Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv

EBV is a γ-herpes virus which is able to infect human resting B-cells and to transform them into permanently growing lymphoblastoid cell lines (LCLs). EBNA2 (Epstein-Barr virus nuclear antigen 2) is one of the first viral proteins expressed after in vitro infection and interacts with different cellular proteins like RBP-Jκ and PU.1. The EBNA2 protein acts as a transcriptional activator of the viral Latent Membrane Proteins 1 and 2 (LMP1 and LMP2) and the viral nuclear genes EBNA1, EBNA3A, -3B, -3C, EBNA-LP. Additionally EBNA2 is also able to transactivate cellular genes like CD21, CD23 or c-myc. To study the different EBNA2 target genes and the function of EBNA2 a LCL was established (ER/EB2-5 cells, Kempkes et al., 1995) harboring an estrogen-inducible EBNA2. In the presence of estrogen the ER/EBNA2 fusion protein (estrogen receptor binding domain) is located in the nucleus were EBNA2 can transactivate its target genes, whereas in the absence of estrogen the ER/EBNA2 fusion protein is kept in the cytoplasm and therefore inactive. The cells proliferate in the presence of estrogen and they arrest in the absence resulting in a phenotype similar to resting B-lymphocytes. By using the ER/EB2-5 cell line I could clearly show that the cell surface molecule CD83, belonging to the immunoglobuline superfamily (Zhou et al., 1992), is upregulated after the activation of EBNA2. By using a derivative ER/EB2-5 cell line that constitutively expressed LMP1 I could show that CD83 is still expressed even in the absence of functional EBNA2 suggesting that LMP1, the viral target gene of EBNA2, is responsible for the induction of CD83. Therefore I analysed the activation of the CD83 promoter by LMP1. LMP1 is a transmembrane protein with a short intracellular N-terminus, 6 hydrophobic transmembrane domains and a long intracellular C-terminus, containing C-terminal activator regions CTAR1, 2 and 3. The different CTAR regions are responsible for activating genes via NF-κB, ATF, AP1 and STAT signaling pathways. For the activation of its target genes LMP1 uses the same signaling molecules (TRAF, TRADD) as family members of the TNF-R family (CD40, TNF-R1, TNF-R2). The CD83 promoter was activated by LMP1 as shown by promoter luciferase reporter assays in 293-T cells. The induction was not observed in the absence of a NF-κB binding site in a CD83 promoter mutant. Furthermore LMP1 mutants which are mutated in the binding regions for TRAF2 (CTAR1) or TRADD (CTAR2) are not able to transactivate the CD83 promoter. By co-transfection of LMP1 and dominant/negative IκB the CD83 promoter could not be activated because of inactivation of NF-κB. These experiments clearly demonstrate that the CD83 promoter is transactivated by LMP1 via NF-κB. Additionally to the regulation of CD83 I was also interested in the functional role of CD83. Until now only little is known about the function of CD83. CD83 seems to have a specific role in the decision to single positive CD4+ T-cells in the thymus (Fujimoto et al., 2002). I have tested a possible co-stimulatory function of CD83 to CD4+ T-cells by retroviral expression of CD83 in non-professional antigen presenting cells (RCC). Indeed CD83 expression increased the CD4+ response in comparison to CD80 or GFP retroviral infected RCC cells. In mixed lymphocyte reactions this co-stimulatory effect could not be clearly demonstrated although a soluble CD83-Ig showed a small inhibitory influence. The identification of a CD83 ligand molecule could give new insights into the function of CD83. Therefore a CD83-Ig fusion protein as well as a CD83-tetramer construct were generated and used to screen for a potential ligand of CD83. First results showed that the CD83-Ig fusion protein and the CD83-tetramer construct bound to CD4+ and to CD8+ T-cells of isolated PBMCs as well as to activated T-cells in a culture of mixed T-cell populations.

