekterkennungstest bestätigte, wurde in dem komplexen räumlichen Lerntest kein Unterschied zwischen RO--und wt-Mäusen beobachtet. Folglich konnte gezeigt werden, dass sich die beiden Linien in hippokampusabhängigen Aufgabestellungen nicht voneinander unterschieden. Durch immunhistologische als auch elektrophysiologische Untersuchungen sind Hirnareale im kortikalen Temporallappen definiert, welche zur Wahrnehmung und zur Verarbeitung der Informationen während eines Objekterkennungstests aktiviert werden. Auf dieser Kenntnis basierend wurde die c-Fos Expression nach einem Objekterkennungstest von RO-Tieren und wt-Mäusen untersucht. Die Resultate zeigten, dass bei RO-Tieren eine erhöhte sensorische Aktivität ausgelöst wurde, jedoch war in der Hirnregion zur Verarbeitung und Speicherung dieser Informationen weniger neuronale Aktivität zu erkennen. Folglich könnte die beeinträchtigte Fähigkeit zur Objekterkennung auf einen Unterschied der Tiere bei der Verarbeitung von Gedächtnisinhalten zurückzuführen sein. Zur Untersuchung der klinischen Relevanz der RO-Mäuse als Tiermodell wurde eine pharmakologische Validierung mit dem Acetylcholinesterasehemmer Metrifonate in einem selektiven Objekterkennungstest durchgeführt. Dabei wurde durch die Behandlung mit Metrifonate eine signifikante Verbesserung der Objektdiskriminierung bei RO-Tieren erreicht. Somit ist die RO-Linie als valides klinisches Tiermodell einzustufen. Als erster Versuch zur Ermittelung des manipulierten Gens sollte mittels einer Kopplungsanalyse die chromosomale Region der Mutation im Genom ausfindig gemacht werden. Dafür wurden Mikrosatellitenmarker über das komplette Genom verteilt und nach einer gekoppelten Vererbung mit dem Phänotyp in Form eines rekombinanten Locus abgesucht. Soweit wurde noch keine signifikante Kopplung zwischen dem Phänotyp und einem der genetischen Marker gefunden. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Abstände zwischen den Mikrosatelliten zu groß gewählt waren. Eine zweite Erklärung wäre, dass der Verhaltensphänotyp nicht auf einer genetischen Grundlage basierte.
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The aim of this study was to increase the understanding of diversity and activity of dominant bacterial populations in the rhizospheres of three economically important grain legumes (Vicia faba, Lupinus albus and Pisum sativum). A cultivation-independent approach was employed to achieve this aim bearing in mind the limitation of cultivation-dependent technique that only 10% of bacteria present in rhizosphere can be cultured. PCR amplification of 16S rDNA and subsequent separation of the amplicons by DGGE was used in an initial screening of replicates for experimental variation and for the first characterization of bacterial community composition of the three rhizospheres under study. Specific profiles generated by the three legumes, derived by both 16S rDNA and rRNA, emphasized the need to perform detailed analysis of the communities present in these rhizospheres. Clone libraries for PCR and RT-PCR products were generated for representative samples of all the three legumes. Firmicutes were found to be the most dominant in all the legumes, both in DNA- and RNA-derived libraries, indicating them to be the most active group as well. A plant-dependent rhizosphere effect was reflected by the absence of ?-subdivision members in Pisum and ?