Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 10/19 Archiv
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Pemphigoid gestationis ist eine seltene blasenbildende Autoimmundermatose unklarer Ätiologie, die ausschließlich im Zusammenhang mit Schwangerschaften oder schwangerschaftsassoziierten Tumoren beobachtet wird. Als Autoantigen konnte das Transmembranprotein Kollagen-Typ-XVII, ein Strukturelement der Hemidesmosomen der dermoepidermalen Junktionszone, identifiziert werden. Der selbstlimitierende Krankheitsverlauf und die hohe Rezidivneigung bei Folgeschwangerschaften deuten auf eine pathogenetische Rolle schwangerschaftsspezifischer Veränderungen endokriner sowie immunologischer Faktoren hin. Es besteht darüber hinaus eine Assoziation mit den MHC-Klasse-II-Antigenen HLA-DR3 und -DR4 bei den Patientinnen sowie mit dem väterlichen Haplotypen HLA-DR2. HLA-G ist ein nicht-klassisches MHC-Klasse-Ib-Molekül, das hauptsächlich von den extravillösen Trophoblasten der Plazenta exprimiert wird. Es gibt zahlreiche Hinweise darauf, dass HLA-G an der fetomaternalen Grenzzone durch Interaktion mit Rezeptoren auf natürlichen Killerzellen, B- und T-Lymphozyten und antigenpräsentierenden Zellen maßgeblich an der Tolerierung des semiallogenen Feten durch die mütterliche Immunabwehr beteiligt ist. Es wird postuliert, dass HLA-G auch an pathologischen Prozessen ausserhalb der Schwangerschaft, wie etwa Autoimmun- und Tumorerkrankungen, beteiligt sein könnte. HLA-G weist im Gegensatz zu den klassischen HLA-Klasse-I-Genen einen stark beschränkten Polymorphismus auf. In dieser Arbeit wurde erstmals eine mögliche Assoziation zwischen Polymorphismen im HLA-G-Gen und in der HLA-G-Promotorregion mit dem Pemphigoid gestationis untersucht. Ein potentiell funktioneller 14-bp-Insertions-Deletions-Polymorphismus in Exon 8 von HLA-G (rs1704) sowie vier Einzelnukleotidpolymorphismen der Promotorregion (rs1736936, rs1632947, rs1632946, rs1233334) wurden in einem Kollektiv, welches 18 Pemphigoid-gestationis-Patientinnen umfasst, genotypisiert und mit einem Kontrollkollektiv bestehend aus 52 gesunden Blutspenderinnen verglichen. Aufgrund der bekannten Assoziation von Pemphigoid gestationis mit dem Haplotyp HLA-DR2 wurden auch Kinder und Partner der Pemphigoid-gestationis- Patientinnen hinsichtlich dieser Polymorphismen typisiert und mit dem Kontrollkollektiv verglichen. Sofern DNA-Proben von kompletten Familien gewonnen werden konnten, wurden die Ergebnisse der Typisierung in Stammbaumdiagrammen dargestellt. Der 14-bp-Insertions-Deletions-Polymorphismus war in früheren Studien bereits mit anderen schwangerschaftsassoziierten Krankheitsbildern sowie mit der blasenbildenden Autoimmundermatose Pemphigus vulgaris in Zusammenhang gebracht worden. In den hier untersuchten Kollektiven der Pemphigoid-gestationis-Patientinnen und ihrer Angehörigen konnte keine statistisch signifikante Assoziation zum Pemphigoid gestationis nachgewiesen werden. Auffällig war jedoch eine sehr deutliche relative Häufung des in der Allgemeinbevölkerung seltener vorkommenden Insertionsallels in der Patientinnengruppe. Zu Grunde liegend könnte ein bekanntes starkes Kopplungsungleichgewicht zwischen dem mütterlichen Risikoallel für Pemphigoid gestationis, HLA-DR3, und einem für die 14-bp-Insertionsvariante kodierenden HLA-G-Allel sein. Die vier untersuchten Einzelnukleotidpolymorphismen der Promotorregion von HLA-G zeichnen sich durch ihre Lage innerhalb oder in der Nähe funktioneller Elemente und/oder eine bereits bekannte klinische Assoziation aus. Drei der untersuchten Polymorphismen (rs1736936, rs1632947, rs1632946) befanden sich in einem nahezu vollständigen Kopplungsungleichgewicht. Beim statistischen Vergleich der untersuchten Kollektive zeigte sich für die drei gekoppelten Einzelnukleotidpolymorphismen eine grenzwertig signifikante Assoziation bzw. eine Tendenz in Richtung einer Assoziation bestimmter väterlicher Allele und Genotypen mit dem Pemphigoiod gestationis (die p-Werte lagen zwischen 0,05 und 0,07). Für den Einzelnukleotidpolymorphismus rs1233334 konnte ebenfalls ein deutlicher Trend hin zu bestimmten väterlichen und kindlichen Genotypenkonstellationen im Vergleich zum Kontrollkollektiv ausgemacht werden (p-Werte zwischen 0,07 und 0,09). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine mögliche Assoziation der untersuchten Polymorphismen im HLA-G-Gen bei Vätern und Kindern von Pemphigoid-gestationis-Patientinnen mit dem Erkrankungsrisiko der Frauen im untersuchten Kollektiv hin. Es bleibt weiterführenden Studien überlassen, diese Ergebnisse an einem größeren Patientinnen- und Angehörigenkollektiv zu vergleichen und so möglicherweise zur Klärung der Ätiopathogenese dieser seltenen Autoimmunerkrankung beizutragen.
