Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06 Archiv
250 Episoden
1 Minute
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Proteome von H. salinarum untersucht, die nach zellulären Kompartimenten unterschieden wurden in (1) das Flagellarmotor-Proteom (2) das Cytosolproteom und (3) das Membranproteom. Die Untersuchung des Flagellarmotors erfolgte hauptsächlich auf struktureller Basis mittels Elektronenmikroskopie. Es konnte eine Struktur mit zwei übereinanderliegenden Ringen isoliert werden, die beide an eine Flagelle gebunden sind. Aus weiteren Aufnahmen und Größenkorrelationen wurde ein Modell zum Flagellarmotor entworfen, welches eine Rotation beider Ringe beinhaltet. An diese Doppelringstruktur sind mehrere Flagellen über einen Hook gebunden, was dieses Modell damit vom bakteriellen Flagellarmotor unterscheidet. Bei der Untersuchung des Cytosolproteoms konnten insgesamt 840 Proteine mittels MALDI-MS-Fingerprint identifiziert werden, was einer Identifizierungsrate von 38% des löslichen Proteoms entspricht (Identifizierungsrate aller löslichen Proteine größer 20 kD: 61%). Es wurde eine massenkompatible Silberfärbung optimiert und ein semi-manuelles Verfahren zur in-Gel Spaltung entwickelt, mit dem 800 Proteine/Tag enzymatisch gespalten werden können. Für die anschließende Identifizierung wurde ein Standardprotokoll für die Proben- und Matrixpräparation entwickelt, welches sich im Vergleich zu anderen automatischen Präparationen als zuverlässiger und sensitiver gezeigt hat. Im Verlauf dieser Arbeit wurde von der Bioinformatikgruppe (Dr. F. Pfeiffer) das web-basierte HALOLEX-System entwickelt, welches als Ziel die vollständige Erfassung aller Fakten zu H. salinarum hat. Die generierten Daten (Gele, Proteinidentifizierungen, MALDI-Peaks, MS/MS-Peaks) werden innerhalb dieser Oberfläche zugänglich gemacht und erlauben detaillierte Nachanalysen. Für das Membranproteom wurde gezeigt, dass der etablierte Zellaufschluss mittels Niedrigsalz-Dialyse zu einer erheblichen Kontamination mit löslichen Proteinen führt. Ein Aufschluss unter Hochsalzbedingungen mit anschließender Dichtegradienten-Zentrifugation reinigt die Membran, jedoch dissoziiert die Zellmembran bei anschließender Niedrigsalz-Behandlung in hohem Maße in nicht pelletierbare Fragmente. Eine optimierte Membranaufarbeitung unter ständigen Hochsalzbedingungen, Dichtegradienten-Zentrifugation, Delipidierung und Solubilisierung in einer Detergenzienmischung (Triton X-100/ASB-14) führte bei anschließender zweidimensionaler Trennung (IEF/SDS) zur Identifizierung von fast ausschließlich peripheren Membranproteinen. Mit einer fluoreszenzmarkierten Membranfraktion konnte gezeigt werden, dass der Verlust von integralen Membranproteinen auf einer nahezu quantitativen Präzipitation der Membranproteine an derem pI beruht. Eine pI-unabhängige Strategie wurde mittels BAC/SDS etabliert, die speziell bei H. salinarum zu einer guten Proteinauftrennung führt. Die Identifizierung eines 13 TM-Antiporters (0,22 TM/kD, GRAVY +0,74) als dominantestes Protein dieser Membranfraktion zeigt die Anwendbarkeit dieses Systems. In einem Vergleich von Membranfraktionen aus aerob und phototroph gewachsenen Kulturen konnten so Unterschiede des Expressionsniveaus von Membranproteinen nachgewiesen werden. Aus theoretischen Berechnungen der vorhergesagten Membranproteine zeigte sich weiterhin, dass bei tryptischer Spaltung nicht ausreichend Peptid-Fragmente generiert werden, um mittels MALDI-Fingerprint-Analyse identifiziert zu werden. Diese (H. salinarum spezifische) Problematik kann mittels MS/MS umgangen werden. Bei der Kombination aus 1-D Gel und LC/MS/MS konnten schließlich 114 integrale Membranproteine identifiziert werden, was 20% des integralen Membranproteoms entspricht.
