Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv
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Impfstoffe gelten als effektive und günstige Arzneimittel. Jedoch stehen für viele Infektionskrankheiten wie AIDS, Tuberkulose, Hepatitis C oder Malaria keine oder keine wirksamen Impfmöglichkeiten zur Verfügung. Um gegen intrazelluläre Erreger oder auch Tumore wirksam zu sein, muß ein potentieller Impstoff eine humorale und eine starke zelluläre Immunantwort induzieren. Diese Vorraussetzung kann vor allem durch genetische Immunisierungen mit DNA oder viralen Vektoren erfüllt werden. Vor diesem Hintergrund wurde im Rahmen dieser Arbeit das Potential einer DNA-Vakzine und eines HSV-1-basierten Vektors untersucht, Mäuse vor Infektionen mit dem intrazellulären Bakterium Listeria monocytogenes zu schützen. Zunächst wurde die Immunantwort untersucht, welche durch Immunisierung mit einem OVA-kodierenden Plasmid induziert wurde. Dabei konnte erstmals in vivo gezeigt werden, daß die Form (sezerniert oder membrangebunden) des exprimierten Antigens nach einer DNA-Immunsierung mittels Gene Gun sowohl das Ausmaß der humoralen Immunantwort beeinflußt, als auch die Expansion antigenspezifischer CD4- und CD8-T-Zellen. Desweiteren stellte sich heraus, daß replikationsinkompetente, rekombinante HSV-1- (rHSV-1) Vektoren und HSV-1-Amplikons in der Lage sind, eine sehr starke CTL-Antwort, aber nur eine schwache Antikörper- und CD4-T-Zellantwort zu induzieren. Eine starke, antigenspezifische CTL-Antwort konnte ebenso durch Immunisierung mit rekombinanten MVA-Vektoren generiert werden. In Vakzinierungsexperimenten konnte nachgewiesen werden, daß mit rHSV-1 immunisierte Mäuse vor Infektionen mit hohen Dosen an rekombinanten Listerien geschützt waren, wohingegen DNA-immunisierte Mäuse nur vor Infektionen mit einer mittleren, aber dennoch letalen Dosis geschützt waren. Der Immunschutz war in beiden Fällen von langer Dauer. Im Rahmen dieser Arbeit konnte demonstriert werden, daß die DNA-Immunisierung per Gene Gun eine einfach anzuwendende, verläßliche und effektive Methode ist, eine humorale und zelluläre protektive Immunantwort in Mäusen zu induzieren. Besonders im Hinblick auf neue Vakzinierungsstrategien gegen intrazelluläre Erreger, die vor allem durch starke zytotoxische T-Zellantworten bekämpft werden können, erscheinen Immunisierungen mit rHSV-1-Vektoren als sehr geeignete Methode, die es gilt, sorgfältig zu untersuchen und weiterzuentwickeln.
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HIV-1-infizierte Patienten leiden häufig unter krankhaften Veränderungen des Endothels, die zu funktionellen Störungen des Gefäßsystems, koronaren Herzerkrankungen und zu Tumoren führen können. Bemerkenswert ist, dass auch Kinder HIV-1-infizierter Frauen eine signifikant schlechtere Herzfunktion und somit ein erhöhtes Risiko für koronare Herzerkrankungen aufweisen, selbst wenn diese Kinder nicht mit dem Virus infiziert sind. Ziel diese Arbeit war zu untersuchen, ob die Ursache für diese Auffälligkeit eine Störung der Endothelzellen ist. Dazu wurden differenzierte Endothelzellen und zirkulierende endotheliale Vorläufer-Zellen aus der Stammzellfraktion des Nabelschnurblutes von nicht-infizierten Kindern HIV-1-infizierter und nicht-infizierter Mütter untersucht. Dabei konnten keine Unterschiede hinsichtlich der Proliferation, der Fähigkeit zur Ausbildung kapillarähnlicher Strukturen in Matrigel und der Expression charakteristischer Endothelzellmarker beobachtet werden. Allerdings zeigte der molekularbiologische Vergleich der Genexpression, dass in Endothelzellen von Kindern HIV-1-infizierter Mütter die Expression von Matrix-Metalloprotease-1 (MMP-1) unter der Nachweisgrenze liegt oder signifikant reduziert ist. Dies konnte auf RNA- und Proteinebene sowie mittels Gelatine-Zymografie bestätigt werden.
