Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06 Archiv

Damaged DNA leads to biological processes such as mutagenesis and apoptosis. Deeper knowledge about DNA lesions, DNA lesion recognition and lesion repair or error-free DNA replication is essential to understand and to prevent these processes. This thesis describes investigations of the UV-light inducible spore photoproduct (SP) and the cyclobutane-pyrimidine-dimer (CPD). In the first part of this work the preparation and purification of a single stranded DNA containing a site-specific defined spore photoproduct is described. This DNA lesion is inducible upon UV-light irradiation of DNA in the presence of pyridinedicarboxylic acid. This SP lesion is the only detectable UV light inducible DNA lesion in the spores of Bacillus and Clostridium species. The limitation to only one UV light lesion is one of the major reasons for the UV resistance of spores, since only one enzyme is necessary for the lesion repair. This repair enzyme is called spore photoproduct lyase. For enzymatic repair studies of the spore photoproduct, the first thermophilic spore photoproduct lyase of G. stearothermophilus (SplG) was cloned, over-expressed, purified and successfully reconstituted. The single stranded DNA containing a spore photoproduct lesion is efficiently repaired by the spore photoproduct lyase. The catalytic activity is 2,6 µmol sporephotoproduct repaired per minute and mg SplG, which results in a calculated turnover of ~100. In the second part of this work, the in vivo and in vitro replication of the spore photoproduct was investigated. For the in vitro assays one high fidelity polymerase of the family A, BstPol1, and two members of the low fidelity family Y, DinB and pol η, were used.

Zyklonukleotid-aktivierte Kationenkanäle (CNG-Kanäle) spielen eine Schlüsselrolle im Seh- und Riechprozess. Der olfaktorische CNG-Kanal besteht aus den Untereinheiten CNGA2, CNGA4 und CNGB1b. Sowohl CNGA4 als auch CNGB1b können in heterologen Expressionssystemen nur zusammen mit CNGA2 funktionelle Kanäle bilden. Sie werden auch als modulatorische Untereinheiten bezeichnet, da sie dem CNG-Kanal charakteristische Eigenschaften verleihen. In der vorliegenden Arbeit sollte die Rolle von CNGB1b im Riechprozess anhand einer CNGB1-defizienten Mauslinie (CNGB1KO-Maus) untersucht werden. CNGB1KO-Mäuse zeigten im Vergleich zu gleichaltrigen Wildtyp-Mäusen ein deutlich eingeschränktes Riechvermögen. Dieses äußerte sich in verringertem Körpergewicht, schlechterem Abschneiden in einem Riechtest und einem veränderten Elektroolfaktogramm (EOG). EOGs von CNGB1KO-Mäusen zeigten verglichen mit WT-Mäusen ein verzögertes Einsetzen, eine verkleinerte Amplitude und eine verlangsamte Rückbildung der Duftantwort. Als Ursache für die verzögert einsetzende Reizantwort konnte eine verringerte Sensitivität des CNG-Kanals gegenüber zyklischen Nukleotiden ausgemacht werden. Die verkleinerte Amplitude im EOG konnte durch eine verringerte Menge an Kanalprotein erklärt werden, was einen um Faktor zehn verminderten CNG-Strom zur Folge hatte. Das verlangsamte Abklingen der Duftantwort konnte auf ein Fehlen der Calcium-Calmodulin-abhängigen Inaktivierung des CNG-Stroms zurückgeführt werden. Eine Interaktion von CNGA2 und CNGA4 in CNGB1-defizienten Neuronen wurde durch Co-Immunpräzipitation nachgewiesen. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurde gezeigt, dass CNGA2 und CNGA4 zwar assemblierten, nicht aber in die Zilienmembran der ORNs transportiert wurden. Vielmehr wurde der CNGA2/CNGA4-Kanal in subziliären Zellkompartimenten zurückgehalten. Der Versuch, die Translokation in das Zilium durch Hemmung des proteolytischen Abbaus der CNG-Untereinheiten zu ermöglichen, war nicht erfolgreich, was auf eine streng reglementierte Qualitätskontrolle in olfaktorischen Rezeptorneuronen schließen ließ. Morphologisch unterschied sich das olfaktorische System von CNGB1KO-Mäusen verglichen mit dem Wildtyp durch eine Reduktion der Schichtdicke des olfaktorischen Epithels sowie einen verkleinerten Bulbus olfactorius. Neurone des Bulbus olfactorius von CNGB1-defizienten Mäusen waren bezüglich ihrer Duftantwort nicht von Wildtyp-Neuronen zu unterscheiden. Für die Bedeutung der CNGB1b-Untereinheit kann festgehalten werden, dass sie dem olfaktorischen CNG-Kanal charakteristische Eigenschaften wie erhöhte Empfindlichkeit gegenüber zyklischen Nukleotiden, die Fähigkeit zur Calcium-Calmodulin-abhängigen Inaktivierung und kontrolliertes Single Channel Flickering verleiht. Zudem spielt die CNGB1b-Untereinheit zusammen mit CNGA4 eine essentielle Rolle für den Transport des CNG-Kanals in die Zilienmembran der ORNs. Darüber hinaus ist CNGB1b unentbehrlich für eine normale Entwicklung des olfaktorischen Systems.

