Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 10/19 Archiv

In der vorliegenden Arbeit wurden A549 Zellen, als Modell für Epithelzellen der Lunge, mittels nicht-viralen Gentransfers mit pDNA bzw. mRNA kodierend für das sekretorische Protein mSEAP transfiziert. Die höchste Transgen-Expression konnte durch den mRNA-vermittelten Gentransfer erreicht werden, unabhängig von dem verwendeten Genvektor. Die Messung der Aktivität von mSEAP im Medium nach mRNA Transfektion mit Liposomen ergab eine Konzentration von maximal 1 ng/50 µl nach 24h, 5 ng/50 µl nach 48h und 7,5 ng/50 µl nach 72h. Für die pDNA Transfektion ergaben sich Konzentrationen für mSEAP von 400 pg/50µl nach 24 h, 700 pg/50 µl nach 48 h und 800pg/50 µl nach 72 h. Es konnte gezeigt werden, dass es bei der Verwendung von mRNA - vor allem nach Transfektion mit dem kationischen Lipid DMRIE-C - zu einer 9-fachen Steigerung der Proteinsekretion in das Medium der kultivierten Zellen kommt. Weiterhin waren ca. 45% der Zellen bei Verwendung von Lipoplexen mit DMRIE-C/mRNA im Gegensatz zu 15% nach Transfektion von pDNA positiv für mSEAP. Nach Transfektion der mRNA mit dem kationische Polymer b-PEI konnten Konzentrationen von mSEAP im Medium von 10pg, 15pg und 50pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h gemessen werden. Für die Magnetofektion von mRNA ergeben sich Mengen von ca. 150pg, 250pg und 400pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h. Dies entspricht im Vergleich zur Verwendung von pDNA einer 3,3-fachen Steigerung nach Transfektion von mRNA/b-PEI Komplexen, mit der Methode der Magnetofektion einer 4-fachen Steigerung der Proteinexpression. Die erhöhte Proteinexpression kann auf die intrazelluläre Barriere des nukleären Imports von pDNA, welche bei der Verwendung von mRNA nicht notwendig ist, zurückgeführt werden. Die Unterschiede des endosomalen „Escape“ - und dem daraus resultierenden Verhältnis freier mRNA zu komplexierter mRNA im Zytoplasma - könnte eine Erklärung für die geringere Effizienz von Polyethyleniminen im Vergleich zu kationischen Lipiden bei dem Transfer von mRNA sein. Weiterhin konnte mit diesem Modell gezeigt werden, dass humane alveolare Epithelzellen des Adenokarzinoms (A549) - als Modell für humane Lungenepithelzellen - imstande sind, zellfremde Proteine nach Transfer genetischen Materials zu translatieren und zu sezernieren. Eine pulmonale Applikation von therapeutischen Genen kodierend für sekretorische Proteine mittels Vernebelung könnte als nicht-invasive Methode z.B. für die Therapie von Hämophilie A oder B eine Rolle spielen. Weiterführende in vivo Versuche könnten Aufschluss über Serumkonzentrationen des sekretorischen Proteins nach pulmonaler Applikation bringen. Die Verwendung von mRNA als therapeutischem genetischem Material zeigt hierbei Vorteile gegenüber von pDNA, aufgrund der gesteigerten Transgen -Expression, der verminderten Dosis an Transferreagenz, sowie dem fast gänzlich ausgeschlossenen Risiko der insertionellen Mutagenese.

Der vesikoureterale Reflux (VUR) kann als eine der häufigsten urologischen Anomalien durch rezidivierende Pyelonephritiden zu Nierenparenchymschäden, Hypertension und terminaler Niereninsuffizienz führen. Zwischen Januar 1990 und Dezember 2000 wurden an der Kinderchirurgischen Klinik im Dr. von Hauner`schen Kinderspital 156 Kinder alter Altersgruppen bzw. 191 ureterorenale Einheiten mit mittel- bis hochgradigem Reflux operativ nach der modifizierten Methode von Politano-Leadbetter operiert. Bei 86 Patienten (114 Niereneinheiten) handelte es sich um einen primären Reflux, bei 70 Patienten (77 Niereneinheiten) lag ein sekundärer Reflux vor. Im Nachsorgeprogramm wurden neben der körperlichen Untersuchung und Urinproben eine Ultraschalluntersuchung der Nieren und ableitenden Harnwege sowie 1 Jahr nach dem Eingriff eine nuklearmedizinische Diagnostik durchgeführt. Die Patienten waren von mindestens 3 Monaten bis längstens 14 Jahre nach dem Eingriff noch in unserer Betreuung. Die Erfolgsrate nach operativer Therapie lag beim primären Reflux nach einmaliger Reimplantation bei 94,4%, beim sekundären Reflux bei 92,5%. Spätkomplikationen wurden in 20 Fällen beobachtet, wobei in 9 Fällen Reoperationen wegen Obstruktion, in 8 Fällen wegen Refluxrezidiv und in 3 Fällen wegen schlechter Nierenfunktion erforderlich wurden. Die Ergebnisse dieser retrospektiven Studie belegen, dass sich als operatives Verfahren die modifizierte Technik der Ureter-Reimplantation nach Politano und Leadbetter aufgrund der hohen Effizienz bei niedriger Komplikationsrate in der Behandlung des primären und sekundären VUR bewährt hat.