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In dieser Arbeit wurden mit Hilfe einer neuartigen Screening-Methode im Hochdurchsatz-Maßstab Gene identifiziert, welche einen Schutz vor dem bei Morbus Alzheimer assoziierten oxidativen Nervenzelltod vermitteln können. Dazu wurde jeder Klon einer cDNA Kollektion einzeln in klonale hippokampale Mausneuronen der Zelllinie HT-22 transient transfiziert und die Zellen anschließend mit einer toxischen Konzentration Wasserstoffperoxid stimuliert. Nach Inkubation wurde der Anteil lebender Zellen als Grad für den durch das transfizierte Gen vermittelten Schutz bestimmt. Auf diese Weise konnten sechs Gene identifiziert werden, welche HT-22 Zellen signifikant vor toxischen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid schützten. Vier der sechs Gene: Glutathion Peroxidase-1, Peroxiredoxin-1, Peroxiredoxin-5 und Katalase, kodieren direkt antioxidativ wirkende Genprodukte, deren Identifikation die Funktionalität des Screening-Systems bestätigte. Neben Genen, deren Proteintranskripte direkt antioxidativ wirken, konnte des Weiteren der Transkriptionsfaktor Nrf2 und das Enzym Glutamin: Fruktose-6-phosphat Amidotransferase-2 (Gfat-2) detektiert werden. Nrf2 aktiviert die Transkription sog. „antioxidant response element (ARE)“-regulierter Antioxidanzien und detoxifizierender Enzyme, und wirkt somit indirekt schützend. Für Gfat-2 war bisher noch kein direkter Zusammenhang für die Protektion vor oxidativem Stress beschrieben. Mit der Charakterisierung dieses Effektes wurde begonnen. Parallel zu diesem Screening-Ansatz wurden Zelllinien generiert, die gegen oxidativen Zelltod resistent sind. Als Modell dienten Mausneuronen der Zelllinie HT-22. Von dieser Zelllinie wurden Klone isoliert, die resistent gegenüber den oxidativen Substanzen Glutamat und Wasserstoffperoxid sind. Untersucht wurde dabei die Genexpression der resistenten Klone mit der der sensitiven parentalen Zellen. Der Grad der Genexpression wurde dabei mit Hilfe von Affymetrix-Chips untersucht. Getestet wurde inwieweit die Überexpression derjenigen Gene, die in beiden resistenten Zelllinien eine verstärkte Expression aufwiesen, einen Schutz in den sensitiven Zellen gegenüber einem oxidativem Stress vermitteln konnte. Eine Stichprobe von 25 Genen bestätigte dabei keinen Zusammenhang zwischen starker Expression und funktioneller Protektion. Zusätzlich wurde überprüft, ob die verminderte Sensitivität H2O2- und Glutamat resistenter Zelllinien auf einen oxidativen Stress eine verminderte Regulation Apoptose induzierender Gene mit sich bringt. Ein Datenbankabgleich identifizierte neun Gene, die in beiden resistenten Zelllinien vermindert exprimierten und deren Überexpression in HEK 293 Zellen Apoptose induzierte. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass der in dieser Arbeit beschriebene funktionelle Screening-Ansatz im Vergleich zu genomweiten Expressionsanalysen deutliche Vorteile bei der Identifizierung von Gen-Funktionen besitzt, ohne dabei Einschränkungen in der untersuchten Probenzahl hinnehmen zu müssen. Die in beiden Ansätzen identifizierten Gene, könnten als Ansatzpunkte für neuroprotektive Wirkstoffe genutzt werden.
