Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/07 Archiv

Salmonella infections in humans arise through chicken-based food such as eggs, egg-products, or chicken meat. The most common cause for these infections is Salmonella enteritidis, and the aim of this study has been to analyze the early innate immune response of chickens induced via this pathogen. Note that S. enteritidis is a host-adapted serovar, which only causes clinical findings in young chickens during their first week of life; adult chickens do not get sick, but may nevertheless act as inapparent infected carriers. We studied the reaction from the chicken immune system on S. enteritidis, using macrophage cultures as well as tissue samples of infected adult chickens. The gene expression studies were carried out by an “Agilent 4x44K chicken microarray” method. In our in vitro studies, we infected primary macrophages with S. enteritidis for 4 hours, using a MOI of 10. The gene expression studies resulted in the inductions of interleukins (IL1β, IL6, IL12p40, IL18), of chemokines (CCL1, CCL4 (K203), CCL20, CXCL8 (IL8), CXCL13), of some members of the tumor-nekrose-factor-superfamily (TNFSF), and of some toll-like receptors (TLR). Hence the cells have an inflammatory reaction. Particularly prominent were the expression changes of K60 (IL8 homolog), K203 (chCCLi2, MIP-1β), CCL20, and TL1a (TNFSF15). Finally, infected macrophages expressed a group of typical Th1-cytokines, including IL12p40, IL18, and IFN-γ. In further analysis of our data, we focused on cytokines, chemokines, and members of the TNF-superfamily. In the ceca we found similar expression patterns within these three groups as was previously found for them in the macrophages study. In our in vivo studies, we infected chickens that were 8 weeks old and already had a well developed immune system. They were infected in the crop using a dose of 107 salmonella. At 5, 12, 24, and 48 hours of infection, we sampled the ceca and cecal tonsils for the bacterial, histological, and gene expression analyses. Already at 5 hours p.i., we were (for all but one animal) able to isolate bacteria from the ceca-tissue. The bacterial load reached its maximum at 12 hours p.i.. The infection of the cecal-tissues was confirmed in the histology, both by the detection of bacteria and by the occurrence of inflammatory cells. However, using histology, we could not detect any bacteria in cecal tonsils, which suggests that no infection was present in these organs. This suggestion was confirmed in gene expression analyses. When comparing the gene expression studies of cecal tonsils and ceca, the former showed lower counts of differential regulated genes (Tab. 11). Both their count maxima occurred at 12 hour p.i though. Moreover, at this time 41 significant regulated pathways had been identified.. In summary, the in vitro and the in vivo experiment both resulted in an initial inflammatory reaction, as well as in a typical Th1-cytokines reaction. To investigate functional characterisation of named candidate genes, in the first instance CCL20, CXCL8, K60, K203, and TL1a, future analyses of the innate immune response should involve them. This may contribute to a better understanding of the successful defense mechanisms against S. enteritidis in chicken, which may help to contain the amount of salmonellosis in humans.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine Bestandserhebung zur Hygiene im Verpflegungsbereich von Kindertageseinrichtungen vorzunehmen. Zu diesem Zweck erfolgten mikrobiologische Untersuchungen der angebotenen Lebensmittel sowie Abklatschuntersuchungen beim Personal (Hände) und im Umfeld der Küche. Insgesamt wurden zwölf Kindertageseinrichtungen einbezogen, die vier verschiedene Verpflegungssysteme repräsentierten: (1) Zubereitung der Mahlzeiten in einer einrichtungseigenen Küche durch Fachkräfte – Selbstkochküchen, (2) Verpflegung durch ein Catering-Unternehmen (Warm-, Kaltanlieferung, Tiefkühl-kost), eventuell mit Zubereitung von Beilagen durch die einrichtungseigene Küche, (3) Anschluß an eine andere Einrichtung zur Gemeinschaftsverpflegung (Altenheim) und (4) Zubereitung der Mahlzeiten durch Eltern in der Küche der Einrichtung oder Mitbringen von in der Haushaltsküche der Eltern zubereiteten Speisen – Elterninitiativen. Das Alter der ver-pflegten Kinder lag zwischen einem halben Jahr und sechs Jahren, mit dem Altersschwerpunkt bei unter drei Jahren. Nach einer Erhebung der aktuellen Hygienepraktiken in den einzelnen Einrichtungen wurden im Zeitraum Juli 2008 bis Dezember 2009 regelmäßig insgesamt 371 Lebensmittelproben entnommen und auf Hygiene-Indikatorkeime (aerobe mesophile Keime, Enterobacteriaceae, Escherichia coli) sowie auf die Anwesenheit relevanter pathogener Keime (Staphylococcus aureus, Salmonellen, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Verotoxinogene Escherichia coli, in Sonderfällen auch Cronobacter spp.) untersucht. Außerdem wurden unter Verwendung von RODAC-Platten insgesamt etwa 1300 Abklatschuntersuchungen des Umfelds (Küchen- und Personalhygiene) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden den Einrichtungen laufend schriftlich mitgeteilt, besprochen und ggf. Korrekturmaßnahmen vorgeschlagen. Dieses Vorgehen wurde zwar von den Kindertageseinrichtungen positiv bewertet, jedoch nicht immer in dem beabsichtigten Ausmaß umgesetzt. Die Resultate der Lebensmitteluntersuchungen auf Hygiene-Indikatorkeime waren bis auf einzelne Ausnahmen (eine Elterninitiative und zwei durch Caterer verpflegten Einrichtungen) gut; Krankheitserreger (Salmonellen, L. monocytogenes, Verotoxinogene E. coli, Cronobac-ter spp.) wurden nicht, bzw. nur in Zahlen, die im allgemeinen keine Gesundheitsgefährdung darstellen (S. aureus, B. cereus), nachgewiesen. Es fiel allerdings auf, daß B. cereus sowohl aus Lebensmitteln, als auch im Zusammenhang mit den weiter unten erwähnten Abklatschuntersuchungen häufig isoliert werden konnte. Die Ergebnisse der Abklatschuntersuchungen wiesen auf Mängel hinsichtlich der Händehygiene und des hygienischen Zustands von Oberflächen, wie Arbeitsflächen, Servierwagen, Eßtische etc., hin, die zum Teil durch die vorgeschlagenen Korrekturmaßnahmen eliminiert werden konnten.

