Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19 Archiv

Neuregulin-1 (NRG1) type III is a growth factor on the surface of neurons in the peripheral nervous system (PNS). It is required for initial myelination of nerves by Schwann cells after birth and for remyelination after injury. Neuregulin-1 type III is activated by cleavage (shedding) in its extracellular juxtamembrane region generating a membrane-bound N-terminal fragment (NTF) that contains a bioactive epidermal growth factor (EGF)-like domain. This domain signals to neighboring Schwann cells in a contact-dependent manner prompting the cells to initiate myelination. The β-site APP cleaving enzyme 1 (BACE1) was identified as the enzyme that cleaves NRG1 type III and promotes myelination. Consequently, loss of BACE1 cleavage results in dramatically reduced myelin sheaths around nerves in the PNS of BACE1 knockout mice. Besides its role in myelination, BACE1, better known as β-secretase, is also involved in the generation of the neurotoxic amyloid β-peptide (Aβ) which is the main component of amyloid plaques in the brain of patients suffering from Alzheimer’s disease (AD). The Aβ peptide is derived through sequential cleavage of the amyloid precursor protein APP, first by BACE1 in the extracellular domain and subsequently by the γ-secretase in the transmembrane domain (TMD). Inhibition of BACE1 and γ-secretase is therefore considered a promising therapeutic strategy for AD. However, this approach harbors the risk of mechanism-based side effects due to impaired processing of substrates beside APP such as NRG1 type III which is not only a substrate for BACE1 but like APP is also cleaved in its TMD by the γ-secretase. Adding another layer of complexity, ADAM10 and ADAM17, the so-called α-secretases of AD, also cleave NRG1 type III. In the first part of this study, the proteolytic processing of NRG1 type III in its ectodomain was investigated in detail. The precise juxtamembrane shedding sites of BACE1, ADAM10 and ADAM17 were determined by mass spectrometry and two novel cleavage sites of BACE1 and ADAM17 N-terminal of the EGF-like domain were discovered. Cleavage at these novel sites by ADAM17 and BACE1 results in the secretion of the EGF-like domain from NRG1 type III as α-sEGF and β-sEGF, respectively. Using novel monoclonal antibodies generated against the identified cleavage sites the processing of NRG1 type III could also be confirmed in primary neurons. The soluble EGF-like domains were found to be functionally active and induced signaling pathways required for myelination in cultured Schwann cells. Furthermore, β-sEGF rescued the myelination deficit in the PNS of a zebrafish model lacking BACE1, thereby demonstrating its activity in vivo. Using cell culture and the zebrafish model the effects of BACE1- and ADAM17-mediated shedding on the activity of the soluble EGF-like domains were carefully dissected. In contrast to published evidence, however, both the BACE1- as well as the ADAM17-shed sEGF were found to be equally active and to promote myelination in vivo. Together this suggests that NRG1 type III dependent myelination is not only controlled by membrane-retained NRG1 type III but also in a contact-independent manner via proteolytic liberation of the EGF-like domain. The second part of this study investigates the processing of the C-terminal fragment (CTF) which remains after shedding of NRG1 type III. Intramembranous cleavage of the CTF by the γ-secretase was previously shown to release the NRG1 intracellular domain, which acts as transcriptional regulator of proteins involved in neuronal maturation and brain plasticity. Interestingly, a mutation within the TMD of NRG1 type III is associated with an increased risk of schizophrenia linking γ-secretase processing of NRG1 type III to this neurological disorder. Using a novel antibody against the N-terminus of the NRG1 CTF it was possible to detect a NRG1 β-peptide that is secreted during γ-secretase cleavage and could potentially serve as marker for this processing. Moreover, by means of mass spectrometry, the precise cleavage sites within the TMD of NRG1 could be identified. Strikingly, the ɛ-like cleavage site was found to be located exactly at the position of the schizophrenia-associated mutation providing a possible mechanism for the reported interference of this mutation with γ-secretase cleavage. The evidence presented unambiguously establishes NRG1 type III as a γ-secretase substrate and provides a basis for further investigation of the mechanisms which link its processing to the development of schizophrenia. In summary and with regard to BACE1 and γ-secretase being prime targets for a potential AD therapy, the results of this work call for further careful investigation of the consequences of altered NRG1 type III signaling due to chronic treatment with inhibitors.

