Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/07 Archiv

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, molekulare Vorgänge während der B-Zellentwicklung in der Bursa Fabricii des Haushuhns mittels proteomischer Analysen zu charakterisieren. Hierfür wurden zunächst repräsentative Zeitpunkte der bursalen B-Zellentwicklung für die Probengewinnung definiert. Daran schlossen sich qualitative Proteomanalysen der Bursa Fabricii zu den gewählten Entwicklungszeitpunkten Embryonaltag 10 (ET10), Embryonaltag 18 (ET18), Tag 2 und Tag 28 nach dem Schlupf an. Diese erfolgten durch Vorfraktionierung der Proben mittels 1D-SDS-PAGE und nano-HPLC gefolgt von Tandem-MS-Analysen. Hierbei konnten für die bursalen Proteome zu jedem Zeitpunkt zwischen 1152 und 1392 Proteine identifiziert werden (FDR < 1 %). Überschneidungen der einzelnen Zeitpunkte in 537 allgemeinen Struktur- und Stoffwechsel-Proteinen berücksichtigt, wurden insgesamt 2214 verschiedene Proteine identifiziert. Eine zusätzliche qualitative Analyse aufgereinigter bursaler B-Zellen führte zur Identifizierung von 758 Proteinen. Durch genontologische Analysen konnte festgestellt werden, dass für das Zellwachstum verantwortliche Proteine va. zu den frühen Zeitpunkten zu finden waren, während Proteine, welche eine Rolle für das Immunsystem spielen, eher zu späteren Entwicklungszeitpunkten in Erscheinung traten. Dies spiegelt die Entwicklung der Bursa von der unreifen, embryonalen Wachstums- und Differenzierungsprozessen unterliegenden Bursaanlage, zum fertig ausdifferenzierten, primär-lymphatischen Organ auf molekularer Ebene wider. Konform zu den hohen Proliferationsraten der B-Zellen während der Bursaentwicklung fanden sich in den genontologischen Analysen der B-Zellen besonders hohe Anteile an Proteinen, welche für Zellteilung verantwortlich sind. Proteine, welche in Zusammenhang mit Zellmigration stehen, wurden vor allem in der B-Zell-Probe sowie an ET10 gefunden, was als Hinweis auf eine Beteiligung dieser Proteine an der Einwanderung der B-Zellen in die Bursaanlage betrachtet werden kann. Die anschließende quantitative Proteomanalyse wurde zu denselben Entwicklungszeitpunkten an je sechs biologischen Replikaten mittels 2D-DIGE durchgeführt. In der statistischen Auswertung der quantitativen Veränderungen zeigten sich 402 hochsignifikante Unterschiede zwischen den bursalen Proteomen der verschiedenen Entwicklungszeitpunkte, wobei die sehr große Übereinstimmung der Analyseergebnisse innerhalb der biologischen Replikate die gute Reproduzierbarkeit der Experimente belegte. Die deutlichsten Veränderungen zeigten sich zwischen ET10 und allen weiteren Zeitpunkten, wohingegen innerhalb der übrigen Stadien eine geringere Anzahl signifikanter Unterschiede nachgewiesen wurde. Für die 402 differentiell exprimierten Proteine konnten verschiedene charakteristische Protein-expressionsverläufe nachgewiesen werden, welche Rückschlüsse auf die biologischen Hintergründe ermöglichten. Durch massenspektrometrische Analysen der Proteine mittels MALDI-TOF/TOF und LC-MS/MS gelang es, 203 der 242 zur Identifikation vorgesehenen Spots zu identifizieren. Im Rahmen einer bioinformatischen Auswertung des erhaltenen Datensatzes erbrachten sowohl die genontologische Analysen als auch Pathway-Analysen wesentliche Anhaltspunkte für die Auswahl besonders interessanter und vielversprechender Proteine für weiterführende funktionelle Analysen. Unter den identifizierten, differentiell exprimierten Proteinen fanden sich auffällig viele Vertreter des Aktin-Zytoskelett-Pathways, welcher für die mechanische Stabilisierung von Zellen und deren aktive Bewegungen verantwortlich ist. Dabei fielen in dieser Arbeit sowohl Vinculin als auch Gelsolin durch ihre charakteristischen Expressionsmuster auf. Vinculin zeigte zu Beginn der embryonalen Entwicklung erhöhte Abundanzwerte, welche