Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/07 Archiv

Epilepsien zählen zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen des Menschen, aber auch der Hunde und Katzen. Sie sind mit erheblichen Einschränkungen der Lebensqualität und Lebenserwartung verbunden und führen zu einer fortschreitenden Schädigung des gesamten Nervensystems. Gegenwärtig ist die wichtigste Therapieform der Epilepsie nach wie vor die Pharmakotherapie. Ungeachtet einer Vielzahl neuer Antiepileptika kann jedoch bei über 30% der Patienten mit Epilepsien durch eine medikamentelle Therapie keine ausreichende Kontrolle der Anfälle herbeigeführt werden, was neue Therapie- und Behandlungsstrategien unbedingt erforderlich macht. Eine, der im Zusammenhang mit einer Pharmakoresistenz am häufigsten erwähnten Thesen, ist die Multidrug-Transporter-Hypothese. Hier wird davon ausgegangen, dass es, durch an der Blut-Hirn-Schranke überexprimierte Efflux-Transporter, nicht zu einer ausreichend hohen Konzentration eines Antiepileptikums im neuronalen Gewebe kommt. Dem Multidrug-Transporter P-Glycoprotein (Pgp) wird dabei eine besondere Bedeutung beigemessen. Basierend auf der Multidrug-Transporter-Hypothese war es ein Ziel dieses Dissertationsvorhabenes die Regulation der anfallsinduzierten Pgp-Überexpression genauer zu charakterisieren, um daraus resultierend mögliche neue Angriffspunkte für eine Modulation der Pgp-Überexpression zu identifizieren. In einem ersten Teil der Dissertation wurde deshalb die Spezifität der molekularen Veränderungen des verwendeten Tiermodells untersucht. Hierfür wurde die Wirkung von spontanen Anfällen und eines SE auf die Pgp-Expression im Kaninen Gehirn untersucht. Die Untersuchungen zeigten, dass wie im Tiermodell auch nach einem spontan ablaufenden SE eine deutliche Induktion des Mutlidrug-Transporters Pgp an der Blut-Hirn-Schranke nachweisbar ist. Da bisherige Forschungsarbeiten unserer Arbeitsgruppe auf eine besondere Bedeutung des Glutamat/NMDA-Rezeptor/COX 2-Weges für die anfallsinduzierte Pgp-Überexpression in Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke hinweisen, wurden in diesem Dissertationsprojekt eingehende Untersuchungen durchgeführt, die darauf abzielten diesen Signalweg weiter aufzuklären. Durch vorausgegangene in vitro Untersuchungen wurde davon ausgegangen, dass die weitere Pgp-Induktion über den EP-1-Rezeptor von PGE2 abläuft. Diese Annahme konnte durch die Verwendung des EP-1-Rezeptor Hemmers SC- 51089 in vivo im Rahmen dieses Dissertationsprojektes bestätigt werden. Ein neuroprotektiver Effekt dieser Substanz konnte jedoch bei der verwendeten Konzentration von SC 51089 in diesem SE-Modell im Hilus nicht nachgewiesen werden. Weiterhin wurden Untersuchungen zu möglichen Downstream-Elementen des EP-1-Rezeptors angeschlossen, den Transkriptionsfaktoren YB-1 und ZONAB. Erstmalig konnte eine Expression dieser Transkriptionsfaktoren im adulten Gehirn unterschiedlicher Spezies nachgewiesen werden, die jedoch vermutlich nicht mit der anfallsinduzierten Pgp-Überexpression im Zusammenhang steht. Die bisherigen Ergebnisse demonstrieren jedoch, dass durch eine genaue Kenntnis, der an der Regulation der Pgp-Überexpression beteiligten Faktoren, eine Modulation bzw. Inhibtion der anfallsinduzierten Induktion von Pgp möglich ist und dadurch eine hoffnungsvolle Möglichkeit zur Behandlung und zur Prävention einer Multidrug-Transporter basierten Pharmakoresistenz geschaffen werden kann.