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The adoption of foreign song elements occurs under natural conditions in various songbird species including the house sparrow Passer domesticus, even though it may go largely unnoticed by humans. House sparrows singing canary song have been known by hobbyists for a long time. My study is the first to analyse the imitative abilities of house sparrows in detail. I used an integrative approach considering features that are particularly important for the degree of vocal learning that can be displayed by a species. These included (1) a genetic predisposition, (2) body condition of the parents, (3) food availability during early ontogeny, (4) social factors, (5) neuronal mechanisms, (6) hormonal states, and (7) body size and morphology of the vocal tract. House sparrows singing canary-like songs provide a rich tool for further integrative approaches. I suggest an interpretation combining all the above features under the perspective of female choice. Instead of searching for a „key adaptation“ or single explanation for the imitative ability (song learning ability) in passerines, it might be more appropriate to focus on the multiplicity of factors involved in song production that - shaped by different selective forces - promote the highly specific song adaptations.
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Among the Paramyxoviridae, only members of the subfamily Pneumovirinae like Respiratory Syncytial Virus (RSV) encode two nonstructural proteins, NS1 and NS2. These two proteins cooperatively mediate type I interferon resistance and prevent induction of interferon in infected cells. Interactions of NS1 and NS2 proteins in every combination were shown by using the yeast-two-hybrid system. Therfore, NS1 and NS2 are able to form homo- and hetero(oligo)mers in infected cells. Although RSV replicates exclusively in the cytoplasm, NS-Proteins are localized in the cytoplasm as well as in the nucleus. Expression of an enlarged NS1 fusion protein, EGFP-NS1-BRSV N, resulted in the same nuclear and cytosolic localisation indicating that nuclear localisation is not due to diffusion but rather to an active transport. Thus, NS-Proteins should have particular functions in the nucleus of infected cells. Furthermore, yeast-two-hybrid screening of a lung cDNA expression library using NS1 of bovine RSV (BRSV) as a bait, identified cDNA clones encoding several nuclear proteins and one cytosolic protein. BRSV NS2 protein and NS-Proteins from other pneumoviruses (HRSV, PVM) were also able to interact with the identified cellular proteins in yeast. The isolated cDNAs encode the nuclear proteins CDK4BP (p34SEI-1 or TRIP-Br1), RanBP16, MM-1, DEAD Box Helicase p68 and the cytosolic β-COPI. Specific interactions were determined by mutational analysis of BRSV NS1 in yeast. Co-immunoprecipitation from lysates of eukaryotic cells confirmed the interaction of both BRSV NS-Proteins with the cellular proteins. The interaction of MM-1 and p68 with both NS-Proteins was also shown in GST pull down assay in vitro. Engineered BRSV encoding a truncated p68 showed accelerated replication in MDBK and Vero cells, whereas growth of NS1/NS2 deletion mutants expressing the truncated p68 was unaffected. This indicates that the presence of NS-Proteins is a prerequisite for the acceleration of BRSV growth by truncated p68. Furthermore, replication of BRSV was attenuated on HeLa cells in which expression of p68 was knocked down by specific siRNA, whereas replication of the unrelated Rabies virus was not. Thus, p68 is a nuclear target protein for the NS-Proteins and supports BRSV replication in vitro. Growth and division of host cells is necessary for optimal BRSV replication and like p68, most of the identified nuclear protein interactors are related to regulation of the cell cycle and cell division, respectively. Therefore, NS-Proteins appear to influence the cell cycle for optimal replication of BRSV by targeting such proteins. Hence, with the yeast-two-hybrid system, the first cellular interaction partners were identified indicating new functions of NS-Proteins in the viral replication cycle.
