Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/07 Archiv

Da die Magnetresonanztomographie seit mehreren Jahren verstärkt in der Pferdeorthopädie zur Darstellung von Weichteilschäden im Hufbereich genutzt wird, galt das Interesse der vorliegenden Studie kernspintomographische Signalveränderungen der tiefen Beugesehne im Hufbereich histopathologisch zu verifizieren. Die klinische Relevanz der gewählten Frage¬stellung liegt in der Feststellung der diagnostischen Zuverlässigkeit der Niederfeld- Magnetresonanztomographie bei Läsionen der tiefen Beugesehne. Erstmals wurden hierfür die kernspintomographischen Untersuchungen am lebenden, stehenden Pferd vorgenommen. 3 Vorderhufe von 2 orthopädisch gesunden Pferden und 15 Vorderhufe von 12 lahmen Pferden wurden kernspintomographisch untersucht. Die Untersuchung erfolgte am stehenden, sedierten Pferd an einem Niederfeldsystem, dem Hallmarq Veterinarian Limb Scanner (Hallmarq Veterinary Imaging Ltd., Guildford, Großbritannien) mit einer Feldstärke von 0,27 T. Die Hufregion wurde jeweils anhand eines Standardprotokolls, das T1-, T2- und T2*-gewichtete Gradientenecho- und Fast-Spinechosequenzen und eine Short-Tau-Inversion-Recovery-Sequenz enthielt, untersucht. Die Schnittbilder wurden in der sagittalen, transversalen, frontalen und horizontalen Ebene angefertigt. Die Bereiche der tiefen Beugesehne, die kernspintomographisch Signalveränderungen aufwiesen, wurden nach Euthanasie histopathologisch vergleichend untersucht und die pathologischen Veränderungen dokumentiert. Die klinisch und kernspintomographisch gesunden Pferde der Kontrollgruppe zeigten histologisch geringe knorpelige Anteile der tiefen Beugesehne im Bereich der Insertion und auf Höhe des Strahlbeines. Diese Knorpelanteile wurden als physiologisch für eine Gleitsehne wie die tiefe Beugesehne auf Höhe ihres Widerlagers eingestuft. Die kernspintomographisch veränderten tiefen Beugesehnen imponierten histopathologisch vorwiegend durch hochgradige, chronische, degenerative Tendopathien. Diese Tendopathien traten in Form von zystischen Nekrosen, teils hyalinknorpeligen Metaplasien sowie Verknöcherungen auf. Alle kernspintomographisch erhobenen Befunde konnten histopathologisch verifiziert werden. Es bestanden jedoch keine Abweichungen zwischen den Signalerhöhungen der T1- und der T2*-Wichtung, so dass die Qualität der Läsion der tiefen Beugesehne sich kernspintomographisch nicht ausmachen ließ. Hingegen war eine quantitative Erfassung eines Sehnenschadens kernspintomographisch sicher durchführbar. Somit stellt die Magnet¬resonanztomographie am stehenden Pferd mit dem Hallmarq Veterinarian Limb Scanner ein sensitives Verfahren zur Diagnostik von Läsionen der tiefen Beugesehne im Hufbereich dar.

B. cereus zählt zu den wichtigsten Verursachern von Qualitätsminderung und Verderb bei Lebensmitteln. Daneben wächst die Bedeutung Toxin-bildender B. cereus Stämme als Auslöser Lebensmittel-bedingter Erkrankungen, die zwei Formen einer gastrointestentinalen Erkrankung hervorrufen können: das diarrhoeische Syndrom, welches durch verschiedene Enterotoxinkomplexe (HBL, Nhe) induziert wird, und das emetische Syndrom, welches durch ein Dodekadepsipetid (Cereulid) ausgelöst wird. In komplexen Lebensmitteln werden vielfach Gewürze als Vektor für B. cereus - Kontaminationen angesehen. Jedoch sind kaum Studien über Gewürze als mögliche Eintragsquelle für B. cereus in Lebensmittel publiziert. Auch liegen nur wenig aktuelle