As life expectancy has risen steadily over the last years and diseasefree aging is more and more challenging, understanding the complexity of age and aging is of great importance. Metabolomics is one of the novel approaches in systems biology with high potential to deliver answers to these questions. However, only a few metabolic studies based on large samples are available so far. In this thesis, I present results from two population-based studies, the German KORA Follow-Up 4 (KORA F4) study as a discovery cohort with a sample of 1,038 female and 1,124 male healthy participants (32–81 years) and 724 healthy females from UK Adult Twin Registry (TwinsUK) as replication. Targeted metabolomics of fasting serum samples with flow injection analysis coupled with tandem mass spectrometry (FIA-MS/MS) positively quantified 131 metabolites after stringent quality control. Among these, 71 and 34 metabolites were significantly associated with age in females and males, respectively, after adjustment for body mass index (BMI), which is highly correlated (r=0.9) with age. These results indicate that metabolic profiles are age dependent and sex specific. Then, a set of the 12 most age-discriminative, independent metabolites was identified in women with an approach based on random forest and stepwise variable selection. This set showed highly significant differences between subjects aged 32–51 years and 52–77 (p-values range 1.3E-09 – 1.9E-46, significance threshold p=0.004). Ten out of these 12 metabolites replicated in unrelated females from the TwinsUK study, including five metabolites the concentrations of which increased with age (C12:1, C18:1, sphingomyelin (SM) C16:1, SM C18:1 and phosphatidylcholine (PC) aa C28:1), while histidine decreased gradually. Three glycerophospholipids (PC ae C42:4, PC ae C42:5, PC ae C44:4) showed declines around the age of 51 years. Meta-analysis of both studies gave virtually the same results as KORA alone. These observations might reflect many different processes of aging such as incomplete mitochondrial fatty acid oxidation, counteracting oxidative stress, and changes in vascular functions. The identification of these ten age-related metabolites should help better understand aging pathways and networks and with —more discoveries in the future— eventually help enhance healthy aging and longevity.

Es ist bekannt, dass sich Entscheidungsprozesse bei vielen psychiatrischen Erkrankungen als verändert darstellen. Es nahmen siebenundzwanzig (n=27) gesunde, männliche Probanden zwischen zwanzig und fünfunddreißig Jahren an zwei Varianten eines adaptierten (zusätzlich Entscheidungsbedingungen) auditorischen Go-/NoGo-Paradigmas teil. Die Retestreliabilität (Messung der Probanden jeweils vormittags und nachmittags) der ereigniskorrelierten Potentiale (EKP: N200 und P300) im Elektroencephalogramm (EEG) bei intentionalem Verhalten Gesunder war hoch. Entscheidungsart (rechts/links zu drücken oder Volition mit/ ohne Reaktion) sowie Entscheidungsausrichtungen (Volition mit Tastendruck links oder rechts beziehungsweise Volition mit oder ohne Reaktion) unterschieden sich nicht signifikant in ihren EKP. Dies eröffnet die Perspektive diese Paradigmen in Zukunft zur Messung elektophysiologischer Reaktionen bei psychiatrischen Patienten sowie zur Verlaufsbeurteilung einsetzen zu können.

Im klinischen Alltag stellt das hämodynamische Monitoring ein absolut zentrales Element der Patientenüberwachung dar, wobei vor allem bei der Betreuung von kritisch kranken Patienten Parameter des erweiterten hämodynamischen Monitorings als fachlicher Standard gelten. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Durchführung und Auswertung entscheidender Arbeitsschritte bei der Neuentwicklung eines nicht-invasiv arbeitenden Medizinprodukts zur Erfassung von hämodynamischen Parametern. Dieses seit 2009 von der UP-MED GmbH entwickelte Flexicuff-System basiert auf einer pulssynchronen Erfassung des Oberarmgewebedrucks. Mittels spezieller mathematischer Algorithmen wird es ermöglicht, auf die Pulsdruckkurve der Arteria brachialis zu schließen und letztlich durch Analyse der so generierten Pulswelle hämodynamische Parameter zu ermitteln. Im Speziellen erfolgt die Ableitung der Gewebedruckkurve über ein mit Flüssigkeit befülltes Sensorelement, das im Gegensatz zu einer herkömmlichen pneumatischen Blutdruckmanschette auf die Verwendung des komprimierbaren Mediums Luft zur Signalerfassung verzichtet, woraus ein zehn- bis fünfzehnfach höheres Pulssignal resultiert, das einer Pulsdruckkurve entspricht. Dieses Prinzip der hydraulischen Kopplung erfordert jedoch eine möglichst perfekte Anpassung an die individuelle Oberarmbeschaffenheit, sodass im Rahmen dieser Arbeit ein Schwerpunkt auf der Analyse der Oberarmgeometrie lag und als Ergebnis daraus eine konisch geformte Manschette konstruiert werden konnte. Zwar ist dieser Sachverhalt bereits in der Fachliteratur beschrieben, jedoch bis dato völlig unzureichend in der klinischen Alltagspraxis berücksichtigt. Der zweite Schwerpunkt liegt auf der Fragestellung mit welchen zielführenden und gleichzeitig ökonomisch sinnvollen, konstruktiven Maßnahmen ein adäquater Anpressdruck der Flexicuff-Manschette an den Oberarm erzeugt werden kann um möglichst exakte Messergebnisse zu erzielen. Die daraus resultierenden Prototypentestreihen ergaben ein durch drei separate Kunststoffschalen verstärktes Flexicuff-System, das in weiterführenden klinischen Vergleichsstudien eingesetzt werden wird.