The main aim of this thesis was to find out which donor cells would be most suitable for production of cloned rabbits with a targeted modification of their genome, and their corresponding patterns of reprogramming hetero- and euchromatic histone modifications (H3K4m2/3 and H3K27m3). For these purposes, we carried out NT with rabbit mesenchymal stem cells (MSCs) and adult fibroblasts (RAFs). As totally 13 cell lines of MSCs have been tested, they didn’t show stably higher development potential than RAFs, even though the blastocyst rate of embryos cloned from MSC A/B reached to 76%. Finally two cloned rabbits were produced from meschnymal stem cells. H3K27m3 was undetectable in all stages of nuclear transfer embryos except for one cell stage and blastocysts. It seems that H3K27m3 is faithfully reprogrammed in transferred nuclei of all donor cell types, with minor differences in zygotes and blastocysts. Strong signals for H3K4m2/3 were detected at the one to two-cell stages of in vivo embryos with a slight decrease at the 4-cell stage, followed by a more drastic decrease at the 8-cell stage, where the signal minimum was reached. In 16-cell embryos signals slightly increased and then reached in morulae and blastocysts the levels observed in one-two cell embryos. In all types of nuclear transfer embryos fluorescence intensity ratios differed from that of in vivo embryos. The minimum was not reached at the 8-cell stage but at the 4-cell stage. Reprogramming of H3K4m2/3 modification occurred quite differently with either type of cells irrespective of the cell origin or type and no close similarities in the patterns of this reprogramming was observed between in vivo and nuclear transfer embryos. Embryos cloned from MSC A/B differed from all others in the way that H3K4m2/3 was generally lower and remained in the range of the donor cells. This suggests that reprogramming of H3K4m2/3 modification is more aberrant with MSC A/B cells than with any other cell type used in this study. However, with MSC A/B cells, a significantly higher or similar proportion of cloned embryos developed to blastocysts indicating that reprogramming of H3K4m2/3 modification does not correlate with developmental potential of donor cells. In conclusion, our study provides evidence that histone modifications for heterochromatin are faithfully reprogrammed during NT of rabbit somatic cells, while patterns of epigenetic reprogramming of euchromatic histone modifications differ between individual cell lines irrespective of their origin or type and are not correlated with their developmental potential. Although MSCs were not superior to RAFs in respect to the criteria tested in our study they may be suitable nuclear donors for generating transgenic cloned rabbits due to their high developmental plasticity.

Epilepsien sind die häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen bei Hund, Katze und Mensch. Die bedeutendste Therapieform von Epilepsien ist die langfristige, kausale Pharmakotherapie mit dem Ziel der Anfallsreduktion bzw. Anfallssuppression. Diese zumeist lebenslang andauernde Behandlung mit Antiepileptika ist häufig mit schweren Nebenwirkungen verbunden. Aus diesen Gründen wäre eine prophylaktische Therapie, die die Entstehung von Epilepsien (Epileptogenese) verhindert, wünschenswert. Die Mehrzahl der Epilepsien wird durch symptomatische Ursachen, wie Schädelhirntraumen oder Schlaganfälle bedingt. Diese initialen Insulte verursachen in der Folge, über nur unzureichend bekannte Mechanismen, die Generierung eines neuronalen Netzwerkes, das die Manifestation einer Epilepsie begünstigt. Verschiedene Untersuchungen der letzten Jahren gaben Hinweise, dass Veränderungen der neuronalen Plastizität insbesondere massive Neuronenverluste sowie eine gestörte Neuronenneubildung eine zentrale Bedeutung im Rahmen der Epileptogenese einnehmen könnten. Bisherige Forschungsarbeiten bestätigen eine Modulatorfunktion des neuronalen Zelladhäsionsmoleküls (NCAM) und des Hormons Erythropoetin (EPO) für die neuronale Plastizität. Auf Grund dessen wurden in dieser Arbeit die Effekte des NCAM-mimetischen Peptids Plannexin sowie der beiden EPO-mimetischen Peptide Epotris und Epobis auf anfallsinduzierte neuronale Veränderungen, insbesondere auf neurodegenerative Vorgänge und auf die Neubildung von Neuronen untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen konnten eine modulierende Funktion des NCAM-mimetischen Peptids Plannexin und des EPO-mimetischen Peptids Epotris auf die neuronale Plastizität insbesondere auf die anfallsinduzierte gestörte Neuronenneubildung demonstrieren. Die dringende Notwendigkeit einer prophylaktischen Therapie ergibt sich vor allem aus der Tatsache, dass ungeachtet einer Vielzahl von Antiepileptika in der Tier- und Humanmedizin etwa ein Drittel aller Veterinär- und Humanpatienten nicht auf eine Pharmakotherapie anspricht. Diese pharmakoresistente Form der Epilepsie stellt ein gravierendes, bisher ungelöstes Problem dar und geht mit einer hohen Morbidität und Mortalität einher. Als eine Ursache für das Auftreten von Pharmakoresistenzen bei Epilepsiepatienten wird eine Überexpression verschiedener sogenannter Multidrug-Transporter diskutiert. Dem Multidrug-Transporter P-Glycoprotein (Pgp) wird im Zusammenhang mit transporterbasierten Pharmakoresistenzen bei Epilepsien eine besondere Bedeutung beigemessen. Im Rahmen dieser Dissertation konnte anhand unterschiedlicher Versuchsansätze erstmals in vivo gezeigt werden, dass eine Reduktion der Pgp-Expression in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke mittels RNA-Interferenz möglich ist.