Daten aus dem europäischen Raum über die tatsächliche Belastung von Gewürzen mit diesem Erreger vor. Ziel dieser Arbeit war es, das Vorkommen und die Toxizität von B. cereus in Gewürzen analysieren, um eine aktuelle Übersicht über die Kontamination mit diesem Erreger für eine Bewertung der mikrobiologischen Sicherheit von Gewürzen zu gewinnen. Hierfür wurden insgesamt 60 Gewürzproben zwölf verschiedener Gewürzsorten untersucht. Zunächst wurde mittels kultureller Verfahren die aerobe mesophile Gesamtkeimzahl sowie die Belastung mit Enterobacteriaceae und präsumtiven B. cereus bestimmt. Um auch kleinste Mengen des Erregers sicher nachweisen zu können, wurde zudem ein Real-Time PCR Assay als Alternative zur zeitaufwendigen und diagnostisch ungenauen konventionellen MPN- Methode erarbeitet. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden 151 präsumtive Kolonien, die aus den untersuchten Gewürzproben (n=60) isoliert wurden, mittels biochemischer und molekularbiologischer Analyse als B. cereus bestätigt. Anschließend wurde die Toxigenität und Toxizität der Isolate mittels PCR, immunchemischer Nachweisverfahren (ELISA, RPLA) sowie im Zellkulturtest charakterisiert. Darüberhinaus wurde im Challenge-Test mit marinierten Fleischerzeugnissen untersucht, inwieweit eine Kontamination von Lebensmitteln mit B. cereus tatsächlich aus der Verwendung kontaminierter Gewürze resultiert. Nach mikrobiologischer Analyse der Gewürzprodukte (n=60), waren nahezu alle der Proben als mikrobiologisch unbedenklich einzustufen. Kein Produkt hat den von der DGHM und der Europäischen Kommission empfohlenen Richtwert für B. cereus in Gewürzen von 103 KbE/g überschritten. Mit dem Real-Time PCR-Assay wurde zudem eine zuverlässige Alternative zum konventionellen MPN - Verfahren erarbeitet, der es ermöglichte auch kleinste B. cereus Mengen nach selektiver Anreicherung in den Gewürzproben zu identifizieren. Dies ist insbesondere im Hinblick auf das gesundheitsgefährdende Potential pathogener B. cereus von Bedeutung. So wurden 81% der Isolate (n=151), die aus den Gewürzen gewonnen wurden als diarrhöische und/oder emetische Toxinbildner identifiziert. Zudem wurde gezeigt, dass eine B. cereus Kontamination von Lebensmitteln durchaus aus der Verwendung damit hergestellter, belasteter Gewürze resultieren kann. Jedoch ist das Risiko für den Verbraucher hinsichtlich einer Lebensmittelvergiftung durch kontaminierte Gewürze als gering einzustufen. Zwar wurde B. cereus in 70 % der insgesamt 60 untersuchten Proben detektiert, allerdings in Keimzahlen, die nach derzeitigem Stand der Wissenschaft keine Lebensmittelvergiftung auslösen können. Dennoch ist das Gesundheitsrisiko, das von toxinbildenden B. cereus ausgeht nicht zu unterschätzen, da sie als Sporenbildner Erhitzungsprozesse von Lebensmitteln überleben, wieder auskeimen und sich vermehren können. Das Vorkommen von B. cereus in Gewürzen ist somit unter den Gesichtspunkten eines vorbeugenden Verbraucherschutzes und der Qualitätssicherung zu betrachten, nicht zuletzt da es auch angesichts eines stetig wachsenden Welthandels im Zuge der Globalisierung immer dringlicher wird eine mikrobiologisch unbedenkliche Ware zu gewährleisten. Letztendlich sind weitere Untersuchungen mit größeren Probenzahlen für eine besserere Risikoabschätzung unumgänglich. Mit dem Real-Time PCR Assay steht hierfür eine schnelle und zuverlässige Methode zur Verfügung, die einen Erregernachweis direkt aus Gewürzproben erlaubt.