-subdivision members of proteobacteria in Vicia rhizosphere. High numbers of as yet unclassified bacteria were also obtained. With this experimental set-up, using the same soil material but three different legumes and a uniform inoculation with Rhizobium sp., it became evident that plant roots influence the development of bacterial communities in the rhizosphere in a plant-specific manner. The extent of the rhizosphere effect could vary in natural field conditions as the present study was performed under controlled conditions in green house using soil from agricultural site. Extraction and analysis of rRNA has enabled identification of active taxa in the present study. Fingerprints were obtained for total RNA using two different primers. The profiles generated revealed marked differences between the three rhizospheres of the three legumes under study, indicating differences between the metabolic status of the bacterial communities present in the rhizospheres of these three legumes. To address the question of functional diversity, mRNA extraction and subsequent RT-PCR were performed for various genes important in nutrient cycling. The presence of chitinase genes could be established by specific PCR amplification using DNA extracted from the three rhizospheres. However, no expression of the gene could be detected by RT-PCR. Enzyme assays confirmed no or very low levels of the chitinase protein in the rhizospheres. Analysis of proteolytic enzymes (serine and neutral metallopeptidases) showed the presence and activity of serine peptidase in the three rhizospheres. Neutral metallopeptidase gene was also present in the three rhizospheres but no expression could be detected in the Lupinus rhizosphere. This was a confirmation of plant-dependent effect at the level of functioning of the bacterial communities. Genes for nitrite reductase (nirK and nirS), which may lead to removal of nitrogen from the system by denitrification, were targeted to gain an understanding of the importance of this enzyme in a nitrogen-enriching environment. The presence of nirS was not detected in any of the legume rhizospheres, but both the presence and activity of nirK was established for the three rhizospheres. The diversity of this gene was investigated by generating clone libraries with the RT-PCR products from the three plant rhizospheres. The observation of distinct differences in the distribution of phylotypes of expressed nirK gene in the three legume rhizospheres confirmed a plant specific effect on the functions of the rhizosphere bacterial communities. The present study revealed a hitherto unknown diversity of rhizospheric bacteria associated with grain legumes. Entirely cultivation-independent approaches to characterize the structure and function of the bacterial community of the rhizosphere of the three grain legumes clearly revealed plant-dependent rhizosphere effect on bacterial community structure and function.
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Growth cones, the terminal structures of elongating neurites are important for development and regeneration. The second messenger cAMP regulates both processes. cAMP is also known to induce growth cone turning. By using time-lapse microscopy and release of cAMP from biological inactive caged compounds the directional response of neuronal growth cones was investigated. Intracellular gradients were induced by asymmetric release of cAMP on one side of the growth cone. Using a new method, which released the same amount cAMP independent of the stimulation pattern it was possible to show that pulsed release in contrast to continuous release was more effective in inducing growth cone turning. From experiments with several pharmacological agents it can be concluded that the protein kinase A plays a major role for the cellular responses and that the gradient steepness causes the different reactions. In cooperation with other scientists it was ruled out that the different responses were caused by non-linearities of the caged compound. Furthermore cAMP gradients were visualized directly in HeLa cells expressing cAMP sensitive ion channels as a reporter system. With this cell line it was also possible to show that the stimulation pattern, meaning pulsed and continuous release respectively, influences the gradient shape. This finding was in accordance with published theories and numerical calculations. Here it was shown for the first time that the spatio-temporal properties of the intracellular gradient are crucial for growth cone turning.