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Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert primäre humane B-Zellen und kann deren unbegrenzte Proliferation induzieren. Dieser Prozess der Wachstumstransformation von B–Zellen ist ein Modellsystem, das die pathogenen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt. Das Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 1 (EBNA1) wurde als essentiell für den Prozess der Wachstumstransformation primärer humaner B-Lymphozyten beschrieben, weil es an der latenten Replikation über den viralen Replikations-Ursprung oriP, der extrachromosomalen Erhaltung des Virus-Episoms und der transkriptionellen Trans-aktivierung der latenten Gene beteiligt ist (Rickinson und Kieff, 2001). Dieses Postulat wurde nie experimentell untersucht, da die genetische Analyse mit den bisherigen Methoden nicht möglich war. Das Maxi-EBV-System macht das Genom von EBV einer genetischen Manipulation zugänglich und erlaubt auch die Herstellung von Viren, denen essentielle Gene fehlen (Delecluse et al., 1998). Ein Ziel meiner Doktorarbeit war die Herstellung und Analyse eines EBNA1-negativen Virus. Entgegen der Lehrmeinung war es mit EBNA1-negativem Maxi-EBV möglich, wachstums-transformierte Zellklone nach Infektion von primären humanen B-Lymphozyten zu etablieren. Das virale Genom war in sämtlichen erhaltenen lymphoblastoiden Zelllinien so integriert, dass alle untersuchten latenten EBV-Proteine exprimiert wurden. Meine Ergebnisse zeigen eindeutig, dass EBNA1 prinzipiell für die Wachstumstransformation entbehrlich ist. Mit EBNA1-positiven Viren werden die primären B-Zellen jedoch mindestens um den Faktor 10.000 besser wachstumstransformiert. Da EBNA1 den episomalen Status des Virusgenoms vermittelt, scheint die Etablierung des EBV-Genoms in infizierten Zellen der limitierende Schritt zu sein. Auch in vivo im SCID-Maus-Modell erwies sich EBNA1 als entbehrlich für die Tumorbildung, womit es nicht als essentielles Onkogen von EBV betrachtet werden kann. Ein weiterer im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchter Aspekt war die Frage, ob EBNA1 für die extrachromosomale Erhaltung und Replikation des EBV-Episoms durch heterologe Genprodukte ersetzt werden kann. Zu diesem Zweck wurden Fusionsproteine aus der DNA-Bindedomäne von EBNA1 mit den zellulären Proteinen Histon H1 bzw. HMG-I (Mitglied der hoch mobilen Protein-Gruppe) hergestellt. Ich konnte zeigen, dass HMG-I:EBNA1- und H1:EBNA1-Fusionsproteine in der Lage sind, kleine oriP-enthaltende Plasmide und Maxi-EBVs episomal zu erhalten und die zelluläre Replikations-Maschinerie zu rekrutieren. Zusätzlich dazu unterstützen die Fusionsproteine im EBNA1-negativen Maxi-EBV die Produktion infektiöser Viren. Für ein konditional regulierbares Vektorsystem wurden Fusionsproteine aus der EBNA1-Transaktivierungsdomäne und der DNA-Bindedomäne des Tet-Repressors (TetR) hergestellt. Diese Proteine sollten mit Tet-Operator-Sequenzen (TetO, TetR-Bindemotiv) interagieren, die multimerisiert auf oriP-basierte Vektoren kloniert wurden. Dadurch sollte die Erhaltung der oriP-basierten Vektoren in der Zelle konditional regulierbar gestaltet werden. Es gelang in dieser Doktorarbeit zum ersten Mal ein System zu etablieren, mit dem Plasmide episomal erhalten werden und bei Zugabe von Doxyzyklin konditional regulierbar verloren gehen. Dieses erstmals realisierte konditional regulierbare Vektorsystem schafft neue Wege, die virale und zelluläre Replikation genauer zu untersuchen. Außerdem öffnen sich Möglichkeiten für eine sicherere Gentherapie, da die viralen Anteile auf ein Minimum reduziert werden können. Mit einem solchen System könnten EBV-Genvektoren in B-Zellen eingeführt werden und nach Expression des auf dem Vektor kodierten, therapeutischen Gens könnte die Genfähre durch Tetrazyklin-Applikation wieder aus dem Patienten entfernt werden.
