Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/07 Archiv

This work employed a transgenic mouse model to investigate the functions and effects elicited by the peptide growth factor betacellulin (BTC), an EGFR ligand, on the physiology and pathology of the gastrointestinal tract. BTC, a 32-kDa glycosylated protein, was initially purified from a mouse pancreatic β-cell carcinoma cell line. In addition to the EGFR, BTC is also able to directly bind and activate the related ERBB4 receptor. BTC is expressed in a wide variety of tissues, particularly in the pancreatic β-cells, stomach, small intestine, lung, kidney and uterus. Three different transgenic mouse lines (L2, L4, and L5) overexpressing BTC under the control of a ubiquitous promoter were established by pronuclear DNA microinjection. Southern blot analysis revealed different integration sites for each line. RT-PCR, Northern and Western blot analysis revealed strong expression of the transgene in the lung, heart, brain and pancreas, with detectable levels in other tissues like stomach, intestine, muscle, bones, liver, thymus, spleen, kidneys, adrenal glands, ovaries, brain and eyes of transgenic mice. BTC-transgenic mice showed stunted growth and significantly reduced relative pancreas and carcass weights. In contrast, the absolute and relative weights of eyes, lung, stomach, intestine and spleen were significantly increased. BTC-transgenic mice exhibit a remarkable, age-dependent hyperplasia of the gastric epithelium. The lesions were characterized by a tumor-like hyperplasia of foveolar epithelium with large cystic formations and a severe depletion of the preexisting body of the mucosa, thus resembling some aspects of human gastric tumors found in patients with Ménétrier disease where TGFA, another ligand of the EGFR, plays an important role. BTC-transgenic animals showed hypoalbuminemia (due to protein loss across the mucosa) and an increase in the gastric pH (as a consequence of parietal cell depletion), while gastrin levels were not altered. The hyperplastic lesions originated exclusively in the lesser curvature of the stomach and were histologically detectable for the first time at the age of 4 weeks. Another important aspect of the gastric lesions was the pronounced infiltration with mononuclear cells. Gastric inflammation is regularly observed during infection with Helicobacter pylori in humans, which can lead to development of stomach cancer or Ménétrier disease. In conclusion, our study is the first to reveal an association between gastric hyperplastic lesions and overabundance of an EGFR ligand but TGFA. BTC-transgenic mice showed a significant reduction in the length of small and large intestine while the weight of theses tissues was significant increased. The villi were narrower and longer as compared with control littermates. No pathological alterations such as fibrosis, metaplastic or neoplastic lesions could be found in the intestinal mucosa of transgenic animals, but the cell proliferation index was increased. It was further demonstrated that the BTC effects in the intestine are EGFR-dependent and that BTC overproduction increases the multiplicity of intestinal adenomas in Apc+/Min mice. A distinct expression pattern of ERBB1 and ERBB4 could be responsible for the significantly reduced pancreas weight in BTC-transgenic mice: ERBB1 is expressed predominantly in the islets, while ERBB4 expression is nearly absent in the endocrine tissue but is high in the exocrine part. It can be postulated that the reduced exocrine pancreas is mediated by the ERBB4 receptor and not by the EGFR. This concept is supported by the maintenance of the pancreas weight reduction in BTC-transgenic mice in an EGFR-deficient background. To evaluate the functional consequence of BTC excess in the pancreatic tissue, we submitted transgenic mice to caerulein-induced acute pancreatitis. The serum markers indicative of pancreatitis were significant lower in the transgenic mice as compared to their control littermates, an indication for a weaker pancreatitis in this group. Further, BTC-transgenic animals developed less tissue inflammation, pancreatic edema and acinar necrosis. Interestingly, BTC-transgenic mice showed significantly higher levels of apoptosis during pancreatitis as compared to their littermates. Further studies will be necessary to investigate whether a shift in death response from necrosis to apoptosis is the mechanism resulting in a protection against caerulein-induced pancreatitis. If confirmed, this finding may have important therapeutic implications.