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This dissertation examines two aspects of how natural selection shapes the amount and pattern of genetic variation within and between species: (1) the role of positively selected alleles in shaping the variation within and between subpopulations of a subdivided species and (2) the influence of epistatic selection operating on RNA secondary structures. First, the role of natural selection in shaping the pattern of variation within and between populations of the subdivided species Drosophila ananassae is investigated. To delimit the spread of positively selected alleles and characterize the role of natural selection in genetic differentiation, sequence data was collected from a locus in a region of low recombination for 13 populations, spanning a majority of the species range of D. ananassae. The migration behavior of this selected locus is compared to that of 10 independent neutrally evolving loci and tested against alternative models of natural selection. Second, nucleotide variation at the D. melanogaster bicoid locus is examined. The presence of a large, conserved secondary structure in the 3’ untranslated region enables the relationship between RNA secondary structure and patterns of standing variation in natural populations to be explored. Variation within this structure is analyzed with respect to models of compensatory evolution and recent improvements of these models. Evidence suggests that bicoid may be the result of a relatively recent gene duplication in the Dipteran lineage, thus, variation in the bicoid coding region is also analyzed with respect to the evolutionary processes that may be ongoing if this gene is still undergoing diversification and/or refining of its function. Finally, long-range compensatory interactions between the two ends of Drosophila alcohol dehydrogenase (Adh) mRNA are investigated by experimental manipulation. Site-directed mutations were introduced in the D. melanogaster Adh gene in an effort to explain why previous mutational analysis failed to fit Kimura’s classical model of compensatory evolution. The results of the mutational analysis indicate that a classical result was not observed due to the pleiotropic effect of changing a nucleotide involved in both long-range base pairing and the negative regulation of gene expression.
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Das nicht polymorphe HLA-Klasse-I-Antigen HLA-G wird hauptsächlich in der Plazenta exprimiert, wo es vermutlich den semiallogenen Fötus vor Angriff des mütterlichen Immunsystems schützt. Eine Besonderheit von HLA-G ist das Auftreten von mehreren verkürzten Isoformen, die von alternativ gespleißten Transkripten translatiert werden. Neben dem kompletten membranständigen HLA-G1 mit den extrazellulären Domänen a1, a2 und a3 existieren die verkürzten Isoformen HLA-G2 (∆a2), HLA-G3 (∆a2, ∆a3) und HLA-G4 (∆a3). Außerdem wurden die löslichen Isoformen HLA-G5 (HLA-G1s), HLA-G6 (HLA-G2s, ∆a2) und HLA-G7 (HLA-G3s, ∆a2, ∆a3) beschrieben. Um die Expression und Funktion einzelner Isoformen getrennt voneinander und ohne Beeinflussung durch andere MHC-Klasse-I-Moleküle untersuchen zu können, wurden Transfektanten für die Isoformen HLA-G1, HLA-G2, HLA-G4 und HLA-G5 in der HLA-Klasse-I-negativen humanen Zellinie K-562 generiert. HLA-G kann mit inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren auf NK- und T-Zellen in Wechselwirkung treten und so Effektorfunktionen beeinflussen. Die Expression von HLA-G kann außerdem indirekt über HLA-E auf die Zytotoxizität von NK-Zellen und T-Zellen einwirken. Die HLA-E-Expression ist abhängig von Peptiden