Eine intraartikuläre Steroidbehandlung eines einzelnen entzündeten Gelenkes bei sonst gut kontrollierter KA ist eine wichtigeTherapieoption für Patienten mit chronisch-entzündlichen Gelenkerkrankungen. Ein geeignetes Instrument zur Beurteilung des Therapieansprechens in einem Einzelgelenk existiert bislang nicht. Ziel der vorliegenden Studie war die Validierung von POF (POF 1-3) (76) als klinisches Instrument zur Beurteilung der therapeutischen Intervention eines Gelenkes, im Vergleich zu Sonographie, validierten kombinierten Scores für KA (DAS28), Funktionseinschränkung (HAQ) und Abfrage des Schmerzes auf einer 5-Punkte Likert Skala (POF 6). Hierfür erhielten 50 Patienten mit rheumatoider Arthritis mit Beschwerden in einem einzelnen Gelenk bei sonst kontrollierter KA eine IS. Am Tag der IS (BL), nach Woche eins (FU1) und vier (FU2) wurden DAS 28, HAQ, Sonographie (Synovitisgrad 0-3 im B-Bild, PD-Aktivität Grad 0-3 (43)), und der POF 1-3 und POF 6 erhoben. Im POF 1-3 wurden auf einer VAS die Beeinträchtigung durch das entzündete Gelenk im Allgemeinbefinden, in der täglichen Aktivität und der Schmerz abgefragt. Zusätzlich wurde der Schmerz auf einer numerischen Ratingskala (NRS, POF 6) ermittelt. Mit unseren Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass die anfangs niedrige KA niedrig blieb (Median DAS 28 BL 3.1, FU2 2.8, p-Wert 0.23). Der bei BL moderat erhöhte HAQ ging bei FU1 signifikant zurück (HAQ BL 0.9, Rückgang zu FU1 um -0.26, p-Wert

Ziel: In der vorliegenden Arbeit sollte in einem ersten Schritt überprüft werden, wie sich bei Kindern, die aufgrund einer nicht behebbaren, einseitigen Beindeformität distal des Kniegelenkes dauerhaft orthetisch oder prothetisch versorgt werden müssen, die primär gesunde Hüfte des betroffenen Beines sekundär verformt. In einem zweiten Schritt sollte mittels Ganganalyse evaluiert werden, welcher Pathomechanismus der diagnostizierten Formstörung zu Grunde liegt. Methodik: Das Patientengut bestand aus zwölf primär hüftgesunden, jedoch einseitig distal des Knies erkrankten, orthesenpflichtigen Kindern und Jugendlichen, deren klinische und radiologische Krankheitsverläufe retrospektiv ausgewertet wurden. Bei zehn der betroffenen Kinder konnte eine verwertbare instrumentelle kinetische und kinematische Ganganalyse mittels des Zebris-Systems durchgeführt werden. Ergebnisse: 1. Grunderkrankungen: Crus varum congenitum oder Tibiapseudarthrosen 5, Fehlbildungsklumpfuß 1, kongenitaler tibialer Längsdefekt 2, kongenitaler fibulärer Längsdefekt 3, Unterschenkeldeformität nach Ewingsarkom 1. 2. Klinische Ergebnisse: Im intraindividuellen Seitvergleich ist die Seite des von der Deformität betroffenen Beines wie folgt verändert: Die Hüftinnenrotation ist durchschnittlich 12,5º signifikant vermehrt (p