Metastatic breast cancer is commonly thought to be incurable, but gene therapy strategies with suicide genes are emerging as a potential treatment for metastatic breast cancer. Retroviral vectors are attractive candidates for such in vivo gene therapy applications. Most of these vectors contain viral promoters that are not tissue specific. In order to specifically target malignant cells while at the same time sparing normal tissue, cancer gene therapy will need to combine highly selective delivery with highly specific gene expression, specific gene product activity and, possibly, specific drug activation. Use of cell type or tissue specific promoters would allow specificity of gene expression to be achieved. It is therefore important to identify and characterise tissue/tumour specific promoter/enhancer elements in and combination with retroviral vector systems. In this present study, the ProCon system was used to construct tissue specific vectors containing either the viral MMTV U3 region or the cellular WAP proximal promoter. It was important to characterise the vector system at the molecular level as well as investigating their targeted expression in vitro and in vivo. Validation of this system was first made with a hybrid MMTV-BAGgal vector. Here, it could be shown that the U3 from the 3' LTR could be replaced with the viral MMTV U3 region and that the hybrid vector behaves as expected at the molecular level throughout the whole transduction cycle. In transgenic mice, the ability of a small fragment of the WAP promoter to direct mammary specific expression was shown and this raised the possibility to replace the viral promoter with the WAP NRE. The replacement of viral U3 from the 3' LTR with the cellular WAP NRE showed no effect either at the molecular level or on the transduction cycle. These hybrid vectors were produced at titres ranging from 103 to 105 cfu/ml, showing that swapping of the U3 of 3' LTR with either heterologous viral or cellular sequences does not have an adverse affect on titre. Following infection and reverse transcription, the expression of reporter gene should be under the control of either the WAP NRE or the MMTV U3 region. In order to determine the activity of the WAP NRE and MMTV U3 in the context of a retroviral vector in vitro, suitable cell culture conditions were established for both primary breast tumour cells as well as established tumour cell lines. Primary human breast tumour cells and breast tumour or non-breast tumour cell lines were infected in monolayer culture and were analysed in a three dimensional cell culture system for expression of the reporter gene. Here, it was demonstrated that the MMTV U3 was mainly active in human breast tumours. The WAP NRE was also able to direct heterologous gene expression in the context of a modified retroviral vector in human breast tumour cell lines as well as in primary cells in culture, but not in other types of human tumour cells. The activity of the WAP NRE in human breast tumour cells was not necessarily to be expected, particularly since a human WAP homologue has yet to be identified. An in vivo approach involving transplantation into SCID/bg mice allowed a determination of whether or not the in vitro response is reflected in vivo and to complement the in vitro studies. This work showed that mice did indeed develop both tumours and metastases. Both the MMTV U3 and WAP NRE in the context of the ProCon system behaved in a similar manner both in vitro and in vivo. Transgenic mice were also made in order to analyse the tissue specificity of the MMTV U3 region in the context of the ProCon system. A recloned provirus DNA was used for the establishment of the mice. Expression of the MMTVProCon was mainly restricted to the mammary gland and spleen, mirroring the expression pattern of MMTV. The ability of the WAP proximal promoter and MMTV U3 region to function in the context of a retroviral vector is of interest for potential use to drive therapeutic gene expression in gene therapy strategies directed against breast cancer. Such genes could include those encoding toxic products, for example the diphtheria toxin gene or, alternatively, suicide genes allowing drug induced cell death with a bystander activity. Such strategies will be successful if ectopic expression can be avoided. In this study it was demonstrated that the proximal WAP promoter was more mammary tumour cell specific and it is therfore more suitable for use in gene therapy at this time. Whilst the MMTV U3 region, in the form used here, may exhibit ectopic expression, further experiments may identify regions or fragments that can be used without observing this phenomenon. Further, these experiments could be extended and combined with systematic delivery of hybrid retroviral vectors with a therapeutic gene either locally or into the bloodstream of xenotransplanted SCID/bg mice. In order to accomplish this, a high titre viral supernatant will be required and therefore efficient production systems will have to be developed and tested.