Zielsetzung und Fragestellung: Die Regenerative Medizin weckt mit der Entwicklung vitalisierter Ersatzmaterialien große Hoffnung für künftige Behandlungsmethoden ausgedehnter Knochendefekte. Im Vorfeld der Übertragung auf die Klinik gilt es jedoch, Materialien eingehend zu testen, um das Risikoprofil neuartiger Implantate besser abschätzen zu können. Dies besitzt für die Human- und Veterinärmedizin gleichermaßen Gültigkeit. Vor diesem Hintergrund war es Gegenstand der hier vorgestellten Arbeit, ein Defektmodell in der Ratte für die orthotope Testung zellbesiedelter Gewebekonstrukte zu etablieren. Selbstentworfene Leitschienen für den Knochenersatz wurden zunächst in vitro getestet und optimiert, um im Anschluss in einer Pilotstudie in vivo auf ihr heilungsförderndes Potential getestet zu werden. Material und Methoden: Die Studie wurde in konsekutive Abschnitte gegliedert. Die Implantatentwicklung umfasste die Strukturgenerierung dreidimensional mittels Rapid-Prototyping-Verfahren hergestellter Hydroxylapatitkeramiken. In vitro wurde das Verhalten humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSC) auf diesen Leitschienen hinsichtlich Zellverteilung, -vitalität und Differenzierbarkeit überprüft. Für die Etablierung des orthotopen Defektmodells wurden Osteosynthesesysteme entworfen und auf ihre mechanische Belastbarkeit sowie auf ihre Anwendbarkeit am Tier getestet. In einer dritten Stufe wurde der Einfluss der entwickelten Knochenersatzmaterialien auf die Knochenheilung sowohl in Kombination mit hMSC als auch ohne Zellen im präklinischen Tiermodell getestet. Die Auswertung erfolgte mit radiologischen und histologischen Techniken über zwei beziehungsweise zwölf Wochen. Ergebnisse: Keramikleitschienen aus Hydroxylapatit konnten mit Rapid-Prototyping-Verfahren in einer an die Defektgröße angepassten Dimension (3 x 6 mm) hergestellt werden. Die allgemeinen Anforderungen für Knochenersatzmaterialien hinsichtlich Stegbreiten, Porengrößen und Interkonnektivität des Porensystems wurden gänzlich erfüllt. Anhand von Zellkulturversuchen wurde die am besten geeignete Teststruktur für die In-vivo-Versuche ausgewählt. Kriterien waren ein gleichmäßiges Verteilungsmuster, hohe Vitalität sowie Differenzierbarkeit humaner mesenchymaler Stammzellen auf den Materialien. Für die Etablierung eines Defektmodells am Rattenfemur wurde zunächst ein geeignetes Fixationssystem für die Osteosynthese ausgewählt. Ein externer Fixateur wurde eigens entworfen und nach einem Stereolithographieverfahren aus leichten Polymerkunststoffen gebaut. In der mechanischen Testung verschiedener Osteosynthesesyteme (zwei externe Fixateure, eine Titanplatte für die interne Fixation) zeigte sich eine ausreichende Stabilität aller ausgewählten Testobjekte. Aufgrund der besten intraoperativen Anwendbarkeit und dem höchsten Tragekomfort für das Tier wurde die Platte für die Anwendung in vivo ausgewählt. In einem 6 mm großen Vollschaftdefekt der Femurdiaphyse wurden die zuvor entwickelten Implantate getestet. Als Kontrollen dienten biologische Keramiken. Weder die radiologischen noch die histologischen Ergebnisse ließen substanzielle Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen erkennen. Eine knöcherne Konsolidierung der Defektzone wurde auch nach einer zwölfwöchigen Nachbeobachtungszeit nicht nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten sich weitgehend unabhängig von der Art der Leitschienenbehandlungen (ohne, beziehungsweise mit Zellbesiedelung). Jedoch wurden Tendenzen ersichtlich, dass eine Zellbehandlung der Implantate die Knochenneubildung begünstigt. Schlussfolgerungen: 1. Rapid-Prototyping-Verfahren stellen eine gut geeignete Methode für die Herstellung feinstrukturierter biokompatibler Knochenersatzmaterialien dar. 2. Reine Hydroxylapatitkeramiken können die Knochenregeneration eines Vollschaftdefektes nicht ausreichend unterstützen. Eine Vitalisierung der Implantate resultiert nicht in einer vollständigen Heilung nach einem Nachbeobachtungszeitraum von 12 Wochen, eine Tendenz zu einer weiter reichenden Knochenneubildung liegt jedoch vor. 3. Auch biologische Keramiken (zellfreie bovine Knochenmatrix) können keine Defektheilung bewirken. Dies gilt ebenso für unbesiedelte Implantate wie für Zellträger. 