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein wichtiger Bestandteil von vielen Geweben und Flüssigkeiten des Körpers. HA beeinflusst die Makro- und Mikroumgebung und kann direkt über Rezeptoren wie CD44 (cluster of differentiation 44) und RHAMM (receptor for HA mediated motility) mit den Zellen wechselwirken. Dadurch hat HA Einfluss auf die Aktivierung, Migration und Proliferation von Zellen sowie auf den Umbau der extrazellulären Matrix. HA kann das Verhalten der Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beeinflussen und ist somit ein wichtiger Faktor sowohl für die gesunde Knochenhomöostase als auch für die Frakturheilung. Hyaluronansynthasen (HAS) sind komplexe Membranproteine, die für die Synthese von HA verantwortlich sind. Bei Säugetieren sind drei Isoformen bekannt: HAS1, HAS2 und HAS3. Sie zeigen eine hohe Homologie in ihrer Sequenz und Struktur, unterscheiden sich aber in Stabilität, Syntheserate und Länge des HA. Der genaue Regulierungsmechanismus der HAS ist noch nicht bekannt. Bisher wurde über eine Regulation durch externe Signalmoleküle, Ubiquitinierung oder Phosphorylierung berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur Untersuchung der Regulation der Aktivität der HAS aufgebaut. Mit diesem sollte die Interaktion der HAS mit dem Aktinzytoskelett als möglicher Regulationsmechanismus untersucht werden. Methoden: Zu diesem Zweck wurden drei Zelllinien hergestellt. Zum einen hTERT immortalisierte hMSCs (human mesenchymal stem cells), die sogenannten SCP1, welche jeweils eine der HAS-Isoformen, fusioniert mit einem eGFP-Tag, stabil exprimieren. Des Weiteren SCP1, die Lifeact-mRFPruby exprimieren, welches F-Aktin fluoreszenzmarkiert. Schließlich doppeltransduzierte hMSCs, welche sowohl HAS-eGFP als auch Lifeact-mRFPruby exprimieren. Als Gentransfersystem wurden Lentiviren eingesetzt. Zuerst wurden die Zellen hinsichtlich der stabilen und funktionellen Expression ihres Transgens anhand verschiedener Methoden untersucht. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde eine Kolokalisation von Aktin und HAS dargestellt. In fluoreszenzmikroskopischen Timelapse-Aufnahmen wurden die Bewegungsmuster der HAS beobachtet. Ergebnisse: Mittels RT-PCR, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie wurde nachgewiesen, dass die Zelllinien SCP1-HAS1-eGFP D6, SCP1-HAS2-eGFP und SCP1-HAS3-eGFP E6 alle ihr jeweiliges HAS-eGFP-Gen stabil exprimieren. Die Funktionalität der HAS-eGFP wurde mit einem HA-spezifischen ELISA und mit einem selbst etablierten Aktivitätsassay untersucht, welcher das HA durch den biotinylierten HA-Bindekomplex (bHABC) färbt. Im ELISA zeigten alle Zelllinien eine statistisch signifikant höhere Hyaluronanproduktion als die Negativkontrolle. Die HAS3-überexprimierende Zelllinie erzielte von allen die höchste HA-Konzentration. In der Färbung mit bHABC war deutlich zu erkennen, dass diejenigen Zelllinien, in denen eine der HAS-eGFP-Isoformen überexprimiert wurde, eine stärkere Braunfärbung zeigten als Zellen der Negativkontrolle. Für den Nachweis, dass die HAS-eGFP in der Membran lokalisiert sind, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen den Oberflächenmarker CD44 durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigten an Stellen, die durch die CD44-Färbung eindeutig als Membran zu erkennen sind, ebenfalls ein Signal für die HAS-eGFP. Dies bedeutet, dass die drei Isoformen der HAS-eGFP dort in der Zellmembran integriert vorlagen. Um eine Kolokalisation der HAS-eGFP mit dem Aktinzytoskelett darstellen zu können, erfolgte außerdem eine Färbung des Aktins mit Phalloidin. Bei allen Zelllinien konnte an ausgewählten Stellen eine solche Kolokalisation gesehen werden. Die hMSC-Lifeact-mRFPruby-Zellen wurden lebendig und fixiert im Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Sie lieferten eine gute Darstellung des Zytoskeletts mit Stressfasern im Zellkörper und Aktinfilamenten im Zellcortex. Auffallend war, dass in den lebenden Zellen kurze Aktinfilamente zu sehen waren, die sich bei den fixierten Zellen nicht beobachten ließen. Um eine Interaktion zwischen den HAS-eGFP und dem Aktinzytoskelett in lebenden Zellen untersuchen zu können, wurden von den doppeltransduzierten hMSCs Timelapse-Aufnahmen angefertigt. Darin stellten sich die grün fluoreszierenden HAS-eGFP als globuläre Strukturen dar, die entlang der Aktinfilamente angeordnet waren und sich auch entlang dieser bewegten. Schlussfolgerung: Mit diesen Zellen wurde ein Modellsystem geschaffen, mit welchem eine Regulation der HAS über die Interaktion mit dem Zytoskelett untersucht werden kann. Genaueres Wissen über diesen Mechanismus kann für zukünftige Therapieansätze bei Frakturen und bei Knochenerkrankungen, wie z.B. der Osteoporose, richtungsweisend werden.