1 Minute
Morphologie und Dynamik der Mitochondrien spielen eine wichtige Rolle für die Vererbung der Organellen und die korrekte Ausübung ihrer physiologischen Pflichten. Über die molekularen Mechanismen, die der Gestaltgebung und Dynamik der Mitochondrien zugrunde liegen, ist relativ wenig bekannt. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus wurden einige Proteine identifiziert – das Verständnis vieler Prozesse, wie z. B. Fusion, Teilung und Bewegung der Mitochondrien, stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung für die zellbiologische Forschung dar. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein innovativer Ansatz verfolgt, um neue mitochondriale Morphologiekomponenten in S. cerevisiae zu identifizieren. Dabei wurde eine Stammsammlung verwendet, die Deletionsmutanten sämtlicher nicht-essentieller Hefegene enthält. Diese Stämme wurden systematisch durch Fluoreszenzmikroskopie nach Mutanten durchsucht, die eine veränderte mitochondriale Morphologie aufweisen. Dadurch konnte die Anzahl der bekannten Proteine, die einen Einfluss auf die mitochondriale Morphogenese besitzen, von bis dato neun auf 24 erhöht werden. Fünf der neuen Komponenten, von denen zehn bislang gänzlich uncharakterisiert waren, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit entdeckt. Für eine eingehende Analyse im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit, wurden die beiden neuentdeckten Proteine Mdm31 und Mdm32 ausgewählt. Diese beiden Proteine sind Mitglieder einer neuen Proteinfamilie und liegen als höhermolekulare Proteinkomplexe in der mitochondrialen Innenmembran vor, die transient miteinander interagieren. Die Topologie von Mdm31 und Mdm32, deren Hauptteil im Intermembranraum liegt, ist ein Hinweis auf eine mögliche Kooperation der beiden Proteine mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran. Deletionsmutanten von MDM31 und MDM32 weisen sphärische Riesenmitochondrien auf, deren Motilität drastisch reduziert ist. Durch diesen Motilitätsdefekt kommt es zu einem verringerten Transport der Mitochondrien in die Tochterzellen bei der Zytokinese. Darüber hinaus ist das mitochondriale Genom in Δmdm31- und Δmdm32-Stämmen instabil und geht nach längerem Wachstum auf fermentierbaren Kohlenstoffquellen in einem Teil der Zellen verloren. Ferner ist die Struktur der Nukleoide, in denen die mitochondriale DNA verpackt ist, in diesen Stämmen verändert. Während man in Wildtyp-Zellen 10-15 Nukleoide beobachtet, weisen die Mitochondrien der Deletionsstämme ein oder zwei riesige diffuse DNA-Stukturen auf. Diese strukturellen Veränderungen der Mitochondrien und das Verhalten des mitochondrialen Genoms in den Δmdm31- und Δmdm32-Deletionsmutanten weisen Ähnlichkeiten zu Zellen auf, denen die Außenmembranproteine Mmm1, Mdm10, Mdm12 oder Mmm2 fehlen. Die Deletion von MDM31 oder MDM32 in Kombination mit MMM1, MDM10, MDM12 oder MMM2 ist synthetisch letal, d. h. die Doppelmutanten sind nicht lebensfähig. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die beteiligten Komponenten eine Funktion in demselben zellulären Prozess spielen. Wahrscheinlich führt die Addition der Effekte, die die Einzeldeletionen auf die Struktur und Motilität der Mitochondrien haben, zur kompletten Hemmung der Vererbung der Organellen. Damit sind Mdm31 und Mdm32 die ersten mitochondrialen Innenmembranproteine, für die ein funktioneller Zusammenhang mit Komponenten der mitochondrialen Außenmembran bei der Vererbung und strukturellen Integrität der Mitochondrien gezeigt werden konnte. Ferner sind sie die ersten Proteine der mitochondrialen Innenmembran, die Einfluss auf die Struktur und Stabilität des mitochondrialen Genoms nehmen.