nach ET18 steil abfielen. Als fokales Adhäsionsprotein stellt es ein Schlüsselprotein in der Regulation der Übertragung von kontraktilen Kräften dar, welche die Voraussetzung für die Migration von Zellen sind. Gelsolin, ein wichtiges Apoptose-Effektorprotein, welches auch in Verbindung mit Zellmotilität gebracht wird, zeigte erhöhte Expressionslevel an ET18, welche über die nachfolgenden Entwicklungszeitpunkte abfielen. Gelsolin konnte in drei verschiedenen Ladungs-Isoformen detektiert werden. Für die Fragestellung dieser Arbeit interessant erschien weiterhin eine Gruppe differentiell exprimierter Proteine des Retinolsäure-Metabolismus. Im Einzelnen wurden die Retinaldehydrogenase 2 (ALDH1A2), das „retinol-binding protein 5“ (RBP5), das „fatty acid-binding protein 7“ (FABP7), und Transthyretin (TTR) mit ähnlichen Proteinexpressions-profilen detektiert, welche ihr Expressionsmaximum jeweils an ET10 aufwiesen. Das könnte ein Hinweis sein, dass die embryonale Entwicklung der Bursa Fabricii von ähnlichen Faktoren gesteuert ist wie die embryonale Ausbildung der sekundär-lymphatischen Organe beim Säuger, bei der Retinolsäure-abhängige Proteine eine entscheidende Rolle spielen. Über die Thematik dieser Arbeit hinausgehend, stellt der umfangreiche proteomische Datensatz dieser Arbeit eine wertvolle Ressource dar, die sowohl für weitere Fragestellungen bezüglich der Bursa Fabricii des Huhns, als auch für die Vervollständigung der Annotation des Hühnergenoms genutzt werden können.

Female japanese quails (Coturnix coturnix japonica) were dosed for a period of six weeks with an equal amount of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluorooctanoate (PFOA) through feed (190, 330, 580 or 1000 µg PFT/kg bw/d) or for a period of five weeks through drinking water (330 or 580 µg PFT/kg bw/d). Concentrations of PFOS and PFOA in eggs have been determined on day 0, 14 and 35 and those in liver and muscle tissue subsequently to the experimental period. Both compounds were accumulating in eggs and tissue probes in a dose related manner. In comparison to PFOA, PFOS was more effectively eliminated through the egg. Concentrations of PFOA measured on day 35 in eggs from the feed trial were 1597 ± 213, 3438 ± 234, 4880 ± 1210 and 11963 ± 3119 µg/kg dw respectively for dose groups 190 to 1000 and concentrations of PFOS were 3315 ± 54, 6591 ± 1016, 8983 ± 2133 and 29762 ± 5988 µg/kg dw respectively. Concentrations of PFOA measured in eggs of dose group 330 and 580 from the water trial were 6428 ± 452 and 11469 ± 595 µg/kg dw respectively and concentrations of PFOS were 11050 ± 3620 and 23643 ± 3071 µg/kg dw respectively. The PFOS:PFOA ratio has been nearly constant at a value of 2:1 through all dosing groups on day 14 and 35. In contrast, PFOA was more effectively accumulating in liver and muscle tissue than PFOS. The PFOA:PFOS ratio in muscle and liver tissue ranged from 1.5:1 to 2.3:1 and 0.9:1 to 1.8:1 respectively. The proportion of the total cumulative dose ranged from 1.7 to 5% for the concentration of PFOA in eggs on day 14 and from 0.8 to 3% on day 35. For PFOS the proportion of the total cumulative dose ranged from 3.5 to 14% on day 14 and from 1.5 to 4% on day 35 respectively. In the liver 0.4 to 0.8% of the total dose were found for PFOA and 0.2 to 0.8 for PFOS. The muscle tissue contained 0.4 to 1.6% of the total cumulative dose of PFOS. In contrast to eggs and liver tissue there has been a remarkable difference in accumulation of PFOA in muscle tissue concerning the uptake route. It ranged from 0.6 to 1.6% for admission through feed and from 3.2 to 3.6% for admission through drinking water. Toxic effects were remarkable in dose group 1000 only and were displayed as weight loss, reduced feed consumption and reduced egg production. All toxic effects were completely reversible after cessation of dosing.