aus den Signalsequenzen von HLA-Klasse-I-schweren Ketten. Zum Ausschluß der Koexpression des HLA-Klasse-I-Antigens HLA-E auf der Zelloberfläche wurden HLA-G1mut- und HLA-G4mut-cDNA-Vektoren eingesetzt, deren Exon 1 so verändert ist, daß kein Ligand für HLA-E zur Verfügung gestellt wird. Während in der Zellinie K-562 HLA-G1 und HLA-G5 auf der Zelloberfläche exprimiert bzw. sezerniert werden, waren die verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 mittels FACS-Analyse mit einer Reihe HLA-Klasse-I- und HLA-G-spezifischer Ak nicht auf der Zelloberfläche nachweisbar. Diese Ergebnisse korrelieren mit der Sensitivität dieser verkürzten Isoformen gegenüber Endo H. Aus der fehlenden Resistenz der HLA-G2- und HLA-G4-Polypeptide gegenüber Endo H ergibt sich kein Hinweis auf ihren Transport zur Zelloberfläche. Diese fehlende Oberflächenexpression von HLA-G2 und HLA-G4 könnte auf einer gestörten Assoziation mit b2m oder Bestandteilen der MHC-Klasse-I-Prozessierungsmaschinerie beruhen. Kopräzipitationsexperimente ergaben, daß nur die HLA-G1-schwere Kette mit b2m und TAP assoziiert ist. HLA-G2 ließ sich zwar mit TAP, jedoch nicht mit b2m kopräzipitieren und HLA-G4 ließ sich weder in Assoziation mit b2m noch mit TAP nachweisen, so daß diesen Isoformen ein wichtiger Bestandteil der vollständigen HLA-I-Komplexe fehlt und bei HLA-G4 außerdem die Beladung mit Peptiden gestört ist. Diese Daten sprechen gegen eine Zelloberflächenexpression der verkürzten HLA-G-Isoformen. Im Unterschied zu HLA-G1 war HLA-G5 nicht in Kopräzipitaten mit TAP zu finden. Daher scheint für diese Isoform eine stabile Assoziation mit TAP für die Peptidbeladung nicht essentiell zu sein. Zum funktionellen Nachweis von HLA-G wurden Zytotoxizitätstests mit der Zellinie NKL sowie mit PBL, NK-Zellen und LAK-Zellen aus dem peripheren Blut mehrerer Donoren durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die Expression der verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 die Zytotoxizität der verschiedenen Effektorzellen nicht beeinflußte. HLA-G1 inhibierte die Lyse von K-562 in Abhängigkeit von der HLA-G1-Expressionsstärke und wirkte sich weniger deutlich als eine entsprechende HLA-E-Expression auf die Zytotoxizität aus. Neben der Plazenta wird HLA-G auch in zahlreichen anderen Geweben exprimiert und kann in Tumoren induziert oder hochreguliert werden. Da bei verschiedenen Tumoren die MHC-Klasse-I-Expression aufgrund von Mutationen im b2m-Gen gestört ist, wurden HLA-G1-Transfektanten in der b2m-negativen humanen Zellinie Daudi etabliert. Daudi HLA-G1-Transfektanten weisen gegenüber K-562 HLA-G1-Transfektanten eine reduzierte HLA-G-Proteinmenge auf. In Abwesenheit von b2m ist HLA-G1 außerdem nicht resistent gegenüber Endo H und kann auch nach Inkubation der Zellen bei niedrigen Temperaturen und Zugabe von b2m oder Ligand nicht auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Da von HLA-B27 bekannt war, daß b2m-freie Homodimere auf der Zelloberfläche exprimiert werden können und eine Dimerisierung von HLA-G über ungepaarte Cysteinreste möglich ist, wurden die Daudi HLA-G1-Transfektanten auf Anwesenheit von HLA-G1-Dimeren untersucht. In Abwesenheit von b2m waren jedoch keine Dimere nachweisbar. Auch in funktionellen Experimenten mit LAK oder gd T-Zellen hatte die HLA-G-Expression in Daudi HLA?G1-Transfektanten keine Auswirkung auf die Zytotoxizität oder Proliferation der Effektorzellen. Die HLA-G1-Expression in b2m-negativen Tumoren trägt daher nicht zur Tumorprogression bei. Eine Analyse der Unterschiede in der Expression und der Auswirkungen der HLA-G-Isoformen in verschiedenen Zellinien könnte Hinweise auf die Regulation und die Funktion der HLA-G-Expression liefern.