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Fragestellungen: Die vorliegende retrospektive Studie erfasste den jeweils ersten Zyklus der 119 Patientinnen, die eine low dose FSH-Stimulation erhielten. Bei 17 Paaren mit rezidivierenden Spontanaborten deren medizinische Ursache nicht nachgewiesen werden konnte, war eine Pilotstudie unter der Nutzung dieser low dose FSH-Stimulation durchgeführt worden. Laut WHO definieren sich rezidivierende Spontanaborte als das Auftreten von drei oder mehr aufeinander folgenden spontanen Aborten vor der 20. Schwangerschaftswoche. Das Ziel dieser Studie war eine optimierte Follikulogenese mit nachfolgend höherer Geburtenrate zu erreichen. Zusätzlich wurden die Schwangerschaftsraten nach intrauteriner Insemination im Vergleich zu Spontanverkehr in den low dose FSH-stimulierten Zyklen untersucht. Außerdem interessierte der Effekt der mittlutealen Progesteron-Konzentration auf das Eintreten und den Verlauf einer nachfolgenden Schwangerschaft. Patientinnen und Methodik: Für die low dose FSH-Stimulation wurden ab dem 3. Zyklustag 50 IU rekombinantes FSH (Puregon, Organon, Deutschland) subkutan injiziert. Unter vaginalsonographischem und laborchemischem (LH, Estradiol, Progesteron) Monitoring erfolgte bei einem oder maximal zwei reifen Follikeln die Ovulationsauslösung mit einer Ampulle rekombinantem HCG (Ovitrelle, Serono, Deutschland). Periovulatorisch wurden die Paare zum Spontanverkehr angehalten oder es erfolgte eine intrauterine Insemination. Am 7. postovulatorischen Tag erfolgte eine Bestimmung der Serum-Progesteron-Konzentration. Ergebnisse: Bei den 17 Patientinnen mit idiopathischen RSA fand sich eine Schwangerschaftsrate von 47%. Von diesen Schwangerschaften endeten 63% erneut in frühen Spontanaborten. Im Rahmen aller analysierten Zyklen war die Schwangerschaftsrate nach intrauteriner Insemination mit 19,6% deutlich höher als nach Spontanverkehr (11,4%). In der Untergruppe der Paare mit normalen Spermiogrammen (Definition laut WHO) war die Schwangerschaftsrate bei den Paaren mit IUI (8%) sogar diskret niedriger als bei den Paaren mit SV (11%). Bei Vorliegen eines eingeschränkten Spermiogrammes betrug die Schwangerschaftsrate nach IUI 33% und lag somit wesentlich höher als nach IUI bei Vorliegen eines normalen Spermiogrammes (8%). Die Untersuchung des Effektes der mittlutealen Progesteronkonzentration ergab keinen Unterschied der durchschnittlichen Progesteron-Konzentration für die Zyklen mit (19,5 ng/ml) oder ohne (20,9 ng/ml) nachfolgende Schwangerschaft (p= 0,676). Allerdings lag die Abortrate für Schwangerschaften mit Progesteronwerten ≤ 20 ng/ml bei über 50% - gegenüber 17% bei Progesteronwerten > 20 ng/ml (p= 0,146). Schlussfolgerung: Bei idiopathischen RSA fanden sich nach low dose FSH-Stimulation auffallend hohe Schwangerschafts- (47%) und Abortraten (63%). Es stellte sich die Frage, ob eine unphysiologisch hohe Implantationsrate entwicklungsgestörter Embryonen ursächlich an der erhöhten Abortrate beteiligt ist. Bei Vorliegen eines eingeschränkten Spermiogrammes zeigten unsere Daten einen deutlichen Vorteil der IUI in Kombination mit der low dose FSH-Stimulation. Bei normalen Spermiogrammen findet sich kein Vorteil der IUI. Darüber hinaus fand sich kein signifikanter Einfluss der mittlutealen Progesteron-Konzentration auf das Eintreten einer Schwangerschaft. Jedoch sind Progesteron-Konzentrationen ≤ 20 ng/ml mit deutlich erhöhten Raten früher Spontanaborte assoziiert.