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Agrobacterium tumefaciens ist ein Gram-negatives Bodenbakterium, das dikotyle Pflanzen infiziert. Mittels eines Typ IV Sekretionssystems werden dabei ein Teil der bakteriellen DNA (T-DNA), sowie die Virulenzproteine VirE2, VirE3, VirD2 und VirF in die pflanzliche Zelle transferiert. Das Typ IV Sekretionssystem von A. tumefaciens besteht aus den 12 Vir-Proteinen VirB1-VirB11 und VirD4, die zu einem die äußere und innere Membran durchspannenden Proteinkomplex und einem Pilus (T-Pilus) assemblieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Protein-Protein-Interaktionen im VirB/D4-Sekretionssystem von A. tumefaciens C58 analysiert, mit dem Ziel einer Aufklärung der Assemblierung von Transporterstruktur und T-Pilus. Ergebnisse: 1) Unter Verwendung des milden nicht-ionischen Detergenz n-Dodecyl-b-D-maltosid wurde eine potentielle Vorstufe der T-Pilus Assemblierung solubilisiert. In dem ca. 100 kDa großen Proteinkomplex wurden die Vir-Proteine VirB2, VirB3, VirB5, VirB6, VirB7, VirB8 und geringe Mengen VirB9 detektiert. Die T-Pilus Proteine VirB2, VirB5 und VirB7 zeigten bei Analyse mittels BN-PAGE und 2D-Gelelektrophorese eine Kofraktionierung. Unter Berücksichtigung bereits bekannter Fakten wurde ein Modell der T-Pilus Assemblierung wurde erstellt. 2) Ein 27 kDa großes, mit VirB5 interagierendes Protein wurde entdeckt und nach Aufreinigung und N-terminaler Sequenzierung als „trans-Zeatin produzierendes Protein“ (Tzs) identifiziert. Die Untersuchung der enzymatischen Aktivität von Tzs ergab eine Umsetzung von 4-Hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyldiphosphat (HMBPP) mit AMP zu Zeatinribosid-5´-monophosphat (ZMP), einem Phytohormon der Cytokinin-Klasse. HMBPP ist ein Zwischenprodukt des alternativen Isoprenoid-Biosynthese Weges (DXP-Weg) Gram-negativer Bakterien. 3) Eine Interaktion von VirB5 mit VirB5, sowie VirB5 mit VirE2 konnte gezeigt werden. Im Rahmen der Analysen wurde neben den Piluskomponenten VirB2, VirB5 und VirB7 auch VirB1 in isolierten T-Pili detektiert.
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Die Kontinuität des mitochondrialen Kompartiments wird durch fortlaufende Membranfusions- und Teilungsereignisse aufrechterhalten. Das Verständnis der Prozesse, die wichtig für die Funktion und die Vererbung der Mitochondrien sind, erfordert die Identifizierung und Charakterisierung der daran beteiligten molekularen Komponenten. Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit wurde eine neue Komponente, MDM33, identifiziert und charakterisiert. Dabei handelt es sich um ein Gen, welches für ein Protein der mitochondrialen Innenmembran kodiert, und dessen Deletionsmutante einen völlig neuartigen Phänotyp aufweist. Zellen, denen das Mdm33-Protein fehlt, enthalten ringähnliche, miteinander verbundene Mitochondrien, welche große Hohlkugeln ausbilden können. Diese Organellen weisen extrem auseinander gezogene Abschnitte der Außen- und Innenmembran auf, die einen sehr schmalen Matrixspalt umschließen. Die Überexpression von Mdm33 führt zur Einstellung des Wachstums, die Mitochondrien aggregieren, und es entwickelt sich eine stark veränderte Innenmembranstruktur. Es bilden sich verstärkt Septen aus, die den Matrixraum mehrfach unterteilen, oder die Innenmembran verliert die Cristae und fragmentiert. Genetische Hinweise zeigen, dass das Mdm33-Protein vor den Komponenten der Teilungsmaschine der Außenmembran agiert, und dass die mitochondriale Fusion eine Voraussetzung für die Ausbildung der ausgedehnten ringähnlichen Mitochondrien in mdm33-Zellen ist. Mdm33 assembliert zu einem oligomeren Komplex in der Innenmembran und bildet homotypische Protein-Protein-Interaktionen aus. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mdm33 bei der Teilung der mitochondrialen Innenmembran involviert ist. Das Fzo1-Protein ist eine zentrale Komponente der mitochondrialen Fusionsmaschinerie in der Außenmembran. Fzo1 assembliert sowohl in S. cerevisiae als auch in N. crassa in einen großen Proteinkomplex. Es sollte untersucht werden, welche Proteine Bestandteile dieses Komplexes sind. Daher wurde ein N. crassa-Stamm erzeugt, der stabil Fzo1 mit einem Hexahistidinanhang exprimiert, um den Fzo1-Komplex in größeren Mengen reinigen und mögliche Interaktionspartner identifizieren zu können. Dieser gereinigte Fzo1-Komplex ermöglicht nun auch mechanistische Studien zur Funktionsweise der Fusionsmaschine.