Proteins are central to all biological processes. To become functionally active, newly synthesized protein chains must fold into unique three-dimensional conformations. A group of proteins, known as molecular chaperones, are essential for protein folding to occur with high efficiency in cells. Their main role is to prevent off-pathway reactions during folding that lead to misfolding and aggregation. A number of human diseases are known to result from aberrant folding reactions. The formation of insoluble protein aggregates in neurons is a hallmark of neurodegenerative diseases including Huntington’s disease (HD). These disorders are though to result from the acquisition of dominant, toxic functions of misfolded proteins. HD is caused by a CAG trinucleotide expansion that results in the expansion of a polyglutamine (polyQ) tract in the protein Huntingtin (Htt). The disorder is characterized by a progressive loss of specific neurons and the formation of inclusions containing aggregated Htt. Aggregate formation is causally linked to the progressive HD neuropathology, though it is not clear whether large insoluble, fibrillar structures or smaller assemblies of Htt are the toxic agents. Toxicity could arise from the recruitment of other polyQ-containing proteins, i.e. transcription factors, into the inclusions resulting in a loss of their normal cellular functions. Here, soluble Htt oligomers have been found to accumulate in the nucleus and to inhibit the function of the transcription factors TBP and CBP in cells. Aberrant interaction of toxic Htt with the benign polyQ repeat of TBP structurally destabilized the transcription factor, independent of the formation of insoluble coaggregates and caused transcriptional dysregulation. Chaperones of the Hsp70 family protect against this deactivation by modulating the conformation of Htt. This protective effect of Hsp70 was found to be based on a cooperation between Hsp70 and the chaperonin TRiC. Both chaperone systems cooperate in eliminating toxic polyQ oligomers, which may resemble the potentially pathogenic, prefibrillar states of other amyloidogenic disease proteins, and in stabilizing mutant Htt in a soluble, oligomeric state that is not associated with toxicity. TRiC and Hsp70 appear to be part of an effective chaperone network preventing the formation of harmful, amyloidogenic proteins species. They act synergistically on Htt, reminiscent of their sequential action in assisting the folding of newly-synthesized proteins.

Synthese der natürlichen tRNA Nukleosidmodifikationen Queuosin und Archaeosin

We have prepared a number of polyfunctional arylmagnesium or arylzinc reagents bearing a triazene moiety. According to some of the methodologies, we applied them in the new synthesis of functionalized carbazoles, functionalized terphenyls, and natural products such as ellipticine, and 9-methoxyellipticine.