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Veränderungen des intrazellulären Metabolismus der Surfactantproteine SP-C und SP-B sowie ihrer Vorstufen, sind in manchen Fällen verantwortlich für chronische interstitielle Lungenerkrankungen sowie unklare respiratorische Insuffizienz im Kindesalter. Um Häufigkeit und mögliche diagnostische Bedeutung dieser Veränderung zu untersuchen, analysierten wir die bronchoalveolären Lavagen von Kindern mit unklaren ILE (ILD n=49), unklarer respiratorischer Insuffizienz bei Neugeborenen (NG n=36) und unklarer respiratorischer Insuffizienz bei nicht Neugeborenen (n=7), im Vergleich zu Kindern ohne Lungenerkrankungen (n=12). Matures SP-B fand sich in allen untersuchten Fällen und schloss so eine SP- Defizienz biochemisch bei diesen Kindern aus. Die Vorformen von SP-B, pro-SP-B fanden sich bei der überwiegenden Mehrzahl der Kinder, neue oder unerwartete Banden ließen sich nicht nachweisen. Eine biochemisches Fehlen von SP-C fanden wir bei elf Proben; von diesen wurde eine genetisch auf Mutationen im SP-C Gen untersucht, eine genetische SP-C-Defizienz ließ sich nicht nachweisen. Zwei der elf Proben wurden für Mutationen im ABCA-3-Transporter untersucht, diese ließen sich bei beiden nachweisen. Des Weiteren zeigten sich bei vier Kindern Mutationen im ABCA-3-Transporter ohne das SP-C biochemisch untersucht worden war, sodass wir insgesamt bei sechs Kindern Mutationen im codierenden Bereich für den ABCA-3-Transporter nachweisen konnten. Fehlendes oder erniedrigtes SP-C in der Lavage weißt bei entsprechender Klinik auf Defekte im SP-C oder ABCA-3-Gen hin. Normalerweise findet sich kein pro-SP-C in der Lavage; wir konnten allerdings Signale nachweisen. Bei einem der drei Patienten mit genetisch determinierter SP-C-Defizienz zeigte die Probe Signale. Die quantitative Auswertung der Surfactantproteinmengen ergab keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Leider wurde (und konnte aufgrund fehlender DNA oder Einverständniserklärungen) nur bei einem kleinen Teil der Kinder eine genetische Untersuchung durchgeführt. Ebenso zeigte unsere Auswertung der durchgeführten Diagnostik, dass viel zu selten weiterführende diagnostische Maßnahmen wie HR-CT oder Biopsien vorgenommen wurden. Bei persistierender Symptomatik sollte auch in dieser Altersgruppe entgegen der aktuellen klinischen Alltagsvorgehensweise, nach Ausschluss exogener Ursachen sowie von Systemerkrankungen, eine definitive Diagnosestellung vorangetrieben werden. Nur so kann eine ätiologische Einordnung erfolgen und es können rationale Therapieeinsätze geplant werden.