In the present study, the equine histamine 4 receptor (eH4R) was cloned, sequenced and pharmacologically characterized. The findings were compared to those, obtained with the human H4R (hH4R). Due to its expression in cells of the immune system, the eH4R provides a promising target for the development of novel therapeutic strategies in allergic diseases, such as Recurrent Airway Obstruction (RAO) and allergic dermatitis in the horse. To clone the eH4R, mRNA was isolated from horse white blood cells and cDNA was synthesized by reverse transcription. Specific primers were used to amplify the eH4R sequence, which was then cloned into pJET1.2/blunt vectors. The open reading frame is 1185 bp long and codes for a 394 amino acid protein which shows 72,9 % homology to the human receptor. The cDNA sequence was published in the NCBI GenBank under the accession number HM015200. To pharmacologically and functionally characterize the eH4R and hH4R, their cDNAs were subcloned into the expression vector pcDNA3.1 and either transfected transiently into COS-7 cells or stably into HEK293 cells. Binding-characteristics were examined by homologous und heterologous competition experiments using the antagonist 3H-pyrilamine or the agonist 3H-histamine as radioligand. High affinity binding of histamine could only be detected in hH4R, but not in eH4R transfected COS-7 cells. Nevertheless, histamine was able to inhibit cAMP-production in stably transfected HEK293 cells via the eH4R and the hH4R. The eH4R expressed in HEK293 cells is coupled to the stimulation of ERK1/2, while the hH4R shows already high constitutive activity. The antagonists JNJ7777120, Thioperamide, Pyrilamine and Diphenhydramine display considerable species-specific differences concerning the affinities between eH4R and hH4R and also vary in their intrinsic activities. Thioperamide, known for its inverse agonism at the hH4R showed agonist behaviour in ERK1/2 regulation. In contrast, the non-selective antagonist Diphenhydramin showed inverse agonist behaviour, which was more pronounced at the hH4R than the eH4R. These findings suggest that there are considerable pharmacological and functional differences between the cloned eH4R and hH4R.

Präklinische Tests zur Beurteilung der Pharmakokinetik humanisierter therapeutischer Antikörper werden üblicherweise an Mäusen durchgeführt. Konventionelle Nagetiermodelle spiegeln aber nicht die Pharmakokinetik im Menschen wider, da der neonatale Fc-Rezeptor (FcRn), der eine wichtige Rolle bei der Regulation der Homöostase von Immunglobulin Gamma (IgG) spielt, speziesspezifische Unterschiede in der IgG-Bindung zeigt. Aus diesem Grund stellen Mäuse mit modifiziertem FcRn ein wichtiges pharmakologisches Modell bei der Erforschung therapeutischer Antikörper dar. Es wird propagiert, dass Mäuse, denen murines FcRn fehlt und die transgenes humanes FcRn exprimieren, ein vielversprechendes murines Modell sind, um Pharmakokinetiken von therapeutischen humanen IgGs in Primaten vorherzusagen. Um zu klären, ob human FcRn-transgene Mäuse ein geeignetes Nagetiermodell zur Beurteilung des pharmakokinetischen Verhaltens von therapeutischen IgGs darstellen, wurde das pharmakokinetische Verhalten von strukturell und funktionell sehr unterschiedlichen humanisierten Antikörpern in drei unterschiedlichen FcRn-modifizierten Mauslinien untersucht und verglichen. Zusätzlich sollten die Ergebnisse mit Daten von Primaten verglichen werden, um der Hypothese nachzugehen, dass human FcRn-transgene Mäuse geeignet sind, Pharmakokinetiken in Primaten vorherzusagen, und so der Einsatz von Primaten in der pharmazeutischen Forschung verringert werden kann. Antikörper, die in vitro eine erhöhte Affinität zu humanem FcRn besitzen, zeigen in human FcRn-transgenen Mäusen häufig ein verändertes pharmakokinetisches Verhalten. Die Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie ist eine in vitro Methode, die eine Echtzeitmessung der Wechselwirkung eines gelösten Antikörpers mit immobilisiertem FcRn erlaubt. Deshalb wurde mit einer Korrelationsanalyse geprüft, ob ein statistischer Zusammenhang zwischen pharmakokinetischen Daten von Mäusen und Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie-Messungen besteht. Trotz ihres häufigen Einsatzes in der medizinischen Forschung finden sich in der Literatur nur vereinzelt phänotypische Daten dieser FcRn-modifizierten Mäuse, die zudem aufgrund unterschiedlicher Messmethoden oft, nicht als Vergleichswerte herangezogen werden können. Um genetischbedingte Unterschiede der Mauslinien von versuchsbedingten unterscheiden zu können, wurden die Tiere hinsichtlich Hämatologie, klinischer Chemie und Körperwachstum phänotypisiert. Da die eingesetzten Mäuse optisch nicht zu unterscheiden sind, bedurfte es einer sicheren Methode, mit der es möglich ist, die Mauslinien zu differenzieren. Zu diesem Zwecke wurde eine Genotypisierung mittels PCR und anschließender Gelelektrophorese etabliert.