Ziel der vorliegenden Untersuchung war es eine potentielle stressreduzierende Wirkung eines synthetischen Equinen Appeasing Pheromons E.A.P. (Pherocalm, Merial) anhand von physiologischen Parametern (Herzfrequenz, Körpertemperatur) und verschiedener messbarer Blutparameter (Cortisol, Glucose, Laktat, Kreatinin, Kreatininkinase, Hämatokrit, Hämoglobin) zu untersuchen. Zudem wurde die Wirkung unter ethologischen Gesichtspunkten (Verladedauer, Videodokumentation ’focal sampling’) beurteilt. Um den größtmöglichen Praxisbezug zu bekommen wurde als Feldversuch der Transport von dreijährigen Jungpferden gewählt. Es wurden 17 Warmblutwallache des Haupt- und Landgestüts Schwaiganger der Bayerischen Landesanstalt für Landwirtschaft aus standardisierten Haltungsbedingungen, die per Los in zwei Gruppen eingeteilt wurden, auf einer standardisierten Strecke transportiert, um im Sinne einer Placebo-kontrollierten-Doppelblindstudie untersucht zu werden. Die Pferde wurden in definierten Abständen viermal transportiert und ihnen jeweils vor und nach dem Transport Blut abgenommen, sowie physiologische Parameter bestimmt und eine kontinuierliche Herzfrequenzmessung mittels POLAR Herzfrequenz-Messgerät mit einem Bauchgurt und der POLAR-Uhr S 810 i durchgeführt. Zusätzlich wurde das gesamte Transportverhalten durch Videoaufnahmen dokumentiert und unter ethologischen Gesichtspunkten analysiert. Die festgestellten Ergebnisse weisen für beide Gruppen auf eine geringe Stressbelastung durch das Verladen und den Transport hin. In der Placebo-Gruppe lag die mittlere Herzfrequenz bei 55,29 + 5,91 bpm während des Verladens und bei 71,28 + 9,31 bpm beim Transport. In der Pheromon-Gruppe lag die mittlere Herzfrequenz beim Verladen bei 50,4 + 4,33 bpm und bei 69,66 + 6,51 bpm beim Transport. Bei der Verladedauer konnte direkt beim ersten Transport eine geringere Verladedauer in der Pheromongruppe festgestellt werden, die aber keine Signifikanz aufwies. Bei Betrachtung des Verhaltens konnten als häufigste Verhaltensmuster das „Scharren“ und das „Umsehen“ festgestellt werden, die auf eine Unruhe des Pferdes deuten. Bei beiden Verhaltensweisen kam es zu einer signifikanten Reduktion der Häufigkeit des Verhaltens vom ersten zum zweiten Transport, bei der aber kein signifikanter Unterschied zwischen pheromon- und placebobehandelten Tieren auffiel. Während der Transporte stieg die Körpertemperatur durchgängig an und es konnte im Vergleich der ersten beiden Transporte ein signifikanter Unterschied zwischen Pheromon- und Placebo-Gruppe festgestellt werden. Es zeigt sich eine signifikante Wechselwirkung zwischen der prozentualen Veränderung zwischen dem ersten und zweiten Transport und dem Wirkstoff (p=0,012), so kam es zu einer signifikanten Verringerung der rektalen Temperatur in der Pheromon-Gruppe in Versuchsdurchgang 2. Die Serum-Cortisolkonzentration lag während den Versuchen zwischen 10,5 und 30,2 nmol/l (Placebo-Gruppe) und 13,8 und 32,9 nmol/l (Pheromon-Gruppe). Alle Transporte verursachten einen deutlichen Anstieg der Cortisolkonzentration um bis zu 179 % vom Ausgangswert, welche aber trotzdem im Vergleich zur Literatur im unteren Belastungsbereich blieb. Die Blutglucosewerte lagen bei allen Transporten im Referenzbereich zwischen 2,8 und 5,0 mmol/l und verringerten sich durch die Transportbelastung. Die Parameter des Muskelstoffwechsels (Laktat, Kreatinin, Kreatininkinase) stiegen durch die Transportbelastung an, verblieben aber im Referenzbereich. Beim Hämatokrit, sowie bei der Hämoglobinkonzentration kam es durch die Transporte zu einem Konzentrationsanstieg, der beim vierten Transport signifikant am geringsten ausfiel und auf eine Gewöhnung an die Transportphase hindeutet (Hämatokrit: p=0,025; Hämoglobin: p=0,016). Ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen war jedoch nicht nachweisbar. Mit Hilfe der untersuchten Parameter ergaben sich ansatzweise Hinweise für eine stressreduzierende und/oder lerneffektunterstützende Wirkung des Equinen Appeasing Pheromons, die aber nur in einzelnen Punkten statistisch signifikant zu beweisen war und vor allem einen Unterschied bei den ersten beiden Transporten ausmachte (Verladedauer, Verhalten, Körpertemperatur). Weder bei der Herzfrequenz, der Glucosekonzentration, dem Hämatokrit und der Hämoglobinkonzentration oder den Parametern des Muskelstoffwechsels, noch beim klassischen Stressparameter Cortisol konnte ein signifikanter Gruppenunterschied und eine Wirkung des Pheromons nachgewiesen werden. Interessant wären weitere Untersuchungen über individuelle Charakterunterschiede und Stressanfälligkeit verschiedener Zuchtlinien, auch im Hinblick auf die Nutzung als Sport- und Leistungspferd. Dies könnte auch ein Ansatz sein im Rahmen weiterer Untersuchungen über Modifikationen hinsichtlich Applikationsdauer und Applikationsart (Verneblersysteme) nachzudenken.

In this study, certain aspects of psittacine beak and feather disease and budgerigar fledgling disease were investigated to gather information about the distribution and the clinical manifestation of the diseases in patients of the “Klinik für Vögel der LMU München”. Furthermore different organ samples were compared for their reliability of routine post mortem PCR-diagnoses of peracute PBFD in young african grey parrots. Regarding intra vitam detection of the aetiological agents of both diseases (BFDV and BFPyV), following observations were made: while in birds with physiological plumage, DNA of neither virus could be detected (BFDV: n = 79; BFPyV: n = 47), birds with feather disorders were regularly BFDV (18.2 %) and BFPyV (10.7 %) positive. In psittacines with feathering disorders an BFPyV-infection was only seen in budgerigars. The six affected budgerigars show acute loss of flight and tail feathers. In two birds a concurrent infection of BFPyV and BFDV could be detected and in one of the two birds a deformation of feathers could be seen. Characteristic feather disorders, as discribed for chronic PBFD, like constriction in feather sheats, remaining feather sleeves, discolouration as well as hemorrhages in the feather shaft, were only present in nine of the 24 BFDV-positive birds. The clinical signs of the remaining 15 BFDV-infected birds were only feather loss and feather picking. In contrast to BFPyV-infection, which could only be detected in budgerigars, the BFDV positive birds belong to different species of the order Psittaciformes. The testing of intra vitam samples showed, that in four of the BFDV-positive birds viral DNA could not be detected in all samples tested (2 x cloacal swab, 1 x blood, 1 x blood and cloacal swab). To increase the reliability of intra vitam diagnosis all three samples should be taken for virus detection. Within the group of birds presented for necropsy, the share of BFDV- and BFPyVpositive birds was even higher (25.5 % and 21.9 %) as in birds with feather disorders. In these birds a BFPyV-infection could be demonstrated in samples of seven birds of different species under the age of one year. Besides one budgerigar, who died of a streptococcus septicemia, all 13 BFDV-positive birds, who died with physiological plumage, were young african grey parrots. By testing DNA dilutions of different organ samples (skin-with-feather, spleen, bursa of Fabricius and liver) of young grey parrots suffering from peracute PBFD, an infection could be proven in 29 of 34 birds. In positive birds viral DNA of BFDV could be detected in all organ samples except for three single samples (2 x bursa of Fabricius and 1 x liver). But using undiluted isolated DNA, a great part of the spleen- (19 of 28) and bursa of Fabricius-samples (13 of 25) and a smaller part of liver- (6 of 28) and skin-with-feather-samples (3 of 29) gave a negative result Because of the high number of false negative PCR-tests the labarotories need to establish reliable internal controls PCR-diagnostic. Both viral infections appear regularly in our patients: in birds with feather disorders, as well as in young birds suffering from a lethal infection.