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Gallensäuren stellen potente Signalmoleküle dar, die schon in geringen mikromolaren Konzentrationen, wie sie beim Menschen im Serum beobachtet werden, zentrale Leberzellfunktionen auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene beeinflussen. Die hydrophoben und potentiell toxischen Gallensäuren Lithocholsäure (LCA) und Chenodeoxycholsäure (CDCA) induzieren Apoptose und Cholestase, während hydrophile Gallensäuren hepatoprotektiv wirken können. Unter ihnen ist die antiapoptotisch und anticholestatisch wirksame Ursodeoxycholsäure (UDCA) von besonderer Bedeutung. UDCA stellt derzeit das einzige wirksame Therapeutikum bei chronischen cholestatischen Leberkrankheiten dar. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Bedeutung intrazellulärer Signaltransduktionswege für die choleretischen, (anti-)cholestatischen und (anti-)apoptotischen Wirkungen physiologischer Gallensäuren in verschiedenen experimentellen Modellen. Hauptziel der Arbeit war die genauere Charakterisierung (i) der für den klinisch bedeutenden anticholestatischen Effekt des Taurinkonjugats der Ursodeoxycholsäure (TUDCA) verantwortlichen Signaltransduktionswege, und (ii) der zentralen Stellung von PI3-Kinasen in der intrazellulären Signalvermittlung der biologischen Effekte hydrophiler und hydrophober Gallensäuren. Im Modell der isoliert perfundierten Rattenleber untersuchten wir die anticholestatische und hepatoprotektive Wirkung der TUDCA in der intakten Leber unter Einsatz pharmakologischer Enzyminhibitoren. Als Leberfunktionsparameter dienten quantitativer Gallenfluß, Sekretion des Modellsubstrats der Konjugatexportpumpe Mrp2, GS-DNP, in die Galle und als Marker der Leberzellschädigung die hepatovenöse LDH-Freisetzung. Simultane Hemmung der cPKCa und der PKA, nicht aber Hemmung von cPKCa oder PKA allein antagonisierte bei Taurolithocholsäure (TLCA)-induzierter Cholestase die protektive Wirkung der TUDCA. Gallenfluß und GS-DNP-Sekretion waren unter gleichzeitiger Hemmung beider Signalwege signifikant reduziert, wohingegen die LDH-Freisetzung deutlich erhöht war. Die Ergebnisse zeigen, dass der posttranskriptionell vermittelte anticholestatische Effekt der TUDCA im etablierten Modell TLCA-induzierter Cholestase durch einen kooperativen cPKC- und PKA-abhängigen Signalweg vermittelt wird. Mitogenaktivierte Proteinkinasen Erk1/2- und p38-abhängige Signalwege hingegen, die als Vermittler von TUDCA-induzierter Cholerese unter nicht-cholestatischen Bedingungen beschrieben wurden, waren im untersuchten Modell ohne Bedeutung für die anticholestatische Wirkung der TUDCA. Mit Hilfe der neu etablierten Biotinylierung von Membranproteinen konnten wir in Ntcp-transfizierten humanen Hepatomzellen (HepG2-Ntcp) zeigen, dass TUDCA unter Cholestase die Insertion von MRP2 in die Hepatozytenmembran anregt. Dieser für die klinische Wirksamkeit der (T)UDCA potentiell bedeutende und im Tiermodell von uns vorbeschriebene Wirkmechanismus konnte damit erstmals in einem humanen Modell nachvollzogen werden. Ein weiterer in vitro Ansatz untersuchte die Phosphorylierung von aus HepG2-Ntcp immunopräzipitiertem MRP2 durch die als Gallensäureneffektoren diskutierten Proteinkinasen cPKCa, nPKCe und PKA. Alle drei Proteinkinasen phosphorylierten, durch den PKC/PKA-Inhibitor Staurosporin hemmbar, MRP2. Diese Phosphorylierung könnte, wie für die Gallensäurentransporter BSEP und NTCP bereits gezeigt, Einfluss auf Aktivität und Membraninsertion von MRP2 haben. Der funktionellen Bedeutung der PI3-Kinasen, welchen in den bisher entschlüsselten Signalwegen sowohl hydrophober/toxischer wie auch hydrophiler/protektiver Gallensäuren eine zentrale Rolle zugesprochen worden war („PI3-Kinasen-Paradoxon“), galten unsere in vitro Untersuchungen zur Aktivität der Isoformen der Klasse I PI3-Kinasen p110a, p110b und p110g nach Stimulation von primären Rattenhepatozyten mit TLCA, GCDCA, TCA und TUDCA in einem neu etablierten isoformspezifischen Kinaseassay. Dabei zeigte sich für jede Gallensäure ein für sie spezifisches Aktivierungsmuster unterschiedlicher PI3-Kinase-Isoformen. PI3-Kinase p110g wurde dabei spezifisch durch die cholestatisch und apoptotisch wirkenden Gallensäuren TLCA und GCDCA aktiviert. In HepG2-Ntcp-Zellen untersuchten wir daher die Bedeutung von p110g für Gallensäuren-induzierte Apoptose nach deren pharmakologischer Hemmung bzw. nach Transfektion mit siRNA gegen p110g. Die apoptotische Wirkung u.a. der Gallensäuren TLCA und GCDCA war unter beiden Methoden der p110g-Antagonisierung deutlich reduziert, wie sowohl in einem Caspase3/7-Assay als auch morphologisch evaluiert. Gallensäuren-unabhängige Apoptose, durch Etoposid bzw. TNFa ausgelöst, war p110g-unabhänig. Die Bedeutung der Aktivierung der PI3-Kinase-Isoform p110a durch TUDCA ist durch weitere experimentelle Untersuchungen zu klären. Die Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit tragen zum Verständnis der komplexen Signalgebung im Rahmen cholestatischer Leberschädigung und der therapeutischen Wirkung der (T)UDCA bei und sind damit für die Entwicklung neuer Therapiestrategien bei cholestatischen Leberkrankheiten potentiell von Bedeutung.