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, verschiedene physiologische Parameter hinsichtlich ihres Einflusses auf die Kolonisierungs- und Plasmidtransfereffizienz von P. chlororaphis SPR044 in der Rhizosphäre von A. thaliana zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden TnMod-Insertionsderivate mit Veränderungen "Quorum-Sensing"-regulierter Funktionen untersucht. Darüber hinaus sollten Auswirkungen von pJP4 auf die Fitness von SPR044 festgestellt werden. Weiterhin sollte eine Strategie zur in situ-Detektion plasmid-tragender Stämme in der Rhizosphäre entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Das natürliche Isolat P. chlororaphis SPR044 produzierte BHSL, 3-OH-OHSL und ein weiteres, bisher nicht identifiziertes Acyl-HSL. Alle drei Acyl-HSLs wurden ebenfalls von den PCN-negativen SPR044-Derivaten sowie vom PCN-Überproduzierer produziert, nicht jedoch von den "Quorum-Sensing"-negativen Derivaten. Entsprechend der regulatorischen Funktion der Acyl-HSLs zeigten quantitative Analysen eine Korrelation zwischen der Menge von produzierten Acyl-HSLs, antimikrobiellen Metaboliten und extrazellulären Proteasen. Die einzige Ausnahme bildete der PCN-Überproduzierer. Dessen PCN-Überproduktion basiert vermutlich auf einer Veränderung des LPS und nicht auf der Ausschaltung eines negativen Regulators. In Einzelkultivierungs-Experimenten zeigte sich nach 14 Tagen kein Unterschied zwischen den Populationsgrößen des Wildtyps und der Derivate. Nach 28 und 42 Tagen war die Population des Wildtyps gleich groß wie die des PCN-negativen Derivats und signifikant größer als die des gacS-negativen Derivats und des PCN-Überproduzierers. In Kokultivierungs-Experimenten war die Population des gacS-negativen Derivats hingegen stets gleich groß wie die des Wildtyps. Eine Erklärung dieses Phänomens konnte durch Untersuchung der Wachstumskinetiken in Flüssigkultur erbracht werden. Die "Quorum-Sensing"-negativen Derivate wiesen eine stark verkürzte Lag-Phase und eine reduzierte Produktion des für die stationäre Phase spezifischen Sigmafaktors Rpos auf. Dies führte nach Koinokulation mit anderen Bakterien offenbar zu einer Aufhebung des selektiven Nachteils. Vermutlich nutzen die gacS-negativen Stämme komplexe C-Quellen, die durch die Enzyme des Wildtyps zugänglich gemacht werden und profitieren darüber hinaus von der verkürzten Lag-Phase. Die Frequenz des konjugativen pJP4-Transfers von SPR044 zu R. eutropha ist unabhängig von "Quorum-Sensing"- und PCN-Produktion. Die Transformation mit pJP4 per se hatte keinen negativen Einfluss auf die Rhizosphäre-Kolonisierungseffizienz von SPR044. Lag jedoch zusätzlich abiotischer oder biotischer Stress vor, manifestierte sich die metabolische Last durch pJP4 in einer verringerten Populationsgröße. Dieser Effekt war unabhängig vom "Quorum-Sensing"-System und der PCN-Produktion von SPR044. VirB5 von A. tumefaciens assembliert in einer höhermolekularen Struktur, die durch Scherkräfte von der Zelle gelöst und mittels Ultrazentrifugation sedimentiert werden kann. Bei verschiedenen Reinigungsschritten wurde eine Kofraktionierung mit der Haupt-Piluskomponente VirB2 beobachtet. VirB5 ist somit eine Nebenkomponente des T-Pilus. Das homologe Protein TraC aus dem IncN-Plasmid übt vermutlich eine ähnliche Funktion in pKM101-determinierten Pili aus. Zellfraktionierung pJP4-tragender P. chlororaphis-Zellen und Detektion mit spezifischen Antiseren deuten darauf hin, dass TrbC und TrbF Haupt- und Nebenkomponente pJP4-determinierter Pili sind. Bei TrbH handelt es sich um ein membran-assoziiertes Lipoprotein. Die Detektion pJP4-tragender Bakterien aus der Rhizosphäre war mit den TrbF- und TrbH-spezifischen Antiseren in situ möglich. Das TrbF-spezifische Antiserum ermöglichte die Erkennung IncP-Plasmid-tragender Bakterien. Das TrbH-spezifische Antiserum ermöglichte eine zusätzliche Unterscheidung zwischen IncPa- und IncPß-Plasmid-tragenden Zellen. Eine Kombination der Immunfluoreszenz-Analyse mit FISH erwies sich als geeignet für die Detektion von pJP4-Transfer zwischen SPR044 und R. eutropha in der Rhizosphäre von A. thaliana.