1 Minute
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Serie von unterschiedlichen, bifunktionalen 3-Cyano-2-pyridonderivaten synthetisiert. Die Substanzen wurden in einem unpolaren Reaktionsmedium auf ihre katalytische Aktivität überprüft. Als Modellreaktion diente dabei die n-Butylaminolyse von p-Nitrophenylacetat, die mit Hilfe von 1H-NMR-Messungen in CDCl3 spektroskopisch verfolgt wurde. Wegen der begrenzten Löslichkeit der 3-Cyano-2-pyridone in unpolaren Medien war es notwendig, den Grundkörper durch Ringstrukturen und Alkylketten zu erweitern. Durch sukzessive und unabhängige Bestimmung der in der Reaktionskinetik vorhandenen Variablen wurde deren Anzahl im formulierten Geschwindigkeitsgesetz vermindert und eine exaktere Ermittlung der katalysatorabhängigen Geschwindigkeitskonstanten kkat ermöglicht. In diesem Zusammenhang wurde eine detaillierte Untersuchung des Assoziationsverhaltens der 2-Pyridone sowohl im angewandten Reaktionsmedium, als auch in den Festkörperstrukturen durchgeführt. Bei den kinetischen Untersuchungen der Aminolysereaktion wurde ein nichtlineares Verhalten der katalytischen Aktivität bei der konzentrationsabhängigen Zugabe von 2-Pyridonderivaten festgestellt. Ein kinetisches Modell, bei dem die Bildung von katalytisch abgeschwächten Pyridondimeren für die eingeschränkte Aktivität verantwortlich ist, wurde durch Kombination von temperatur- und konzentrationsabhängigen 1H-NMR-Messungen näher untersucht. Ein Vergleich der Ergebnisse zeigte eindeutig, dass eine Dimerenbildung nicht für die auftretende Nichtlinearität verantwortlich sein kann. Als wesentlich besser geeignet stellte sich ein kinetische Modell heraus, welches über ein vorgelagertes Gleichgewicht beschrieben wird. Die Bildung eines Katalysator-Substrat-Komplexes führt hierbei zur Erklärung der Nichtlinearität. Eine veränderte Einwirkung der unterschiedlichen Substitutionmuster der getesteten 3-Cyano-2-pyridone auf die Katalysatorkonstante kkat konnte kaum festgestellt werden. Eine weitere Motivation dieser Arbeit stellte die Entwicklung einer Modellreaktion für die Ester- und Amidspaltung unter physiologischen Bedingungen dar. Die Analytik wurde dabei auf eine HPLC-Analysenmethode übertragen. Dies ermöglichte die Detektion kleinster Veränderungen in den Konzentrationsverhältnissen und das Auffinden geringer Spuren von Nebenprodukten. Als Esterkomponente kam hier das in Gram-positiv Bakterien vorhandene Depsipeptidmotiv D-Ala-D-Lac zum Einsatz. Zur Visualisierung der Leitstruktur und der möglichen Reaktionsprodukte mit UV/Vis-Technik wurden die entsprechenden p-Nitrobenzoylderivate synthetisiert. Mit diesen Referenzsubstanzen wurde eine kinetische Analysenmethode entwickelt, welche eine einwandfreie Verfolgung der Reaktion des Substrats mit Nucleophilen wie Wasser, n-Butylamin und ausgewählten 2-Pyridonderivaten in einem wässrigen, gepufferten Medium bei 37 °C gewährleistet. Sie eignet sich außerdem zur routinemäßigen Überprüfung von Katalysatorsubstanzen und ermöglicht eine Quantifizierung der entsprechenden Reaktanten und Reaktionsprodukte.Über pH-Wert-abhängige Messungen der Hydrolysereaktionen konnte eine allgemeine Basenkatalyse für das vorliegende System festgestellt werden. Neben der starken Hydrolyse des D-Ala-D-Lac-Motivs in der mit n-Butylamin basenkatalysierten Reaktion konnte eine Bildung eines entsprechenden Aminolyseprodukts nicht nachgewiesen werden. Eine Beschleunigung der Aminolyse beim Einsatz der Pyridonderivate in der basenkatalysierten Reaktion mit n-Butylamin konnte ebenfalls nicht festgestellt werden. Eine verstärkt auftretende Spaltung der Amidbindung zwischen der chromophoren Einheit und dem D-Ala-D-Lac-Motiv dagegen konnte zweifelsfrei nachgewiesen und quantifiziert werden.