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Die Proteintyrosinkinase (PTK) Syk wird ubiquitär in hämatopoetischen Zellen exprimiert und ist für die Weiterleitung von Signalen aktivierter Immunrezeptoren unerlässlich. Eine biologische Funktion von Syk wurde auch außerhalb hämatopoetischer Zellen postuliert. In Anbetracht dessen sollten in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen zur Funktion von Syk in humanen Brustepithelzellen durchgeführt werden. Einen Schwerpunkt bildete dabei die Analyse zur Expression und katalytischen Aktivität von Syk in nichttransformierten und transformierten humanen Brustzelllinien. So konnte katalytisch-aktives Syk in nichttransformierten und schwach-tumorigenen humanen Brustepithelzellen nachgewiesen werden, jedoch nicht in invasiven Brustkrebszellen, was bereits veröffentlichte Daten bestätigte (Coopman et al., 2000). Die Unterdrückung der endogenen Expression von Syk in nichttransformierten Brustepithelzellen vermittelte eine erhöhte EGF-induzierte Tyrosinphosphorylierung des EGFRs, während die exogene Expression von katalytisch-aktivem Syk diese reduzieren konnte. Ferner konnte gezeigt werden, dass reduzierte Syk-Level die EGF-stimulierte Tyrosinphosphorylierung von Signalproteinen steigerte und somit die Proliferationsrate nichttransformierter Brustepithelzellen sowie deren Resistenz gegenüber oxidativem Stress erhöhte. Aufbauend auf diesen Daten kann eine Funktion von Syk in der Regulation von EGFR-vermittelten Signalen in Brustepithelzellen postuliert werden. Die gesteigerte autokatalytische Aktivität von Syk in vitro, die durch die chemische Inhibition der EGFR-Kinase erzielt werden konnte, sowie die nachgewiesene Assoziation beider Proteine, suggerieren ebenfalls einen wechselseitigen Einfluss von Syk und EGFR. Andere Untersuchungen demonstrierten einen Syk-abhängigen Einfluss auf das Migrationsverhalten von Brustepithelzellen, wobei nichttransformierte Zellen mit reduzierter Expression von Syk in ihrer Motilität eingeschränkt waren, während invasive Brustkrebszellen durch die exogener Expression von katalytisch-aktivem Syk sowohl in ihrem Migrations- als auch in ihrem Invasionsvermögen supprimiert wurden. Zusätzlich konnte ein Syk-spezifischer Einfluss auf die Tyrosinphosphorylierung des Adaptorproteins Shc nachgewiesen werden, der über die Kinaseaktivität von Syk vermittelt wurde. Zusammengenommen liefern die vorgestellten Ergebnisse neue Erkenntnisse zur Funktion, Expression und Regulation von Syk in Brustepithelzellen und postulieren für Syk eine regulative Funktion innerhalb der EGF-stimulierten Signaltransduktion.