Das Fibrosarkom ist einer der häufigsten Weichteiltumoren der Katze. Ein besonderes Forschungsinteresse besteht an diesem Tumor, da die Ätiologie mit Vakzinationen und anderen Injektionen in Zusammenhang gebracht wird und die Rezidivrate mit bis zu 70 % weiterhin sehr hoch ist. Mit dieser Studie wurde ein Überblick über Katzen mit injektionsassoziiertem Fibrosarkom in Deutschland geschaffen. Die Daten von 362 Katzen, die seit dem Jahre 1999 an der Medizinischen Kleintierklinik der Ludwig-Maximilians-Universität München im Rahmen einer Therapiestudie behandelt wurden, galten als Grundlage für diese Studie. Es wurde untersucht, ob Katzen mit Fibrosarkom bestimmte labordiagnostische Abweichungen gehäuft zeigen. Dazu wurden die Daten mit einer gesunden Kontrollpopulation verglichen. Obwohl sehr viele signifikante Abweichungen im Vergleich zur Kontrollpopulation auftraten, kann nicht von eindeutigen Veränderungen im Zusammenhang mit einem Fibrosarkom gesprochen werden. So gut wie alle Abweichungen lagen innerhalb des Referenzbereiches. Dadurch können diese Abweichungen nicht alleine im Rahmen einer Routineuntersuchung erkannt werden – es ergibt sich somit keine Relevanz der Laborparameterdifferenzen für die Untersuchung und Behandlung von Katzen mit Fibrosarkom. Somit lassen sich keine charakteristischen Veränderungen des Blutbilds oder der Serumparameter von Katzen mit einem Fibrosarkom nachweisen. Mitarbeiter der Studie kamen zu der subjektiven Einschätzung, dass gehäuft adipöse Tiere vorgestellt wurden. Daher wurde das Körpergewicht der Fibrosarkomkatzen mit dem Körpergewicht gesunder Katzen verglichen. Es wurde ein signifikanter Unterschied errechnet: Das mediane Körpergewicht der Katzen mit Fibrosarkom lag höher als das der Kontrollpopulation. Da für verschiedene Tumoren sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin ein höheres Risiko für Patienten mit Übergewicht besteht, sollte dieser Vermutung weiter nachgegangen werden. Dazu empfiehlt sich die Verwendung des Body-Conditioning-Scores, da dieser ebenfalls im Rahmen einer klinischen Untersuchung bestimmt werden kann und im Gegensatz zum Körpergewicht auch die Statur des Patienten berücksichtigt. So könnte anschließend berechnet werden, ob Katzen mit Übergewicht ein höheres Risiko haben, an einem Fibrosarkom zu erkranken. Die Analyse der Impfungen ergab, dass ein großer Anteil der Katzen mit Fibrosarkom ausschließlich gegen Katzenseuche und Katzenschnupfen geimpft war. Das Risiko dieser Vakzination ist also nicht zu vernachlässigen. Wenn Impfstoffapplikationen an der Entwicklung eines Fibrosarkoms ätiologisch beteiligt sind, dann sind es wahrscheinlich nicht nur Tollwut- und Leukoseimpfungen, sondern auch Katzenschnupfen- und -seucheimpfungen. Die Beachtung und weitere Einschränkung der jährlichen Impfschemata kann ein entscheidender Beitrag zur Fibrosarkom-Prophylaxe sein.