T-Zellen können tumorassoziierte HLA-präsentierte Peptide auf Tumorzellen des Nierenzellkarzinoms erkennen, und diese dann eliminieren. Gelingt es, diese Fähigkeit des Immunsystems mit einer Impfung geziehlt anzuregen kann eine Peptid-basierte Immuntherapie ein Verfahren zur Behandlung des Nierenkrebeses darstellen. Aus diesem Grund wurden durch massenspektrometrische Untersuchungen HLA-Klasse-I Ligandome maligner transformierter Zellen des soliden Nierenzellkarzinoms isoliert. Mit Hilfe von vergleichenden Genexpressionsanalysen wurden diejenigen Gene identifiziert, die aufgrund ihres Expressionsmusters als tumorassoziiert angesehen werden können. Diese aus HLA-Liganden abgeleiteten Tumorantigene stellen potentielle T-Zellepitope für eine Peptid-basierte Immuntherapie dar.

“Investigation of the effects of milking on the teat tissue and the teat blood flow using ultrasonographic scanning and color angiography” The aim of this study was to investigate the effects of milking on the teat blood flow and the teat tissue of dairy cows using color angiography and ultrasonographic scanning. 10 udder healthy lactating Holstein-Friesian cows from the second lactation were selected for the study. The selected cows had a milk cell concentration below 100 000 cells/ml in the course of every probation milking during the cow milk recording enquiry of the current lactation. In addition California-Mastitis-Test and microbiological analysis had been negative at the day of measurement. The measurements were carried out using a MyLab30Vet XVISION ultrasound scanner with a linear array probe. The analysis was supported by MyLabDesk as well as PixelFlux software. During ultrasound scanning the right front teat was immersed in warmed contact jelly in an angled bowl. Measurements in cross section at the changeover of udder quarter and the teat as well as in longitudinal cut were made. Circumference and area of the teat and of the teat-cistern at the cross section and teat-canal length, teat-wall thickness, teat-end width and teat cistern width at the longitudinal cut were evaluated. The teat-tissue area at the cross section was calculated. Measurements were started three hours before afternoon milking and were repeated every 15 minutes until milking. Directly after the removal of the milking cluster an additional measurement was performed. Subsequently, measurements took place every 10 minutes for the next 40 minutes. Thereafter, measurements were done every 15 minutes until 175 minutes after milking. Results: • Color Angiography is suited for measuring the blood flow of the teats of dairy cows. • Directly after the removal of the milking cluster, the blood flow density of seven (MP 1) respectively eight (MP 4) out of the ten selected cows was reduced. • All cows showed a high significant increase of blood flow density after the first measurement following milking. • Teat channel length upon milking is significantly longer than immediately before milking and is reduced again afterwards. It does not reach its original length during the measuring period. • The teat end width does not change significantly during the whole measurement period. • Up to milking the cistern width increases, and after milking it is significantly reduced. From the first measurement after milking it starts increasing again. • The teat wall is significantly thicker after milking than before. • Teat area and teat width are significantly smaller directly after milking than before. Following the first measurement after milking, they are reduced. • Cistern area and cistern width are significantly smaller after milking than immediately before. During a measuring interval they decrease so that there is a significant difference between the first measurement after milking and the two following measurements. Subsequently, they increase again. • The size of the teat tissue area changes only slightly during the period of measurements.