Die Pflanzenzelle enthält ein integriertes, kompartimentiertes genetisches System, mit den Subgenomen im Zellkern, in den Mitochondrien und den Plastiden, das aus Endocytobioseereignissen mit prokaryotischen Zellen hervorgegangen ist. Im Laufe der Evolution der eukaryotischen Zelle wurden die genetischen Potentiale der symbiontischen Partnerzellen vermischt. Dabei ging ein Teil genetischer Information verloren, ein anderer wurde aus den Organellen in den Kern transferiert, und außerdem wurde neue Information hinzugewonnen. Dies ging einher mit der Einbettung von Mitochondrien und Plastiden in die Signaltransduktionsketten und Regelkreise der Wirtszelle. Heute interagieren die Subgenome auf vielen Ebenen; ihre Expression wird in der Pflanzenzelle koordiniert in Raum, Zeit und Quantität reguliert. Die Interdependenz der Subgenome hatte ihre Koevolution zur Folge, so daß die genetischen Kompartimente der Zelle nicht mehr ohne weiteres zwischen Arten ausgetauscht werden können. Kombinationen von artfremden Organellen können zu Entwicklungsstörungen führen, wie sie sowohl von "kompartimentellen" (Genom/Plastom-) Hybriden als auch von Cybriden beschrieben worden sind (Bastardbleichheit, Bastardscheckung). In dieser Arbeit wurden reziproke Cybriden der Arten Atropa belladonna und Nicotiana tabacum auf molekulare Determinanten von Genom/Plastom-Inkompatibilität untersucht. Die Cybriden sind je nach Kombination elterlicher Organellen entweder albinotisch [Kern von Atropa, Plastide vom Tabak; Ab(Nt)-Cybride] oder gleichen dem Wildtyp [Kern von Tabak; Plastide von Atropa, Nt(Ab)-Cybride]. 1. Als Voraussetzung für einen Sequenzvergleich der plastidären Chromosomen beider Solanaceen-Arten wurde das Plastidenchromosom von Atropa komplett sequenziert. Der Vergleich der (Atropa)-Sequenz mit der bekannten des Chromosoms aus dem Tabak und anschließende molekularbiologische Untersuchungen führten zur Identifizierung von zwei potenziellen Ursachen für die Defekte im albinotischen Material. 2. Die Ab(Nt)-Cybride zeigt eine gestörte Akkumulation von Transkripten für eine Reihe von Operonen. Das resultierende aberrante Transkriptmuster ähnelte verblüffend dem von Tabakpflanzen mit Defizienz der plastidenkodierten RNA-Polymerase (PEP). Möglicherweise ist in der Cybride die Interaktion des PEP-Apoenzyms mit einem oder mehreren der kernkodierten Sigmafaktoren gestört. Tatsächlich unterscheiden sich die für eine Untereinheit der PEP kodierenden (plastidären) rpoC2-Gene von Tabak und Atropa durch eine Insertion/Deletion an einer Stelle im Molekül, die mit Sigmafaktoren interagieren kann. Transformation der Plastiden der Ab(Nt)-Cybride mit dem rpoC2-Gen aus Tabak führte in der Tat zu einer partiellen Reversion zum WT und macht Transkriptionsdefekte als eines von offenbar mehreren Determinanten für die Genom/Plastom-Inkompatibilität in Artbastarden wahrscheinlich. 3. Neben der Transkription ist im albinotischen Material auch die RNA-Edierung gestört. Die plastidären Editotypen beider Solanaceen ähneln einander, doch gibt es für beide Arten spezifische Edierungsstellen. Von den fünf tabakspezifischen Stellen in der Ab(Nt)-Cybride werden vier nicht ediert. Offensichtlich besitzt der Atropa-Kern nicht die notwendigen Kernfaktoren zur Prozessierung dieser Stellen. Da Edierung generell hochkonservierte und funktionell wichtige Aminosäurepositionen betrifft, trägt der Ausfall der Edierung sehr wahrscheinlich ebenfalls zum beobachteten Defekt in der Plastidenentwicklung bei. 4. Auf der anderen Seite werden die Stellen der grünen Nt(Ab)-Cybride, bemerkenswerterweise auch Atropa-spezifische, heterolog vom Tabakkern ediert. Der erstmalige Befund von heterologem Edieren stellte sich als Folge der Allotetraploidie von Tabak heraus. Untersuchungen dieser Stellen in den diploiden Eltern des allotetraploiden Tabaks, N. tomentosiformis als Nachkomme des Vaters und N. sylvestris als Nachkomme der Mutter, zeigten, daß der Tabak die Fähigkeit zur heterologen Edierung von Atropa-spezifischen Stellen wohl vom Vater ererbt hat. Dies wurde auch durch einen transplastomischen Ansatz bestätigt. In diesen Experimenten wurde die intronnahe ndhA-Edierungsstelle aus Spinat, die es auch in N. tomentosiformis gibt, nicht aber in N. sylvestris, in Tabak über ballistische Transformation eingebracht. 