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Das Nierenzellkarzinom ist die häufigste neoplastische Erkrankung der Niere und stellt das siebthäufigste Malignom beim Mann dar, an der in Deutschland jedes Jahr mehr als 11 000 Menschen erkranken. Bei Erstdiagnose sind etwa 13 % der Karzinome bereits metastasiert. Die 1-Jahres-Überlebensrate dieser Patienten beträgt bei rein operativer Behandlung lediglich 15 %. Da das Nierenzellkarzinom keine Strahlensensitivität zeigt und gegenüber gängigen Chemotherapeutika refraktär ist, wird seit langem nach alternativen Behandlungsmöglichkeiten gesucht. Hierbei wird berücksichtigt, dass das Karzinom zu der relativ kleinen Gruppe immunogener Tumoren gezählt wird, da es möglich ist in vitro eine Immunantwort gegen den Tumor zu induzieren. Zudem zeigen einige Patienten Remissionen von Primärtumoren oder Metastasen nach systemischer Gabe von IL-2, so dass scheinbar auch in vivo eine Immunantwort gegen den Tumor ausgelöst werden kann. Die Tumorgewebe weisen in den meisten Fällen außerdem eine sehr starke Infiltration von Lymphozyten auf, unter denen beispielsweise bereits Tumor-spezifische T-Zellen identifiziert werden konnten. Die Lymphozyten scheinen im Tumorgewebe allerdings inaktiv zu sein, da sie das Wachstum des Tumors in vivo nicht verhindern können. Die Erkennung und Bekämpfung der Ursachen für diese funktionelle Inaktivität der Lymphozyten könnte zu einer Entwicklung neuer immuntherapeutischer Ansätze führen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die NK-Zellen innerhalb der infiltrierenden Lymphozyten tatsächlich in einem funktionell inaktivierten Zustand vorliegen. Sie sind nicht in der Lage Zellen zu lysieren, selbst wenn diese keine MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren und deshalb von allen NK-Zellen erkannt werden sollten. Durch die direkte ex vivo-Isolierung der Lymphozyten konnte allerdings gezeigt werden, dass die infiltrierenden NK-Zellen durchaus eine maßgebliche Effektorpopulation bei der Eliminierung der Tumorzellen darstellen können. Ihre Zytotoxizität gegen Tumorzellen konnte bereits über eine Kurzzeitkultivierung der Zellen mit IL-2 induziert werden. Die infiltrierenden NK-Zellen waren in der Vergangenheit wenig untersucht worden, da viele Eigenschaften dieser Zellpopulation erst in den letzten Jahren charakterisiert wurden und sowohl Techniken als auch Reagenzien für ihre Beschreibung fehlten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine NK-Zell-Subpopulation, die durch die Expression des inhibitorischen Rezeptorkomplexes CD94/NKG2A charakterisiert ist, verglichen mit autologen peripheren Lymphozyten im Tumorgewebe überrepräsentiert ist. Die Charakterisierung weiterer phänotypischer und funktioneller Merkmale der infiltrierenden NK-Zellen ließ vermuten, dass sie sowohl durch das Expressionsmuster der inhibitorischen Rezeptoren, als auch durch die Expression bestimmter Zytokine wie IL-10 sowie durch ihre geringe zytotoxische Aktivität in situ eine Herabregulierung der Immunantwort im Tumorgewebe verursachen. Dass die NK-Zellen jedoch bereits über eine Kurzzeitstimulierung mit IL-2 aktivierbar waren, könnte erklären, warum die Immuntherapie an Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom über IL-2 auch in vivo Wirkung gegen die Tumoren zeigen kann. Die Aktivität der NK-Zellen nach dieser Stimulierung konnte allerdings nur dann festgestellt werden, wenn der Anteil der NK-Zellen innerhalb der TIL hoch lag. Somit konnte ein Zusammenhang zwischen der zytotoxischen Aktivität der NK-Zellen und ihrer Anzahl im Tumor festgestellt werden. Allerdings lag keine Korrelation mit der Größe und Ausbreitung des Primärtumors vor. Dies scheint nicht verwunderlich, da die NK-Zellen im Tumor funktionell inaktiv sind und den primären Tumor somit nicht bekämpfen können. Es wäre allerdings möglich, dass die Anzahl der NK-Zellen nicht nur mit ihrer Aktivierbarkeit im Tumor selbst in Zusammenhang steht, sondern bei diesen Patienten gleichzeitig eine generell bessere