Similarities between the bovine female and women in terms of reproduction and fertility, such as oogenesis, folliculogenesis and reduced fertility with advanced age make the bovine a valuable model for the study of ovarian function and dysfunction as well as reproductive aging in women. The aim of the present work was to investigate the influence of donor age on follicle numbers, yield and quality of COCs obtained by repeated OPU and on the developmental competence in vitro after oocyte maturation in vitro versus in vivo. Further, the ability of oocytes from different age classes to reprogram nuclei of bovine fetal fibroblasts was studied. Since the individual is a major factor influencing parameters of fertility and results of ART in both humans and cattle, the present study used in parts the same animals to rule out inter-individual effects on the response to one or the other approach. Experiment 1 investigated the effect of donor age in non-superstimulated German Simmental heifers (n = 12, 14 months at the beginning of the experiments), young cows in their first lactation (n = 8, 2-4 years) and old cows (n = 8, 10-15 years). A total of 38 OPU sessions were performed in two experimental periods on independent sets of animals from all age classes: 5/5/5 (32 sessions) and 7/3/3 (6 sessions). In spite of a marked influence of the experimental period, a number of parameters were also significantly affected by donor age. The total number of follicles increased with age (P

Latest studies show, that not only worldwide, but also in Germany the prevalence of A. vasorum has increased in the dog population over the last years (Barutzki und Schaper, 2009; Hermosilla et al., 2009; Taubert et al., 2009). Therefore, the aim of this study was to investigate the relevance of this lungworm in dogs in the state of Bavaria, Germany. Faecal samples of three consecutive days were examined for presence of A. vasorum larvae in a total of 276 dogs from Bavaria between April 2008 and April 2010 by the Baermann funnel technique. Of these 276 dogs, 160 showed clinical signs suspicious for canine angiostrongylosis. Of those 160 dogs, 90 showed respiratory disease, 47 had neurological signs, and 23 dogs had bleeding disorders. In addition, a control group of 116 clinically healthy dogs from Bavaria were coprologically examined for lungworm infections. A second aim of the study was to investigate clinical, laboratory, and radiological findings of A.-vasorum-positive dogs. Only one of the 276 examined dogs was tested positive for A. vasorum. This dog belonged to the group with respiratory signs. Thus, the prevalence for all 276 dogs was 0.36 %. The prevalence for the 160 dogs with suspicious clinical signs was 0.63 %, while 1.11 % of dogs in the respiratory group were A.-vasorum-positive. The A.-vasorum-infected dog was an eleven year old, female Labrador-Mix from the city of Munich. The dog was presented because of acute cough, retching, and anorexia. Laboratory findings were eosinophilia, thrombocytopenia, and hyperglobulinemia. Thoracic radiographs showed a mixed alveolar-interstitial lung pattern with diffuse micronodular opacities. The prevalences established in this study show that the risk of an infection with A. vasorum in dogs with suspicious clinical signs as well as in clinically healthy dogs in Bavaria can be considered low at the moment. However, recent studies have shown that the prevalence of A. vasorum has increased over the last years in Germany (Barutzki und Schaper, 2009; Hermosilla et al., 2009; Taubert et al., 2009), and high prevalences have been detected in the German states of Baden-Wurttemberg and Saarland (Barutzki und Schaper, 2009). Therefore, it cannot be excluded that the prevalence of A. vasorum in Bavaria and other German states might increase in the future. As a consequence, practicing veterinarians in Germany should be familiar with the various clinical signs associated with canine angiostrongylosis and should always consider an infection as a possible differential diagnosis in dogs with suspicious clinical signs.