Avian reoviruses (ARV) are supposed to play an important role in development of malabsorption syndrome (MAS) in broiler flocks. By seriously affecting weight gain, considerable economic losses occur. The present study deals with ARV which had been isolated from broilers with MAS despite vaccination of parental flocks. Thus, the question arose if the isolates were antigenic variants which could bypass protection by vertically transmitted maternal antibodies. For examination, cross neutralization tests were chosen. To gain repeatable results for all ARV isolates, a plaque reduction assay including an immunohistochemical staining method was adapted to ARV. Thereby, different ARV strains induced three distinguishable plaque types on CEL and CEF cells. The examinations on CEL cells included hyperimmune sera raised against vaccine strain S1133, against a flock-specific vaccine strain and against four MAS-strains isolated in the "Klinik für Vögel". Additionally, four pooled serum samples from parental flocks were tested. Besides the vaccine strain S1133, eleven ARV strains/ isolates were examined. The neutralization capacity of hyperimmune sera differed considerably. Sera which were raised against the MAS-isolates showed a clearly reduced neutralization capacity compared to serum a-S1133. ARV strains displayed a considerable antigenic heterogeneity with clear differences to the reference strain S1133. Concurrently, an extended cross reactivity occurred. Remarkably, vaccine strain S1133 was neutralized best by every used serum, whereas the MAS-isolates resisted neutralization to a noticeable extent. These results led to the consideration as to whether the used testing system purely reflects antigenic relatedness or if it is fundamentally affected by the host cell used. Therefore, neutralization examinations with three selected strains which were obtained from four different tissues followed: CEL and CEF cells, embryonic liver and embryonic gut. Additionally, resulting virus stocks of one MAS isolate were neutralized comparing the reaction pattern on CEL and CEF cells. Thereby, the reaction pattern of strain S1133 stayed constant, whereas one MAS isolate was neutralized to a greater extent when it was obtained from embryonic instead of cellular origin. Hence, the formerly noted dominance of the S1133 strain was overcome when a CEL cell system was used. On a CEF cell system, these differences did not occur. In order to determine antigenic relatedness of MAS isolates, R-values were calculated and interpreted by a definition given for foot-and-mouth-disease . Thus, MAS isolates were defined as minor and major subtypes of strain S1133 and were all closely related. For strategies of controlling early ARV infections, especially the partial resistance to neutralization and the lesser immunogenicity of the existing MAS isolates are of great importance. It can be assumed that the inclusion of novel ARV isolates in vaccination protocols will not guarantee complete protection since ARV will retain the ability to escape the systemic humoral immune response. Possibly, stimulation of the cytotoxic immune response provides some potential for controlling early ARV infections. Nevertheless, thorough hygiene protocols remain indispensable and should include regular checking of disinfectants, particularly their capacity to degerminate existing ARV variants.