4. Ein 6 mm Vollschaftdefekt der Femurdiaphyse stellt einen Defekt kritischer Größe dar. Dabei bleibt das Regenerationspotential grundsätzlich unberührt. Der Einfluss unterschiedlicher Implantate auf den Heilungsprozess kann somit bewertet werden. Mit histologischen und radiologischen Methoden kann der Effekt verschiedener Implantate auf die Knochenheilung adäquat abgebildet werden. Ausblick: In dem hier vorgestellten Projekt wurden Ergebnisse generiert, die einige Schwächen der bisher verwendeten Implantate aufdecken konnten. Zum einen scheint das osteogenetische Potential der transplantierten Zellen für eine Defektüberbrückung nicht ausreichend zu sein und zum anderen steht deren Vitalität nach erfolgter Übertragung in Frage. Um zu einem besseren funktionellen Ergebnis zu gelangen werden derzeit zwei Studienansätze verfolgt. So sollen mit Methoden des lentiviralen Gentransfers humane mesenchymale Stammzellen modifiziert werden. Durch stabile Überexpression von BMP-2 können diese Zellen die Therapie ausgedehnter Knochendefekte ermöglichen. Ein weiterer Ansatz versucht, die Probleme des mangelhaften Zellüberlebens zu lösen. Dies soll in vivo durch eine axiale Perfusion der Zellträger, die eine Gefäßneubildung innerhalb der Konstrukte bewirkt, erreicht werden. Nachfolgend wird eine Testung der modifizierten Zellen beziehungsweise der prävaskularisierten Leitschienen im Hinblick auf deren Potential, die Geweberegeneration zu unterstützen, in dem hier etablierten orthotopen Femurdefektmodell an der Ratte erfolgen.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine schubweise auftretende Augenentzündung, die 10% der Pferdepopulation betrifft. Die Entzündungsschübe führen im Verlauf der Erkrankung zur Erblindung des Pferdes. Die intraokuläre Entzündung ist durch autoreaktive T-Zellen gekennzeichnet. Trotz zahlreicher Untersuchungen sind weder die Ätiologie noch die Pathogenese dieser häufigen Erkrankung bislang eindeutig geklärt. Das Blut zirkuliert ständig im Körper und spiegelt dessen Zustand sehr genau wider. Deshalb stellt das Serum-/Plasmaproteom eine sehr vielversprechende Probe zur Entdeckung von Biomarkern dar, obwohl die Komplexität und enorme dynamische Bandbreite der Probe hohe Ansprüche an die Aufbereitungsmethode stellt. Die Unterschiede der Proteine im Serum bezüglich ihrer Menge, Struktur und Funktion können Hinweise auf pathologische Prozesse liefern. Ziel dieser Arbeit war es, durch quantitative Serumproteomanalyse mittels 2D-DIGE, Seren von an ERU erkrankten Pferden mit gesunden Kontrollseren zu vergleichen und differenziell exprimierte Proteine massenspektrometrisch zu identifizieren. Die Serumproben wurden vor der zweidimensionalen Gelelektrophorese mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, um einen direkten quantitativen Vergleich der Proteine zu ermöglichen. Es wurde ein Experiment mit Vollserum und ein Experiment mit depletiertem Serum mit jeweils fünf Seren von an ERU erkrankten Pferden und fünf Kontrollseren durchgeführt. Die Serumdepletion der abundanten Serumproteine erfolgte mittels polyklonaler, an Trägerkugeln gekoppelter Hühnerantikörper. Insgesamt wurden 117 differenziell exprimierte Protein-Spots gefunden, von denen 32 Spots eindeutig massenspektrometrisch (MALDI-TOF/TOF) identifiziert wurden. Die 32 identifizierten Spots repräsentieren 17 verschiedene Proteine. Sieben der Proteine, nämlich Immunglobulin G4 und 7 hc, IGLV3-25, Immunglobulin M, Komplementfaktor B, Serotransferrin und Alpha-2HS-Glykoprotein waren in den ERU Seren deutlich höher exprimiert als in den gesunden Kontrollseren. Die anderen zehn Proteine, Pigment epithelium-derived factor (PEDF), Komplementfaktor 1 und C4, Kininogen-1, Apolipoprotein H und A-IV, Immunglobulin G5 hc, Albumin, Vitamin D binding Protein und Antithrombin III waren in den Seren von an ERU erkrankten Pferden niedriger exprimiert. Einige der differenziell exprimierten Proteine stehen funktionell mit dem Immunsystem und Entzündungsprozessen in Verbindung. Alle hier identifizierten differenziell exprimierten Proteine wurden bislang noch nicht im Serum von ERU oder humaner Uveitis beschrieben und sind damit potenzielle Kandidaten, die zur Aufklärung der Pathogenese auf molekularer Ebene beitragen oder als Marker fungieren können. Darüber hinaus stimmt die verringerte Expression von PEDF im Serum mit dem Expressionsmuster des Proteins im Zielorgan der Erkrankung, dem Auge, bei an ERU erkrankten Pferden überein. Da PEDF nun in dieser Studie auch in der Peripherie der erkrankten Tiere signifikant erniedrigt gefunden wurde, ist PEDF ein vielversprechender Marker. Es bedarf weiterer Validierung, um zu prüfen, ob PEDF als diagnostischer Marker genutzt werden kann.