Die Frakturheilung im diaphysären Knochen wird maßgeblich von ihrer biomechanischen Umgebung beeinflusst. Ein Großteil der klinisch auftretenden Frakturen befindet sich jedoch im spongiösen Knochen der Metaphyse. Trotz ihrer vor allem bei Osteoporosepatienten herausragenden Relevanz wurde der metaphysären Frakturheilung bisher nur wenig Interesse geschenkt und ihr Verlauf kaum erforscht. Zudem fehlen Studien, die die biomechanischen Effekte auf die Knochenheilung in diesem Gebiet berücksichtigen. Aus diesem Grund war es das Ziel dieser Arbeit, erstmals ein definiertes und mechanisch charakterisiertes Modell im Großtier zu entwickeln, an welchem der Einfluss von interfragmentärer Bewegung und Dehnung auf die metaphysäre Knochenheilung untersucht werden konnte. Dies wurde unter reproduzierbaren Bedingungen mittels einer gut standardisierten im Verlauf der Studie neuentwickelten Methodik durchgeführt. Dazu wurde eine partielle 3 mm breite Osteotomie in der rechten distalen Femurkondyle von zwölf adulten, weiblichen Schwarzkopfschafen erstellt. Dort übt die Patella bei physiologischer Gliedmaßenbelastung eine Kraft auf die Trochlea aus, die zu einer Durchbiegung des Osteotomiespalts führt. Die daraus resultierende interfragmentäre Dehnung im Spalt beträgt abhängig von Lokalisation und Fixationsmethode bis zu 40 %. Sie wurde durch ein Stahlimplantat mit 3 mm (stabile Fixation) bzw. 2 mm Dicke (flexible Fixation) eingegrenzt. Acht Wochen nach der Operation fand am explantierten Knochen die computertomographische, histomorphologische und biomechanische Auswertung statt. In metaphysären Osteotomieregionen mit sehr kleinen interfragmentären Dehnungen < 6 % bildet sich signifikant weniger geheilter Knochen als bei höheren Gewebedehnungen. Die Knochenheilung läuft verzögert und überwiegend über desmale Ossifikation ab. Für Frakturzonen mit höheren Dehnungen im Bereich zwischen 6 und 20 % stellt sich hingegen eine verbesserte Knochenheilung mit mehr neugebildetem Knochen und sowohl desmaler als auch enchondraler Ossifikation dar. Interfragmentäre Dehnungen über 20 % führen zu keiner weiteren Verbesserung der metaphysären Heilung. In dieser Höhe verursacht IFD stattdessen in einigen Fällen die Entwicklung von fibrösem Gewebe und Faserknorpel im Osteotomiespalt, was zu einer Heilungs-verzögerung des Knochens führen kann. Kein Tier beider Fixationsgruppen zeigt metaphysär eine für diaphysäre Knochenbereiche unter interfragmentärer Bewegung typische externe periostale Kallusbildung. Die Dehnungsbereiche aus welchen eine desmale bzw. enchondrale Ossifikation resultiert, sind in ihrer Größenordnung mit denen der diaphysären Heilung vergleichbar. In der Diaphyse führen interfragmentäre Dehnungen unterhalb von 5 % zu desmaler Ossifikation und Werte zwischen 5 und 15 % zu enchondraler Ossifikation. Interfragmentäre Dehnungen von mehr als 15 % verzögern die Heilung des Knochens oder verhindern diese vollständig. Die Frakturheilung im spongiösen Knochen folgt somit ähnlichen biomechanischen Gesetzmäßigkeiten, wie sie für den kortikalen Knochen beschrieben sind. Damit kann belegt werden, dass auch im metaphysären Knochen Dehnungen unterschiedlicher Größe unterschiedliche Heilungsmuster induzieren. Anhand des entwickelten Großtiermodells besteht nun in Zukunft die Möglichkeit, die Heilung des metaphysären Knochens eingehender zu erforschen. Hierdurch können grundlegende Erkenntnisse und klinisch wichtige Fragestellungen sowie die Frakturheilung im osteoporotischen metaphysären Knochen besser verstanden werden. Dieses Großtiermodell bietet zudem zum ersten Mal die Möglichkeit, den Erfolg verschiedener Therapiemaßnahmen sowie pharmazeutischer Wirkstoffe am metaphysären Knochen unter definierten biomechanischen Bedingungen zu untersuchen und auf die Gegebenheiten im Menschen zu übertragen.