5. Über Konstruktionen, die entweder der gespleißen oder ungespleißten ndhA-mRNA inklusive der Edierungsstelle entsprachen, konnte gezeigt werden, daß die Edierung an dieser Stelle immer erst nach dem Spleißen erfolgt. Dies ist der erste Nachweis einer strikten kinetischen Verknüpfung von RNA-Edierung mit einem anderen mRNA-Reifungsschritt in Plastiden. Er zeigt an, daß das ndhA-Intron phylogenetisch älter als die ndhA-Edierungsstelle ist. Mechanistische Implikationen dieses Befundes werden diskutiert.

Diese Arbeit befasst sich mit der Embryonalentwicklung des Vorderhirns bei der Maus. Es werden die zellulären und molekularen Mechanismen untersucht, die eine distinkte Entwicklung von zwei benachbarten Regionen im Telencephalon, dem zerebralen Cortex und dem Striatum, ermöglichen. Es wird gezeigt, dass Zellen, die im Cortex entstehen, innerhalb des Cortex wandern, aber nicht über die Grenze in den Striatum hinein wandern können. Auf der anderen Seite können Zellen aus dem Striatum in den Cortex hinein wandern. Die Untersuchung dieser Zellwanderung in Mausmutanten zeigt, dass die Transkriptionsfaktoren Ngn2 und Pax6, die nur von den corticalen und Grenz-Zellen exprimiert werden, notwendig sind für die Restriktion der Zellen innerhalb des Cortex. Pax6 muss auch anwesend sein, um auch die Wanderung der striatalen Zellen gering zu halten. Weiterhin wird gezeigt, dass die interzelluläre Kommunikation via Gap-Junctions an der Grenzregion zwischen Cortex und Striatum unterbrochen wird. Somit weist die cortico-striatale Grenze die gleichen Merkmale wie andere Grenzen in der Embryonalentwicklung von Vertebraten oder auch von Insekten: Eine distinkte Genexpression, die Restriktion der Zellwanderung, und die Unterbrechung der interzellulären Kommunikation.

Die neuronalen Grundlagen individueller Unterschiede im Angstverhalten sowie die biologischen Ursachen pathologischer Angst sind bisher weitgehend unerforscht. Ein geeignetes Forschungsmodell stellen die Rattenlinien HAB (high anxiety-related behavior) und ihr Gegenstück LAB (low anxiety-related behavior) dar, die durch selektive Züchtung nach dem Kriterium ihres Verhaltens in einem Angsttest für Nager aus einer Normalpopulation hervorgegangen sind. Das Benzodiazepin Diazepam wirkt bei HAB-Ratten wesentlich stärker anxiolytisch als bei LAB-Ratten. Man kann daraus folgern, daß Diazepam differentiell auf Hirnregionen wirken muß, die Angstverhalten steuern. In umgekehrter Logik sollte eine Region, für die gezeigt werden kann, daß sie von Diazepam unterschiedlich angesprochen wird, eine Rolle in der extrem unterschiedlichen Regulation des Angstverhaltens bei den beiden Linien spielen. Zur Identifizierung dieser Kandidatenregionen wurde eine neue Methode zur Kartierung von Hirnaktivierungänderungen, die pharmakologische funktionelle Magnetresonanztomographie (phMRI), erstmals in einem Tomographen der Feldstärke 7 Tesla etabliert. Methodische Besonderheiten der hohen Feldstärke wurden untersucht. Durch den Vergleich der Hirnaktivierungsänderungen nach Diazepam-Gabe zwischen HAB- und LAB-Ratten gelang es, als wichtigste Kandidatenregion für die unterschiedliche Regulation des Angstverhalten den medialen präfrontalen Kortex und das vordere Zingulum (mPFC/ACC) zu identifizieren, eine Region, die von anderen Autoren als Angst-modulierende Region vorgeschlagen wurde. Basierend auf diesen Daten wurde die Hypothese einer Hypoaktivität des mPFC/ACC in hyperängstlichen Individuen entwickelt. Diese Hypothese kann im Tier- sowie Humanmodell getestet werden. Insbesondere ist die Untersuchung der Funktion des mPFC/ACC in Angstpatienten von Interesse, da die Charakterisierung der biologischen Substrate übersteigerten Angstverhaltens grundlegend für das Verständnis der affektiven Erkrankungen und die Entwicklung neuer Therapieansätze ist.