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In situations where well-established approaches such as surgery, radiation therapy and chemotherapy fail to help cancer patients, immunotherapy has the potential to be an effective alternative. Tumour cells can sometimes be distinguished from corresponding normal cells due to their expression of tumour-associated antigens (TAAs), most of which are unaltered self-molecules. These molecules must be presented to the immune system in the context of danger in order to achieve their specific recognition. If dendritic cells (DCs), the most potent professional antigen-presenting cells, are loaded with RNA, they will translate the RNA into protein, process the protein into peptides and present the peptides within MHC molecules (pMHC) on their surface to cytotoxic T-lymphocytes (CTLs) and T-helper cells in a stimulatory manner. These effector cells can, in turn, recognise tumour cells. The goal of these studies was to find optimal conditions for producing a DC-based vaccine for cancer patients using TAAs in the form of RNA. The studies were designed to quantitate RNA transfer into DCs, to determine the intracellular stability of transfected RNA in DCs and to analyse the kinetics of protein expression and the generation of functional pMHC ligands that could activate effector memory CTLs. Simultaneous activation of CTLs with specificities for different antigens minimises the potential for tumour escape through immune selection of tumour variants showing loss of individual antigens. Thus, generation of multiplex pMHC ligands for CTLs may improve clinical efficiency. On the other hand, peptide competition for MHC molecules within the DC may limit pMHC ligand generation. This central immunological question was addressed by comparing DCs loaded with total cellular tumour RNA, amplified total cellular tumour mRNA and pools of defined single-species tumour-antigen cRNAs versus individual single-species tumour-antigen cRNAs for their capacity to display various pMHC ligands and activate CTLs of corresponding specificities. Experiments performed with RNA encoding the enhanced green fluorescence protein (EGFP), a reporter protein, showed that the highest efficiency of RNA transfection into DCs was achieved with electroporation, reaching levels of 90% positive cells. The fact that mature DCs expressed more EGFP than immature DCs suggests that this stage of DC maturation will be optimal for vaccine development. Importantly, electroporation and RNA transfer did not alter the expression of antigen-presenting and co-stimulatory molecules on the surface of DCs. The melanoma model was chosen for extensive analyses because its characterisation at the cellular and molecular levels has made it a very informative model for understanding cancer immunity. In addition to total cellular melanoma RNA, single-species cRNAs were used encoding the melanoma-associated antigens, tyrosinase, Melan-A and CDK4-R24C. Antigen presentation was detected with the help of effector memory CTL clones specific for each of these antigens. The CTL stimulatory capacity of RNA-transfected DCs was higher if they were allowed one day to recuperate from electroporation and to produce pMHC complexes. Tyrosinase cRNA dose-finding showed that more RNA would indeed result in higher stimulatory capacities of transfected DCs. Kinetics of tyrosinase cRNA degradation, similar to kinetics of EGFP cRNA degradation, revealed that the amount of transfected RNA rapidly decreased inside the DCs within 1.5 hr after electroporation. The smallest decrease was observed with the highest amount of RNA applied in electroporation. The kinetics of RNA degradation and protein half-life will be important parameters to consider in defining the right time-frame for T-cell activation by engineered DCs. When reverse transcription PCR (RT-PCR) was performed with total cellular melanoma RNA samples to generate amplified mRNA, the Melan-A, tyrosinase and CDK4/CDK4-R24C message was amplified 62-fold, 24-fold and 2-fold, respectively. These differences likely reflect variations in the expression levels of the corresponding antigen message in melanoma cells from which the RNA was isolated. Approximately 17240-fold more CDK4-R24C message, at least 500-fold more tyrosinase message and at least 480-fold more Melan-A message was found in single-species cRNAs when the same masses of single-species cRNA and amplified melanoma mRNA samples were compared. This explained why electroporation of single-species cRNAs into DCs yielded the highest DC stimulatory capacities. Combinations of tyrosinase, Melan-A and CDK4-R24C cRNAs were studied for their capacity to induce satisfactory levels of T-cell stimulation when presented by DCs. Here it was demonstrated that antigen competition was not a critical factor, since CTL responses to pooled RNAs were not inhibited even though competition for MHC class I molecules may have occurred within the DCs. DCs also developed CTL stimulatory capacities, but at much lower levels, using amplified melanoma mRNA. Two antigen-specific CTL clones displayed higher reactivities upon exposure to pMHC produced naturally by RNA-transfected DCs than to synthetic peptides pulsed onto DCs. In one case, this could be explained by a post-translational modification of the peptide, which normally occurs within cells. Since this particular modification was not represented in the synthetic peptide, which was chosen from the protein sequence, the synthetic peptide was not well recognised. This demonstrated that the use of RNA technology eliminates the need to know the correct sequences of immunogenic peptides. Thereby, DCs are better than scientists at choosing antigens and their epitopes for presentation to T-cells. These data provided a better understanding of antigen presentation by DCs based on the use of RNA, giving insight into antigen competition and paving the way for the use of pooled RNAs of defined species for the development of a multiplex vaccine. They also allowed a precise protocol for efficient T-cell activation to be defined. Further experiments will demonstrate whether quantitative differences detected in antigen presentation between DCs loaded with total cellular tumour RNA and amplified total cellular tumour mRNA versus single-species tumour-antigen cRNAs have an impact on de novo T-cell priming in vitro and in vivo.