Fertility problems are the main reason for slaughter of high-performance milk cows, because prolonged calving intervals result in financial losses for the farmer and retard genetic progress. Genetic improvement of fertility would be of great benefit, but functional traits for effective selection are missing. Recent advances in functional genomics tools like DNA microarrays could be the key to identify gene expression patterns in the endometrium that correlate with maternal fertility. Therefore, a bovine oviduct and endometrium cDNA array was established that contains a set of 1,440 cDNA clones and long oligonucleotides representing 950 different genes. The major part of these genes results from a series of differential gene expression studies in endometrium (different stages of the oestrous cycle, day 18 and day 15 pregnant vs. nonpregnant) and oviduct epithelial cells (different stages of the oestrous cycle). Using this custom-made cDNA array the response of the endometrium was studied to the changing hormonal environment during the bovine oestrous cycle. Endometrium samples were recovered from Simmental heifers slaughtered on day 0 (oestrus), 3.5 (metoestrus), 12 (dioestrus) and 18. The latter group was divided into animals with high (late dioestrus) and low progesterone levels (preoestrus). Statistical analysis with the Significance Analysis of Microarrays (SAM) method revealed 269 genes exhibiting significant changes in their transcript levels during the oestrous cycle in distinct temporal patterns. Two major types of expression profiles were observed, which showed the highest mRNA levels during the oestrus phase or the highest levels during the luteal phase, respectively. A minor group of genes exhibited the highest mRNA levels on day 3.5. Gene ontology (GO) analyses revealed GO categories related to extracellular matrix remodelling, transport, and cell growth and morphogenesis enriched at oestrus, whereas immune response and particular metabolic pathways were overrepresented at dioestrus. Generation of gene interaction networks uncovered genes possibly involved in biological processes important for establishment of early pregnancy, such as endometrial remodelling (e.g. collagen genes, MMP2, TIMP1), regulation of angiogenesis (e.g. ANGPTL2, TEK), regulation of invasive growth (e.g. PCSK5, tight junction proteins, ITGB4), cell adhesion (e.g. MUC16, LGALS3BP) and embryo feeding (e.g. SLC1A1, ENPP1). Localisation of mRNA expression in the endometrium was analysed for CLDN4, CLDN10, TJP1, PCSK5, MAGED1, and LGALS1. Future application of the BOE array, based on the knowledge from the cycle study, could be the use in systematic studies of interactions between the metabolic status and functionality of the endometrium to identify genes that could be used for differential diagnosis of fertility problems.

Osteosarcoma – a retrospective study In dogs osteosarcoma is rare, but it is the most common primary bone tumor diagnosed in dogs. Most osteosarcomas occur in large and older dogs. Most frequent location site of osteosarcoma in dog is the forderlimb. Diagnosis depends on histological evaluation, but in radiological examinations the typical signs are very characteristic. Dogs with osteosarcoma have an poor prognosis. In more than 90% of cases micrometastases have been developed at time of clinical presentation. Beeing treated or being not treated most of the dogs die on the effects of metastatic disease. Studies of the last years showed that the usage of different surgical and medical treatment options results in an improvement of quality of life and survival. The treatment options are both definitive and palliative. Chosing an definitive task for treatment of osteosarcoma the surgical treatment of the affected site by amputation or limb-sparing is the basic option. It must be combined with adjuvant treatment. The usage of cisplatin and/ -or doxorubicin results in an significant improvement of survival. With the usage of neoadjuvant treatment the tumor process can be minimized on a stage that improves surgical treatment and after operation the control of process, by downstaging. Is no chance for surgical treatment, palliative treatment options must be considered to provide pain control and an acceptable quality of life. In this case radiotherapy is an successful option.

Investigations of the low anion gap in cattle of the Clinic for Ruminants (Munich)