Die regulatorischen Fähigkeiten des RNS-Bindeproteins CHLAMY 1 aus C. reinhardtii wurden unter Verwendung eines chimären Reporterkonstruktes überprüft. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass ein in CHLAMY 1- angereichertes Proteingemisch die Translation dieses Reporterkonstruktes in einem zellfreien System um durchschnittlich 14,56 % reprimieren konnte. Durch eine Molekularmassenbestimmung unter nativen und denaturierenden Bedingungen wurde der Aufbau von CHLAMY 1 aus mehreren Untereinheiten gezeigt. Der native Komplex hat eine Größe von ca. 160 kDa und besteht, ausgehend von den in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten unter denaturierenden Bedingungen, aus den drei Untereinheiten C1 bis C3. Die Aufreinigung von CHLAMY 1 wurde in drei Schritten ausgeführt: (a) Herstellung eines Rohextraktes, (b) Durchführung einer 0,5-1 M AS-Fällung und (c) Ausführung einer spezifischen RNS-Affinitätschromatographie. Es konnten dadurch drei für CHLAMY 1 spezifische Proteine mit den Molekularmassen 60, 50 und 44 kDa aufgereinigt werden. Durch eine Peptid-Sequenzierung wurden insgesamt neun Peptide mit einer Länge von bis zu 24 Aminosäuren sequenziert. Hierbei wurde ein Peptid identifiziert, das Bestandteil der zwei Untereinheiten C1 und C2 ist. In Western Blot-Analysen mit C. reinhardtii-Rohextrakten und Peptid- Antikörpern wurde die Abundanz der CHLAMY 1-Untereinheiten über einen Tag-Nacht-Verlauf bestimmt. Die Untereinheit C1 (60 kDa) scheint konstitutiv exprimiert zu werden, wohingegen die Expression von C3 (44 kDa) von der inneren Uhr kontrolliert zu sein scheint. Durch die Sichtung einer Expressions-Genbank aus C. reinhardtii mit Peptid- Antikörpern wurden zwei für CHLAMY 1 kodierende cDNS-Fragmente isoliert und durch EST-Klone aus dem Sequenzierungsprojekt von C. reinhardtii Richtung 5’-Ende verlängert. Alle Peptide der Untereinheiten C1 und C2 konnten in einer cDNS identifiziert werden, deren ORF für ein Protein von 51,73 kDa kodiert. Für die Untereinheit C3 wurde ein ORF identifiziert, der für ein Protein der Molekularmasse 45,00 kDa kodiert. In allen Proteinen wurden Regionen für mögliche posttranslationale Modifikationen identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass „UG“-Bindeproteine auch in anderen Organismen vorkommen. CHLAMY 1 kann spezifisch an die 16 „UG“-Wiederholungen in der 3’-NTR der regA-mRNS aus V. carteri binden. In dieser Kugelalge wurde außerdem ein RNS-Bindeprotein (VOLVO 1) identifiziert, das spezifisch an diese „UG“-haltige Region bindet. Im Pilz N. crassa konnte ein CHLAMY 1 analoges Protein identifiziert werden (CRASSA 1), das an die sieben „UG“-Wiederholungen in der 3’-NTR von gs2wt aus C. reinhardtii binden kann. Die Bindeaktivität in einem Tag-Nacht-Verlauf scheint von der circadianen Uhr gesteuert zu werden.