Aktivierbarkeit des Immunsystems gegen den Tumor wiederspiegelt. Bei verschiedenen anderen Tumortypen konnte bereits gezeigt werden, dass sowohl die Anzahl als auch die Aktivität der NK-Zellen für die klinische Prognose der Patienten entscheidend sein kann. Somit wäre möglich, dass ein hoher Anteil an NK-Zellen im Tumor einen prognostischen Faktor für das Ansprechen der Patienten auf die systemische Immuntherapie mit IL-2 darstellt und könnte helfen solche Patienten zu selektieren, die somit für diese Therapie mit den zum Teil schwerwiegenden Nebenwirkungen in Frage kommen. Eine Untersuchung dieses Zusammenhangs ist nun retrospektiv auf einfache Weise möglich, da in dieser Arbeit eine Methode dargestellt werden konnte, die es erlaubt die NK-Zellen erstmals über eine einfarbige immunhistochemische Färbung in asservierten Gewebeproben bereits vor längerer Zeit operierter Patienten spezifisch zu identifizieren und die Korrelation mit deren klinischem Krankheitsverlauf zu untersuchen. Bisher ist nicht geklärt, warum verschiedene Tumoren unterschiedliche Anteile infiltrierender NK-Zellen aufweisen. Neben einer verstärkten Einwanderung von NK-Zellen wäre es möglich, dass NK-Zellen in verschiedenen Tumoren unterschiedlich stark proliferieren können. Diese Tumoren weisen dann möglicherweise eine verminderte Fähigkeit auf, das Immunsystem zu unterdrücken und könnten auch aus diesem Grund eine bessere klinische Prognose für die Patienten darstellen. Die Ursachen für die unterschiedliche Aktivierbarkeit der NK-Zellpopulationen konnten bisher ebenso nicht geklärt werden. Hierfür würde sich anbieten, Unterschiede in der Genexpression zwischen verschiedenen NK-Zellpopulationen zu suchen, was beispielsweise mithilfe der Array-Technolgie bewerkstelligt werden könnte. Ein Zusammenhang zwischen der Anzahl der NK-Zellen im Tumor und der Prognose für die Tumorpatienten könnte bestätigen, dass die Population der NK-Zellen in vivo eine ausschlaggebende Effektorpopulation bei der Bekämpfung der Tumoren darstellen. Weiterhin wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen an infiltrierenden T-Zellen durchgeführt, die vermuten lassen, dass sowohl aktivierte T-Zell-Populationen als auch regulatorische T-Zellen im Tumorgewebe vorhanden sind. Dies konnte durch die Expression verschiedener Oberflächenmarker und Proteine wie beispielsweise Foxp3, das spezifisch von regulatorischen T-Zellen exprimiert wird, gezeigt werden. Die Anwesenheit verschiedener regulatorischer Zellen könnte einen entscheidenden Beitrag zu einer funktionellen Inaktivierung der Lymphozyten im Tumor und der damit verbundenen Toleranz gegenüber Tumorzellen leisten, da bereits gezeigt wurde, dass regulatorische Zellen beispielsweise die Immunantwort gegen Selbst-Antigene, die auch von Tumorzellen exprimiert werden, unterdrücken können. Erkenntnisse über die Eigenschaften infiltrierender Lymphozyten tragen entscheidend zu einem besseren Verständnis der immunologischen Vorgänge im Nierenzellkarzinom bei. Die in dieser Arbeit aufgezeigten Charakteristika der TIL und die Etablierung einer Methode für die spezifische Identifizierung der NK-Zellen im Gewebe könnten in Zukunft eine Grundlage für die Entwicklung neuer Immuntherapien darstellen, die eine gezielte Aktivierung des Immunsystems gegen den Tumor bewirken könnten.