Basierend auf der Genomsequenz von H. sal. R1 wurde ein genspezifischer Gesamt-Genom-DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurden für jeden ORF des Genoms ORF-spezifische Oligonukleotide abgeleitet und zur spezifischen Amplifizierung der Genabschnitte mittels PCR eingesetzt. Nach Amplifizierung und Reinigung der Genabschnitte deckten die Produkte über 97% des halobakteriellen Genoms ab. Zur Konstruktion des Gesamt-Genom-DNA-Mikroarrays wurde jede spezifische Gensonde in fünffacher Wiederholung auf den DNA-Array aufgebracht. Auf diese Weise wurde ein DNA-Mikroarray erstellt, der mit einer Gesamtzahl von 13545 genspezifischen Sonden, das bisher dichteste Raster eines archaealen DNA-Mikroarrays aufweist. Durch parallele genomweite Genexpressionsanalyse in H. sal. R1, wurde der Vergleich zwischen aerobem und phototrophem Wachstum in drei umfassenden DNA-Mikroarrayexperimenten gezogen. Die Mikroarrayexperimente wurden mit dem so genannten „common reference“ Experimentdesign durchgeführt, bei dem eine Mischung aller RNA-Proben eines Experiments als Referenz bei den Hybridisierungen dient. Als weitere Vorraussetzung zur späteren statistischen Datenanalyse wurden die Transkriptomexperimente alle vier- bis fünfmal in unabhängigen Experimenten wiederholt. Die Wahl der Referenz und die Anzahl der unabhängigen biologischen Replikate haben die Basis geschaffen, die erhobenen Expressionsdaten mit Hilfe des R/MAANOVA Paktes der flexiblen und leistungsstarken statistischen Programmoberfläche R auszuwerten. Eine leistungsstarke und flexible Programmoberfläche zur Datenanalyse war unerlässlich, denn mit steigender Komplexität eines Transkriptomexperiments, steigt auch die Anzahl der notwendigen Wiederholungen und damit einhergehend die Gesamtzahl der auszuwertenden Datenpunkte. Für ein durchgeführtes Zeitreihenexperiment vom Wechsel aerobes zu phototrophem Wachstum mit sechs Zeitpunkten, fallen ca. 384.000 Datenpunkte an, für deren Vorder- und Hintergrundwerte die statistischen Kennwerte berechnet werden mussten. Ein solcher statistischer Kennwert ist der so genannte p-Wert, der die Signifikanz eines Ergebnisses widerspiegelt. Auf der Basis dieser signifikanten p-Werte ist eine Liste von 242 Kandidatengenen erstellt worden, die als differentiell exprimiert angesehen werden. Ein Anteil von 54.5% dieser differentiell exprimierten Gene weist kein homologes Protein oder Funktion auf. Diese Tatsache, birgt die Chance sowohl die Existenz dieser ORFs, als auch ihre Funktion aufzuklären. In diesem Zusammenhang wurden für die hypothetischen ORFs OE3107F und OE3136F Deletionsmutanten hergestellt und näher charakterisiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Deletionsmutanten R1D3107 und R1D3136 im Vergleich zum WT-Stamm H. sal. R1 deutliche Unterschiede in ihrer Pigmentzusammensetzung aufweisen. Beide Deletionsstämme weisen z.B. einen geringeren Gehalt an Bakteriorhodopsin auf. Somit hat die neu etablierte Methode der DNA-Mikroarray basierten Genexpressionsanalyse dazu beigetragen, zwei bisher unbekannte Kandidaten der Regulation der Expression des Bakteriorhodopsins in H. sal. R1 zu identifizieren. Durch zellfreie in vitro Expression des Gens OE3136F wurde ein möglicher Ansatz zur näheren Charakterisierung und Funktionsaufklärung aufgezeigt. Neben der Herstellung von Deletionsmutanten und deren Charakterisierung, wurde durch die Anwendung einer weiteren Datenanalyse mittels PCA (Hauptkomponentenanalyse) und dem Ansatz die erhobenen Transkriptomdaten auf Stoffwechselwegen abzubilden, zwei weitere denkbare Wege aufgezeigt, aus den ermittelten Expressionsdaten mehr Informationen zu erhalten. Die Ergebnisse aller Transkriptomexperimente für H. sal. R1 stimmen mit den Ergebnissen früherer Arbeiten überein und durch unabhängige Methoden wie RT-PCR, Nothern-Blot-Analysen und Proteomvergleich konnten die Resultate der Expressionsanalysen eindeutig verifiziert werden. Die Konstruktion und Herstellung der H. sal. R1 Gesamtgenom-Mikroarrays und Ausarbeitung eines Standardprotokolls zur Versuchsdurchführung, bilden die Grundlage aller Transkriptomexperimente der Arbeitsgruppe. Daneben ermöglicht die Schaffung einer bioinformatischen Infrastruktur zur statistisch signifikanten Auswertung der DNA-Mikroarray-Hybridisierungsergebnisse die Erstellung einer Transkriptomdatenbank, die durch Anknüpfung an die bereits vorhandene HaloLex-Datenbank jedem Nutzer für weitere Mikroarray-Experimente mit anderer Fragestellung in leichter Form zur Verfügung steht. Abschließend kann gesagt werden, dass die DNA-Mikroarray basierende Transkriptomanalyse von H. sal. R1 dazu beigetragen hat das Wissen über den Prozess der Anpassung an das phototrophe Wachstum zu erweitern. Die in der Arbeit erhobenen Daten bilden die Grundlage einer Datensammlung, die es zu einem späteren Zeitpunkt ermöglichen wird, über viele verschiedene Experimente hinweg neue Co-Regulationen von Genen zu erfassen und damit neue Gene und Verknüpfungen zwischen Stoffwechselwegen schnell und einfach zu detektieren. Die vorliegende Arbeit kann als Ausgangspunkt für genomweite funktionelle Charakterisierung haloarchaealer Genexpression und ihrer Regulation angesehen werden. Dieser Punkt ist im Hinblick auf die wachsende Bedeutung der Systembiologie von entscheidender Wichtigkeit, denn nur auf der Basis von soliden experimentellen Ergebnissen können Modelle aufgestellt und verbessert werden.