1 Minute
The subject of this work was to use the SPR-KKR formalism to investigate the ground state properties of materials from Cr-chalcogenide class and to describe the spectroscopic properties (Compton scattering and possitron annihilation) of different metallic systems. The fundamentals of the theoretical approach applied is presented in Chapter 2. In particular, the basics of the density functional theory used to reduce the many body electron-electron interaction to single electrons moving independently in an effective potential, together with the SPR-KKR formalism used to solve the electronic structure problem are discussed in detail. This theoretical formalism is applied to get the description of the magnetic Compton profile, as it is shown in Chapter 3, together with the results for pure metals, alloys and ordered compounds. The formalism which describe the positron annihilation os presented in Chapter 4. The 2D projection of the electron-positron momentum density for V it was compared with the experimental spectra and with the LMTO calculated spectra. A complementary approach to investigate the magnetic behaviour of solids using a microscopic model of the magnetic interaction was combined with the SPR-KKR band structure calculations in order to determine the magnetic ground state of CrSe and CrTe systems. The influence of the exchange-correlation treatment on the equilibrium lattice parameters for CrSexTe1-x alloy was investigated. The magnetic moments and density of states for Cr5Te8 system substituted with Se and Ti have been investigated, as can be seen in Chapter 5.
1 Minute
The hyperpolarization-activated, cyclic-nucleotide-gated cation channel (HCN) familiy comprises four members. The channels play a role in the formation of rhythmic activity of heart and brain. In contrast to the other three members of the HCN channel family, there are only a few studies of tissue distribution and electrophysiological properties of HCN3 so far. Expression has been reported at low levels, but throughout the brain, in some other tissues such as retina, olfactory epithelium and recently in the heart. In order to study the physiological relevance of HCN3 expression, we generated HCN3-deficient mouse lines by gene targeting and homologous recombination: a complete Knockout, a complete Knockout expressing the reporter gene lacZ instead of HCN3 and a conditional Knockout using the Cre-loxP system to study spatial and temporal functions of this pacemaker channel. The functional characterization included behavioural studies and heart physiology.
1 Minute
Cyclic nucleotide-gated (CNG) channels are important mediators in the transduction pathways of rod and cone photoreceptors and olfactory receptor neurons. Native CNG channels are composed of homologous A and B subunits. In heterologous expression systems, B subunits alone cannot form functional CNG channels, but they confer a number of channel properties when coexpressed with A subunits. To investigate the importance of the CNGB subunits in vivo, we deleted the CNGB1 gene in mice by gene targeting and homologous recombination. In the absence of CNGB1 in the rods, only trace amounts of the CNGA1 subunit were found in the rod outer segment. In electroretinograms (ERGs) CNGB1 KO-mice showed no rod-mediated responses. The rods also showed a slow-progressing degeneration caused by apoptotic death and concurred by retinal gliosis. Cones were primarily unaffected, but they started to degenerate after 6 months. At the age of about one year, CNGB1 KO-animals were lacking both rods and cones. Our results show that CNGB1 is a crucial determinant of native CNG channel targeting. As a result of the lack of rod CNG channels, CNGB1 KO-mice develop a retinal degeneration that resembles human retinitis pigmentosa.