Der akute Myokardinfarkt stellt in den Industrienationen immer noch eine der häufigsten Todesursachen dar. Auch nach Wiedereröffnen des Gefäßes führt eine prolongierte myokardiale Ischämie zur Ausbildung eines Infarktareals. Neben der irreversiblen Schädigung der Myozyten während der Ischämie kommt es auch zu dem so genannten Reperfusionsschaden, dieser kann aber, zumindest tierexperimentell, durch eine entsprechende Therapie verringert werden. Wir konnten bereits zeigen, dass die retrograde Applikation von embryonalen endothelialen Vorläuferzellen, von murinen Embryonen Tag 7,5 (Tie-2+, c-Kit+, Sca-1+, flk-1 low, MHC-1-) eine Kardioprotektion über lösliche Faktoren vermittelt. Diese Reduktion der Infarktgöße war über einen PI3K-AKT Signaltransduktionsweg vermittet. In der hier vorliegenden Studie haben wir uns mit dem Einfluss von Thymosin β4 auf die eEPC vermittelte Kardioprotektion beschäftigt. Methoden: In vitro wurden neonatale ventrikuläre Myozyten der Ratte einer Hypoxie (4 h) und Reoxygenation (1 h) ausgesetzt. Die überlebenden Zellen wurden mittels Trypan-Blau-Exklusion identifiziert. Des Weiteren wurden neonatale ventrikuläre Endothelzellen der Ratte auch einer Hypoxie (18 h) und Reoxygenation (4 h) ausgesetzt und die Apoptoserate mittles TUNEL-Färbung analysiert. Embryonale EPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion wurden während Hypoxie kokultiviert oder Thymosin β4 Protein wurde dem Medium zugesetzt. In Schweinen (n= 9 pro Gruppe) wurde am Tag 1 mittels LAD-Verschluß (1 h) ein Infarkt induziert. 5x106 eEPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion oder Thymosin β4 Protein wurden nach 55 min Ischämie in die anteriore interventrikulare Herzvene retroinfundiert. Nach 24 h Reperfusion wurden die globale und regionale Myokardfunktion (Sonomikrometrie) sowie die Infarktgröße bestimmt. Darüber hinaus wurde die Inflammation mittels Myeloperoxidase Analyse im Gewebe untersucht. Ergebnisse: Die „short hairpin“ Ribonukleinsäure (shRNA) Transfektion führte zu einer verringerten Thymosin „messanger“ RNA Expression in „real time“ Polimerase Kettenreaktions-Untersuchungen (rt-PCR). In Zellkultur war der Anteil überlebender neonataler Kardiomyozyten in Anwesenheit von eEPCs signifikant erhöht, wenn diese Zellen Thymosin β4 exprimierten. Die Analyse der TUNEL-Färbung zeigte eine deutlich geringere Apoptoserate der neonatalen Endothelzellen, die mit eEPCs kokultiviert wurden, es sei denn die Thymosin β4 Expression wurde durch Transfektion der shRNA reduziert. Die Applikation von Thymosin β4 Protein zeigte bei beiden Zellarten ein ähnliches Ergebnis wie die Kokultivierung mit den eEPCs. In vivo waren nach 24 h zahlreiche Zellen im ischämischen Areal nachweisbar. Die Anzahl der Zellen war durch die Reduktion der Thymosin β4 Expression nicht beeinträchtigt. Die regionale Applikation der eEPCs reduzierte die Infarktgröße signifikant gegenüber der Kontrollgruppe, wohingegen die Thymosin β4 shRNA Transfektion der eEPCs diesen Effekt inhibierte. Auch hier zeigte die retrograde Applikation des Thymosin β4 Proteins eine kardioprotektive Wirkung, die ähnlich ausgeprägt war wie die der eEPCs. Die Analyse der TUNEL-positiven Zellen zeigte eine deutliche Reduktion der Apoptoserate nach Retroinfusion der eEPCs oder des Thymosin β4 Protein, auch hier verloren die eEPCs ihre protektiven Eigenschaften nach der Transfektion mit Thymosin β4 shRNA. Die Inflammation im Ischämieareal, ein wichtiges Kennzeichen für die Ausprägung des Ischämie/Reperfusionsschadens, konnte durch die Verabreichung von eEPCs und auch Thymosin β4 Protein signifikant reduziert werden. Die Reduktion der Thymosin β4 Expression verhinderte wiederum diesen kardioprotektiven Effekt. Diese Untersuchungen zeigen, dass embryonale endotheliale Vorläuferzellen den Ischämie/Reperfusionsschaden zu einem frühen postischämischen Zeitpunkt verringern. Der kardioprotektive Effekt dieser Zellen ist zumindest teilweise Thymosin β4 abhängig, da eine analoge Protektion durch die lokale Applikation von Thymosin β4 Protein erreicht werden kann. Generell zeigt diese Arbeit, dass neben dem direkten Einsatz von Vorläuferzellen und Stammzellen zur Behandlung des Reperfusionsschadens diese Zellen auch genutzt werden können, um mögliche Kandidatenproteine zur Kardioprotektion nach akutem Myokardinfarkt zu identifizieren und somit eine effektive Therapie des Reperfusions-schadens beim Menschen zu ermöglichen.