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  3. Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Podcast
  4. Das EBNA1-Protein des Epstein-Barr Virus: Genetische und funktionelle Analyse
Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert primäre humane B-Zellen und
kann deren unbegrenzte Proliferation induzieren. Dieser Prozess der
Wachstumstransformation von B–Zellen ist ein Modellsystem, das die
pathogenen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt. Das
Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 1 (EBNA1) wurde als essentiell
für den Prozess der Wachstumstransformation primärer humaner
B-Lymphozyten beschrieben, weil es an der latenten Replikation über
den viralen Replikations-Ursprung oriP, der extrachromosomalen
Erhaltung des Virus-Episoms und der transkriptionellen
Trans-aktivierung der latenten Gene beteiligt ist (Rickinson und
Kieff, 2001). Dieses Postulat wurde nie experimentell untersucht,
da die genetische Analyse mit den bisherigen Methoden nicht möglich
war. Das Maxi-EBV-System macht das Genom von EBV einer genetischen
Manipulation zugänglich und erlaubt auch die Herstellung von Viren,
denen essentielle Gene fehlen (Delecluse et al., 1998). Ein Ziel
meiner Doktorarbeit war die Herstellung und Analyse eines
EBNA1-negativen Virus. Entgegen der Lehrmeinung war es mit
EBNA1-negativem Maxi-EBV möglich, wachstums-transformierte
Zellklone nach Infektion von primären humanen B-Lymphozyten zu
etablieren. Das virale Genom war in sämtlichen erhaltenen
lymphoblastoiden Zelllinien so integriert, dass alle untersuchten
latenten EBV-Proteine exprimiert wurden. Meine Ergebnisse zeigen
eindeutig, dass EBNA1 prinzipiell für die Wachstumstransformation
entbehrlich ist. Mit EBNA1-positiven Viren werden die primären
B-Zellen jedoch mindestens um den Faktor 10.000 besser
wachstumstransformiert. Da EBNA1 den episomalen Status des
Virusgenoms vermittelt, scheint die Etablierung des EBV-Genoms in
infizierten Zellen der limitierende Schritt zu sein. Auch in vivo
im SCID-Maus-Modell erwies sich EBNA1 als entbehrlich für die
Tumorbildung, womit es nicht als essentielles Onkogen von EBV
betrachtet werden kann. Ein weiterer im Rahmen dieser Doktorarbeit
untersuchter Aspekt war die Frage, ob EBNA1 für die
extrachromosomale Erhaltung und Replikation des EBV-Episoms durch
heterologe Genprodukte ersetzt werden kann. Zu diesem Zweck wurden
Fusionsproteine aus der DNA-Bindedomäne von EBNA1 mit den
zellulären Proteinen Histon H1 bzw. HMG-I (Mitglied der hoch
mobilen Protein-Gruppe) hergestellt. Ich konnte zeigen, dass
HMG-I:EBNA1- und H1:EBNA1-Fusionsproteine in der Lage sind, kleine
oriP-enthaltende Plasmide und Maxi-EBVs episomal zu erhalten und
die zelluläre Replikations-Maschinerie zu rekrutieren. Zusätzlich
dazu unterstützen die Fusionsproteine im EBNA1-negativen Maxi-EBV
die Produktion infektiöser Viren. Für ein konditional regulierbares
Vektorsystem wurden Fusionsproteine aus der
EBNA1-Transaktivierungsdomäne und der DNA-Bindedomäne des
Tet-Repressors (TetR) hergestellt. Diese Proteine sollten mit
Tet-Operator-Sequenzen (TetO, TetR-Bindemotiv) interagieren, die
multimerisiert auf oriP-basierte Vektoren kloniert wurden. Dadurch
sollte die Erhaltung der oriP-basierten Vektoren in der Zelle
konditional regulierbar gestaltet werden. Es gelang in dieser
Doktorarbeit zum ersten Mal ein System zu etablieren, mit dem
Plasmide episomal erhalten werden und bei Zugabe von Doxyzyklin
konditional regulierbar verloren gehen. Dieses erstmals realisierte
konditional regulierbare Vektorsystem schafft neue Wege, die virale
und zelluläre Replikation genauer zu untersuchen. Außerdem öffnen
sich Möglichkeiten für eine sicherere Gentherapie, da die viralen
Anteile auf ein Minimum reduziert werden können. Mit einem solchen
System könnten EBV-Genvektoren in B-Zellen eingeführt werden und
nach Expression des auf dem Vektor kodierten, therapeutischen Gens
könnte die Genfähre durch Tetrazyklin-Applikation wieder aus dem
Patienten entfernt werden.

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