1 Minute
Glucocorticoidresistenz ist ein Phänomen, das bei vielen Krankheiten eine wichtige Bedeutung hat. Insbesondere wird vermutet, dass ihr eine kausale Rolle bei depressiven Erkrankungen zukommt. In den meisten Fällen kommt die Resistenz durch eine Fehlfunktion des Glucocorticoidrezeptors zustande. Deswegen ist es von grossem Interesse, den Signalweg dieses Rezeptors im Detail zu verstehen. In der Vergangenheit wurde viel zum Verständnis beigetragen, unter anderem indem eine Reihe von GR-Regulatoren identifiziert und deren Wirkungsmechanismus aufgeklärt wurde. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Faktoren zu finden, die in die GR-Signaltransduktion verwickelt sind. Dazu wurde ein funktioneller Screen durchgeführt, der darauf beruhte, GC-resistente Zellen herzustellen, diese mit responsiven Zellen zu vergleichen und damit Kandidaten zu identifizieren, die möglicherweise die GR-Funktion regulieren. Für die Herstellung hormonresistenter Zellen wurde eine humane Zelllinie hergestellt, die in Anwesenheit von Hormon nicht überleben kann; diese wurde zufallsverteilt mutiert und in GC-haltigem Medium selektiert. Drei hormonresistente Klone konnten die Selektion überleben, einer davon wurde im Detail charakterisiert, dessen Proteinexpressionsmuster mittels 2D-Gelektrophorese mit derjenigen der Ausgangszelllinie verglichen und die unterschiedlich exprimierten Faktoren mittels Tandem-Massenspektrometrie analysiert. Dies führte zur Identifikation von vier Kandidaten: Thioredoxin, hsp27, Reticulocalbin und Cofilin 1, deren Wirkung auf den GR in verschiedenen Zelllinien getestet wurde. Während die ersten drei keinen Einfluss auf den GR hatten, konnte Cofilin als neuer GR-Inhibitor etabliert werden. Cofilin ist gut untersucht als Depolymerisierungsfaktor des Actin-Cytoskeletts, eine Rolle im Signalweg des GRs oder eines anderen Transkriptionsfaktors war bis jetzt jedoch nicht bekannt. Es zeigte sich, dass seine inhibitorische Wirkung auf den GR von seiner Funktion in der Actin-Regulation abhängig war, und ausserdem, dass Cofilin eine Veränderung der intrazellulären Rezeptorverteilung vor Hormongabe bewirkte. In nachfolgenden Experimenten wurde gefunden, dass sowohl die chemische Zerstörung des Actin-Cytoskeletts wie auch die direkte Erhöhung des Anteils an freiem Actin zur GR-Inhibierung und veränderten Rezeptorverteilung führt. Des Weiteren wurde entdeckt, dass erhöhte Mengen an freiem Actin den bekannten GR-Inhibitor c-Jun induzieren, wodurch folgendes Modell aufgestellt wurde: Cofilin erhöht durch seine Actin-Depolymerisierungsfunktion freies Actin, damit wird über einen noch unbekannten Mechanismus c-Jun induziert, welches wiederum den GR inhibiert. Damit wurde über einen zellulären genetischen Screen Cofilin 1 als ein neuer GR-Regulator identifiziert und nachfolgend der inhibierende Wirkungsmechanismus von Cofilin aufgeklärt.