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Die Nahrungssuche ist für Tiere kein triviales Verhaltensproblem. Nahrung ist im Habitat eines Tieres selten homogen verteilt, wobei räumliche Heterogenität unter anderem durch das zeitliche Muster der Ressourcenerneuerung und durch die Nahrungssuche der Tiere selbst verursacht wird. Besonders bei sich rasch erneuernden Nahrungsquellen wie z.B. Blütennektar ist es für viele Tiere von Vorteil, sich einerseits den Ort dieser Quellen zu merken, um wieder dorthin zurückzukehren, andererseits jedoch eine Rückkehr vor einer rentablen Ressourcenerneuerung zu vermeiden. Blüten sind ortskonstant und produzieren Nektar über einige Zeit hinweg. Ein gutes Ortsgedächtnis sowie die Fähigkeit, vorzeitige Wiederbesuche einer Blüte zu meiden, können somit die Effizienz der Nahrungssuche beträchtlich steigern. Viele der neotropischen Blütenfledermausarten (Phyllostomidae, Glossophaginae) ernähren sich hauptsächlich von Nektar. Sie ermöglichen daher die Untersuchung eines spezialisierten Ortsgedächtnisses bei einem Säugetier. Die vorliegende Doktorarbeit hatte zwei Ziele: 1. Die Entwicklung eines neuartigen, computergesteuerten Versuchssystems zur automatisierten Durchführung sequenzieller Verhaltensexperimente mit mehreren Individuen (Kapitel 1). 2. Die Untersuchung des Ortsgedächtnisses von Blütenfledermäusen für kleinräumige Blütenansammlungen unter Verwendung dieses Systems (Kapitel 2 bis 5). Das Versuchssystem (Kapitel 1) umfasst ein computergesteuertes künstliches Blütenfeld mit 64 Kunstblüten sowie 6 ebenfalls computergesteuerte Käfige. Das Blütenfeld stellt eine Nahrungsareal dar, dessen einzelne Futterquellen eine rechnergesteuerte Ergiebigkeit haben und deren wahrnehmbare Erscheinung für drei Sinnesmodalitäten (Geruch, visuell, echoakustisch) variiert werden kann. Die Käfige sind mit je zwei Kunstblüten zur Einzeldressur, einem computerüberwachten Hangplatz, einem Kameraüberwachungssystem und computergesteuerten Türen ausgestattet. Blütenbesuche und andere versuchsrelevante Parameter werden vom Computer mit Zeitangabe gespeichert. Dieses System ermöglicht sowohl die Datenaufnahme als auch den Austausch von Versuchstieren computergesteuert und ohne Störung der Tiere. Eine Anpassung des Systems an andere Tierarten lässt sich problemlos vornehmen. Für die Experimente wurden Blütenfledermäuse der Art Glossophaga soricina darauf trainiert, am beschriebenen Blütenfeld Nektar zu suchen. Kapitel 2 befasst sich mit folgenden Fragen: 1. Ist das Ortsgedächtnis von Blüten-fledermäusen so hoch auflösend, dass sie sich auch in einer kleinräumigen Ansammlung von Blüten wie einer Baumkrone Ort und Qualität einzelner Blüten merken können? 2. Wenn ja, vermindern sie nach Möglichkeit die Anforderungen an das Ortsgedächtnis durch kognitive Gruppierung räumlich nahe benachbarter belohnender Blüten? 3. Wie hoch sind Kapazität und Flexibilität des Ortsgedächtnisses innerhalb eines solchen Areals? Die Fledermäuse hatten in diesem Experiment die Aufgabe, am Blütenfeld die Nektar gebenden Blüten zu finden und deren Positionen zu lernen. 32 der 64 Blüten gaben pro Versuchsdurchlauf einmal Nektar, wobei belohnende Blüten entweder geklumpt oder zufällig angeordnet waren. Das Ortsgedächtnis der Fledermäuse erwies sich als so hoch auflösend, dass sich die Tiere auch in dieser kleinräumigen Blütenansammlung einzelne Blütenpositionen merken konnten. Zwar erreichten die Tiere bei der geklumpten Verteilung ein höheres Korrektwahlenniveaus als in der zufälligen, doch eine Simulation ergab, dass dieser unterschiedliche Korrektwahlenanteil nicht nur auf kognitiver Gruppierung räumlich benachbarter Blüten beruhen könnte, sondern auch auf örtlichen Positionsfehlern. Es bleibt somit ungeklärt, ob die Tiere in der gegebenen Situation Blüten kognitiv gruppierten, oder bisweilen versehentlich eine Nachbarblüte der eigentlich anvisierten Blüte besuchten. Das Ortsgedächtnis der Fledermäuse erwies sich als äußerst flexibel. Die Tiere stellten sich schnell und ohne Anzeichen von proaktiver Interferenz (ohne Beeinträchtigung der Lernleistung durch zuvor gelernte Information) auf Verände-rungen der Nahrungsverfügbarkeit ein. Sie lernten in beiden Blütenverteilungen die Positionen von mindestens 27 Blüten. In Kapitel 3 wurde der Frage nachgegangen, ob die Fledermäuse im oben beschriebenen Versuch unmittelbare (und damit unprofitable) Wiederbesuche