Using the [2,3]-sigmatropic rearrangement of chiral allylic diarylphosphinites, a number of new enantiopure 1,3-diphoshine ligands were prepared. Enzymatic kinetic rezolution of allylic alcohols was used for the preparation of enantiopure starting materials. Several new reactions of organozinc compounds, i. e. new thiolation method, Ni-catalyzed cross-coupling reactions and a method of preparation of alkylzinc bromides from the corresponding alkylbromides were developed.

A synthetic access to polymagnesiated aromatics and heteroaromatics via multiple magnesiations was developed, their reactivity towards different electrophiles was explored. A diatereoselective synthesis of functionalized cyclopropane carbenoids was developed. Soluble Lanthanide soloutions were prepared and used in the addition reactions of Grignard reagents to carbonyl compounds.

Pyrrole-imidazole alkaloids represent a unique family of natural products which are exclusively found in marine sponges, mainly the Agelasidae, Axinellidae, and Halichondridae families. The pyrrole-imidazole alkaloids are fascinating due to thier biogenetic relationship leading to a large, strucurally diverse family based on a common key metabolite, oroidin. Some of the pyrrole-imidazole alkaloids have interesting biological activities, e. g., potent antitumor or antibacterial activities. One of these chellenging alkaloids is dibromophakellstatin which was first isolated from Phakellia mauritiana. In this work an efficient five step synthesis of dibromophakellstatin is described providing the natural product in an overall yield of 10%. Based on a broad investigation of the reactivity of dipyrrolopyrazinone-type enamides, a novel three component imidazolidinone anellation was exploited as the key step of the total synthesis. With this findings the overall yield of the synthesis could increased up to 18%. Based on these results it was possible to develope the first enantioselective total synthesis of (-)-dibromophakellstatin in a chiral pool approach (10 steps, 3.5% overall yield). In a collaboration effort the antitumor activity of dibromophakellstatin was confirmed. It was found that only the natural enantiomer shows biological activity by an unknown mechanism. Encouraged by the biological activity of (-)-dibromophakellstatin, different cyclopropane variations of the tetracyclic phakellin- and isophakellin scaffolds were obtained by reaction of dichlorocarbene with tri- and bicyclic precursors. Some of these compounds werde found to have interesting new anti proliferative activities.