1 Minute
In der vorliegenden Arbeit wurden die beiden Histon-Methyltransferasen Su(var)3-9 und E(Z) aus Drosophila melanogaster charakterisiert. Die Histonmethylierung als Modifikation war schon länger bekannt gewesen, bis zum Jahr 2000 war jedoch vor allem die Acetylierung etwas genauer untersucht worden. Su(var)3-9 war die einzige bekannte Histon-Lysin-Methyltransferase, als diese Arbeit begonnen wurde. Zur Charakterisierung wurde das myc-getagte Enzym aus Drosophila-Kernextrakt durch Affinitätschromatographie aufgereinigt und zunächst die Substratspezifität festgestellt. Wie das humane Enzym Suv39H1 methyliert es ebenfalls spezifisch H3-K9 (Lysin 9 im Histon H3). Das aus den Kernextrakten aufgereinigte Enzym besitzt aber auch die Fähigkeit, ein an H3-K9 präacetyliertes Substrat zu methylieren. Die Vermutung, dass Su(var)3-9 mit einer Histondeacetylase assoziiert ist, konnte durch Verwendung von TSA als HDAC-Inhibitor bestätigt werden. Es stellte sich heraus, dass HDAC1 (Rpd3) mit Su(var)3-9 assoziiert ist. Um das Enzym besser untersuchen zu können, wurde es als Volllängenprotein und als Deletionsmutante in E. coli exprimiert. Die Aufreinigung des rekombinanten Enzyms sowie seine Lagerbedingungen wurden optimiert. Das Volllängenprotein Su(var)3-9 liegt – wie durch Gelfiltration festgestellt - als Dimer vor, die Interaktion mit sich selbst ist über den N-Terminus vermittelt. Su(var)3-9 bindet an sein eigenes, bereits methyliertes Substrat. Dies wurde an Peptiden untersucht, die den ersten 20 Aminosäuren des Histons H3 entsprechen, und entweder an Lysin 9 dimethyliert oder unmodifiziert waren. Die Interaktion mit dem methylierten Substrat ist auf die Chromodomäne von Su(var)3-9 zurückzuführen, ist jedoch schwächer als die Wechselwirkung von HP1 mit methyliertem H3-K9. Des weiteren wurde eine Drosophila-Zelllinie stabil mit Su(var)3-9 transfiziert. Das überexprimierte Protein ist jedoch nur schwach aktiv. Die Tatsachen, dass Su(var)3-9 mit HDAC1 interagiert sowie mit seinem eigenen Substrat assoziiert, ermöglichen die Aufstellung von Hypothesen über die bis jetzt kaum erhellte Ausbreitung von Heterochromatin in euchromatische Bereiche. Durch die Wechselwirkung mit der Deacetylase könnte Su(var)3-9 auch in aktiv transkribierte Bereiche vordringen und diese methylieren. Die Acetylierung, Zeichen für aktive Transkription, würde durch die Methylierung ersetzt werden. Die Interaktion mit seinem umgesetzten Substrat könnte verhindern, dass das Enzym sich nach der Reaktion entfernt, vielmehr könnte Su(var)3-9 entlang eines DNA-Stranges sukzessive alle Nukleosomen methylieren. Die darauffolgende Bindung von HP1 an methyliertes H3-K9 könnte den heterochromatischen Charakter des Chromatins verstärken und für längere Zeit festlegen. Aus Drosophila-Kernextrakten gelang es weiterhin, den E(Z)/ESC-Komplex über Säulenchromatographie aufzureinigen. Dieser enthält neben E(Z), ESC, p55 und Rpd3 auch Su(z)12. E(Z), ESC und Su(z)12 gehören der Polycomb-Gruppe an. Deren Funktion ist die dauerhafte Repression der homöotischen Gene. Sie spielen daher eine wichtige Rolle im „Zellgedächtnis“ während der frühen Entwicklung von Drosophila. Es konnte gezeigt werden, dass der E(Z)/ESC-Komplex Lysin 9 sowie Lysin 27 im Histon H3 methyliert. Außerdem wurde in vitro ein Teilkomplex aus rekombinantem E(Z), p55 und ESC rekonstituiert, der das Histon H3 methylieren kann. Ein Teilkomplex, der E(Z) mit mutierter SET-Domäne enthält, ist nicht in der Lage, H3 zu methylieren. Die Vorhersage, dass E(Z) aufgrund seiner SET-Domäne eine Methyltransferase sein müsse, konnte durch vorliegende Untersuchungen bestätigt werden. Polycomb ist ein weiteres Protein aus der Polycomb-Gruppe. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass dieses Protein spezifisch an das Histon H3 bindet, das an K27 trimethyliert ist. Polycomb besitzt wie HP1 eine Chromodomäne. Aus den vorliegenden Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Nach der Methylierung von H3-K9 sowie H3-K27 durch den E(Z)/ESC-Komplex in homöotischen Genen, die schon abgeschaltet sind und weiterhin reprimiert werden müssen, bindet Polycomb an dieses Methylierungsmuster. Polycomb befindet sich in einem großen Komplex mit weiteren Polycomb-Gruppen-Proteinen. Die Bindung dieses Komplexes an Chromatin könnte ein denkbarer Mechanismus sein, wie die dauerhafte Repression der homöotischen Gene vermittelt wird. Um den E(Z)/ESC-Komplex genauer untersuchen zu können, wurden Viren für das Baculosystem hergestellt, so dass eine Einzel- oder auch Coexpression der Proteine möglich ist. Die Aktivität von E(Z), das im Baculosystem exprimiert wurde, ist nicht besonders hoch. Es bindet unter den in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen weder an DNA, noch an Histone noch an H3-Peptide, die methyliert sind. Innerhalb des E(Z)/ESC-Komplexes bindet E(Z) an p55, Rpd3, ESC sowie Su(z)12. Su(z)12 interagiert mit p55, Rpd3 und E(Z). Die weiteren Interaktionen werden am besten durch eine bildliche Darstellung (siehe Abb. 86) vermittelt. In einem Luciferase-Assay wurde eine repressive Wirkung von E(Z) festgestellt. Dieses Experiment bedarf allerdings eines aktivierten Systems. Ferner muss durch Mutationsanalysen sichergestellt werden, dass die repressive Wirkung auf die Methyltransferase-Aktivität von E(Z) zurückzuführen ist. Kürzlich wurde entdeckt, dass E(Z) sowie Su(z)12 in verschiedenen Tumoren überexprimiert sind. Noch ist weder deren Funktion in den Tumorzellen klar, noch weiss man, ob die Überexpression der Grund oder eine Folge der Tumorbildung ist, noch kennt man alle Zielgene, die durch eine Überexpression von E(Z) und Su(z)12 beeinflusst werden. In nächster Zeit sind hier Einsichten in die Wirkungsweise von E(Z), Su(z)12 und anderen Polycomb-Gruppen-Proteinen zu erwarten.
1 Minute
Regulation of gene expression takes place in the nucleus in a highly structured and condensed nucleoprotein environment, called chromatin (Felsenfeld and Groudine, 2003; Khorasanizadeh, 2004; Vaquero et al., 2003). A broad group of factors regulates the properties of chromatin; e.g. by covalently modifying histones and / or by ATP-dependent chromatin remodeling, thereby allowing or preventing gene expression. The mammalian genome contains hundreds of gene copies encoding precursor ribosomal RNA and the transcription of these genes is highly regulated with respect to cellular metabolism (Grummt, 2003). However, even in actively growing cells, only a subset of the rRNA genes are actively transcribed, exhibiting an accessible chromatin conformation (Conconi et al., 1989). In a chromatin context, the activation of rDNA genes involves the transcription termination factor TTF-I (Längst et al., 1998; Längst et al., 1997a). However, the silenced rDNA gene fraction remains in an inaccessible heterochromatic state throughout the cell cycle (Conconi et al., 1989). Until recently, the onset of silencing and the mechanisms that maintain the inactive state of rRNA genes were less understood. Recent studies, including the work presented in this thesis, provide insights into the molecular mechanism of ribosomal RNA gene silencing (Lawrence et al., 2004; Németh et al., 2004; Santoro and Grummt, 2001; Santoro et al., 2002; Strohner et al., 2004; Zhou et al., 2002). Accumulating evidence indicates that the combined action of chromatin modifying mechanisms such as chromatin remodeling, histone modification and DNA methylation contribute to the process of rRNA gene silencing. Here I present data demonstrating an active role of the chromatin remodeling complex NoRC in rDNA gene silencing and propose dual functions of TTF-I in rDNA regulation in chromatin, namely involvement in both activation and silencing of rDNA transcription. 