vermieden und - falls ja - ob sie dazu ihr räumliches Arbeitsgedächtnis (entspricht dem Kurzzeitgedächtnis), Bewegungs-regeln oder andere Strategien anwenden würden. Die Tiere vermieden Wiederbesuche. Da sich kein systematisches Ausbeuteverhalten nachweisen ließ, das rein auf Bewegungsregeln beruhte und ohne Arbeitsgedächtnis realisierbar gewesen wäre, ist zu vermuten, dass die Tiere Wiederbesuche hauptsächlich mit Hilfe ihres Arbeitsgedächtnisses vermieden. Ist dies der Fall, so konnten sie sich einzelne Blütenbesuche über mindestens 62 Besuchsereignisse merken (dies zeigte eine Analyse des "Recency"-Effekts). Jedem Lernen der Ortsposition einer Blüte muss ein Erkennen der Blüte als Futterquelle vorangehen. Da Blütenfledermäuse in der Regel viele Blüten derselben Pflanzenart an verschiedenen Standorten besuchen, ist anzunehmen, dass sie die Fähigkeit besitzen, Blüten als "Typ" zu erkennen. In dem in Kapitel 4 beschriebenen Experiment wurde die Fähigkeit untersucht, in einer Zweifachwahl-Diskriminationsaufgabe echoakustisch spezifisch markierte Kunstblüten an neuen Standorten wiederzuerkennen. Dies führte zu dem überraschenden Befund, dass die Tiere die an einem Ort erlernte Unterscheidung an einem anderen Ort neu lernten und damit keine Generalisierung zeigten. Möglicherweise ist das Lösen von Zweifachwahl-Aufgaben für Blütenfledermäuse schwierig, weil solche Aufgaben der starken Ortspräferenz der Tiere zuwiderlaufen. Eine Blüte ist für eine Fledermaus ein multimodaler Stimulus, der echoakustisch, olfaktorisch und gegebenenfalls auch optisch wahrgenommen werden kann. Mit dem in Kapitel 5 beschriebenen Experiment wurde untersucht, ob Sinnesinformation verschiedener Modalitäten in unterschiedlicher Weise zum Aufbau des Ortsgedächtnisses einer Blüten-position beiträgt. Wie im ersten Versuch hatten die Tiere die Aufgabe, am Blütenfeld die Nektar gebenden Blüten zu finden und deren Positionen zu lernen. 32 der 64 Blüten gaben pro Versuchsdurchlauf einmal Nektar, wobei belohnende Blüten zufällig verteilt waren. Belohnende und unbelohnende Blüten waren durch verschiedene echoakustische oder visuelle Stimuli oder gar nicht (Kontrolle) gekennzeichnet. Im Verlauf des Experiments wurden die Stimuli zweimal vorübergehend entfernt. Die Fledermäuse erreichten mit Stimuli beider Modalitäten einen höheren Korrektwahlenanteil als ohne. Die Entfernung der Stimuli hatte zur Folge, dass sich der Korrektwahlenanteil zwischen den Versuchsbedingungen nicht mehr signifikant unterschied. Die Tiere nutzten also neben ihrem Ortsgedächtnis sowohl echoakustische als auch visuelle Information zur Lokalisation Nektar gebender Blüten am Feld. Während echoakustische Stimuli nur als Orientierungshilfe dienten, verbesserten visuelle Stimuli anscheinend zusätzlich das Ortslernen, denn nach Entfernung der echo-akustischen Stimuli fiel der Korrektwahlenanteil drastisch, nach Entfernung der visuellen Stimuli nicht. Das im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelte Versuchssystem erwies sich als ein zuverlässiges Mittel zur Durchführung voll automatisierter Versuche mit mehreren Tieren. Die durchgeführten Lernexperimente zeigten, dass Blütenfledermäuse ein hoch auflösendes, flexibles Langzeit-Ortsgedächtnis besitzen. Sie können unprofitable Wiederbesuche bereits geleerter Blüten wahrscheinlich mit Hilfe des Arbeitsgedächtnisses über mehr als 62 Blütenanflüge meiden. Es war keine Generalisierung echoakustischer Stimuli in Zweifachwahl-Diskriminationsaufgaben zwischen einem Dressurort und einem Testort nachzuweisen. Dieses überraschende Phänomen könnte aufgrund des Versuchsparadigmas durch eine Interferenz zwischen Ortslernen und Objektlernen verursacht worden sein. Die Tiere nutzten echoakustische und visuelle Stimuli als Orientierungshilfe, wobei die Präsenz visueller Stimuli zusätzlich das Ortslernen verbesserte.