4.1 NoRC, a novel chromatin remodeling complex In this doctoral study, a novel protein complex, composed of the nucleolar protein Tip5 and the ATPase Snf2h, was purified using convential chromatography and affinity purification methods. A detailed chromatin remodeling analysis revealed that this complex is able to induce mononucleosome movement in an ATP and histone H4 tail dependent fashion. Finally, this Tip5-Snf2h complex was termed NoRC (nucleolar remodeling complex), a novel member of the ISWI family of ATP-dependent chromatin remodeling complexes (Strohner et al., 2001). To dissect its functions, the NoRC complex was reconstituted from its recombinant subunits Tip5 and Snf2h, using the baculo virus driven expression system. Reconstitution confirmed the direct interaction between Tip5 and Snf2h. Furthermore, recombinant and cellular NoRC display similar sizes in gel filtration columns. Recombinant NoRC exhibits chromatin stimulated ATPase activity and mobilizes nucleosomes in an energy-dependent manner. Both activities are histone H4 tail dependent. NoRC and its subunits Tip5 and Snf2h were compared in different DNA / Nucleosome binding assays. NoRC shows preferred binding to structured (bent) DNA, e.g. a region within the mouse rDNA promoter, and interacts with mononucleosomes in electrophoretic mobility shift assays (EMSA). While no stable interaction with core nucleosomes could be detected in EMSA, ATPase assays and DNase I protection assays noticeably pinpointed to NoRC / nucleosome interactions with both nucleosomal and protruding linker DNA. 4.2 NoRC specifically represses rDNA transcription in chromatin The functional consequences of the Tip5 / TTF-I interaction were assessed and the influence on chromatin structure of the rDNA promoter in an in vitro system was determined. Tip5 in NoRC interacts with the N-terminal part of full length TTF-I and unmasks its DNA binding site. This interaction is required both for binding of TTF-I to its promoter-proximal target site and for the recruitment of NoRC to the promoter in chromatin. After association with the rDNA promoter, NoRC alters the position of the promoter-bound nucleosome. To elucidate a potential role of NoRC in rDNA transcriptional regulation, we used an in vitro transcription system with an rDNA minigene reconstituted into chromatin. These studies revealed a specific function for NoRC in rDNA transcriptional repression on chromatin templates. In contrast, NoRC had no effect on DNA transcription. Transcription experiments were then performed with chromatin templates reconstituted from recombinant histones lacking individual histone tails. The results indicate that NoRC-mediated rDNA gene repression is dependent on the histone H4 tail, suggesting an involvement of chromatin remodeling. Further transcription experiments revealed that NoRC-mediated repression occurs prior to preinitiation complex formation and does not affect activated rDNA genes. NoRC stably associates with the silenced gene, and these early steps of rDNA repression do not depend on DNA and histone modifications (Strohner et al., 2004). NoRC showed preferred binding to a structured (bent) region within the mouse rDNA promoter. Methylation of a single CpG dinucleotide within this region abrogated rDNA transcription in chromatin (Santoro and Grummt, 2001), but did not influence DNA binding of NoRC. Furthermore, nucleosomal DNA is less methylated than free DNA, but chromatin remodeling enhances methylation. The results suggest an important role for the chromatin remodeling complex NoRC in the establishment of rDNA silencing. NoRC then contributes to maintenance of the silenced state throughout the cell cycle by interacting with DNA and histone modifying enzymes. Transcriptional repression by chromatin remodeling factors seems to be a common mechanism to stably inhibit gene expression.
