Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06 Archiv

ABCE1 ist ein Mitglied der ATP Binding Cassette (ABC) Superfamilie. ABC Proteine binden und hydrolysieren ATP und verändern dabei ihre Konformation. Dadurch können sie mechanochemische Arbeit leisten. Durch drei zusätzliche Domänen unterscheidet sich ABCE1 von allen bislang bekannten und charakterisierten Mitgliedern dieser Familie. Neben den ATP-bindenden Regionen enthält ABCE1 eine cysteinreiche, N-terminale Domäne, welche zwei Eisen-Schwefel-Cluster bindet. Diese Domäne hat hohe strukturelle Ähnlichkeit mit Ferredoxinen und ferredoxinähnlichen Strukturdomänen. Neuartig für ABC Proteine sind neben der Eisen-Schwefel-Cluster Domäne auch die Scharnierregion, die die ATP-bindenden Domänen verbindet und eine Helix-Loop-Helix Region.

This thesis is focused on the formation of highly ordered mesoporous structures with adjustable orientation within the ordered, vertical channels of anodic alumina membranes (AAMs) under the conditions of the ‘evaporation-induced self-assembly’ (EISA) method. It is shown that three of the most often used structure directing agents (CTAB, Pluronic123 and Brij56) can be employed for the synthesis of ordered silica mesophases embedded in AAM-channels. When using the ionic surfactant CTAB, the hexagonal mesostructures were solely oriented along the AAM-channels (columnar orientation). With the non-ionic surfactants the occurrence of two different orientations (circular or columnar) can be tuned via changing the surfactant concentration and the humidity in the adjacent gas phase. The existence of a previously postulated circular lamellar phase could be proven. In situ scattering experiments show that when ionic CTAB was used as structure directing agent, the columnar hexagonal structure was observed to form directly from the beginning. In the samples synthesized with the non-ionic surfactants, the circular hexagonal structure was found to form first and to directly transform into the columnar hexagonal, or a mixture of the columnar hexagonal and the curved lamellar phase. By correlation of the structure formation with the weight loss during the drying process of the samples it was demonstrated that the structure formation starts after the solvent evaporation. Therefore the absence of an evaporation induced solvent gradient within the AAM channels is postulated, and a homogeneous nucleation and phase formation irrespective of the height within the AAM channels is proposed. The synthesis of pure columnar mesostructures in confined space was achieved by salt addition and temperature control, even when non-ionic surfactants were used, thus leading to salt-induced phase transformations (SIPT) that have not been previously reported. In a collaborative project, single dye molecules were used as nanoscale probes to map out the structure of mesoporous silica channel systems that are prepared as thin films. The dye molecules act as beacons while they diffuse through different structural phases of the host. While measurement of ensemble diffusion provides information about the overall behaviour of the guest in a porous host, tracking of individual molecules provides insight into both the heterogeneity and the mechanistic details of molecular diffusion as well as into the structure of the host. The structure of the trajectories, the diffusivities and the orientation of single molecules are distinctive for molecules travelling in different mesophases. Transitions between the different types of surroundings can be observed for the same individual dye molecule. These experiments reveal unprecedented details of the structure of the host, its domains and the accessibility as well as the connectivity of the channel system.

Kupffer cells, the resident macrophages of the liver, play an important role in host defense and immune system. Moreover, they are also involved in several pathological conditions, like the hepatic ischemia/reperfusion injury. The transcription factor NF-kB is activated during this event. However, to date it was not possible to evaluate the consequence of this upregulation, as NF-kB possesses both detrimental and beneficial properties, regarding of the liver cell type affected. An activation in Kupffer cells is thought to lead to an increased inflammatory response. This hypothesis could not be proven in vivo, as a selective inhibition of NF-kB in Kupffer cells was not possible due to technical difficulties. In this work, solid nanoparticles made of gelatin were chosen to deliver NF-kB inhibiting decoy oligonucleotides exclusively to Kupffer cells in order to block the activation of NF-kB. Confocal scanning laser microscopy showed selective uptake of gelatin nanoparticles into the Kupffer cells without affecting hepatocytes. An increase in NF-kB binding activity during postischemic reperfusion could be diminished by the delivery of decoy oligonucleotides to the resident liver macrophages. In addition, a rise in TNF-alpha mRNA expression assessed by real time RT-PCR was also reduced, thus providing evidence for the effectiveness of this selective targeting. Thus, this work established a novel carrier for a specific Kupffer cell targeting.

Mutationen im Parkin-Gen sind verantwortlich für eine autosomal rezessiv vererbbare Form der Parkinson-Erkrankung. Der Funktionsverlust von Parkin spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit war lediglich bekannt, dass Parkin eine E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität besitzt und dass ein Funktionsverlust von Parkin offensichtlich zur Parkinson-Erkrankung führen kann. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei fundamentale Themenbereiche der Parkin-Forschung bearbeitet: 1. Die Analyse der Mechanismen der Inaktivierung von pathogenen Parkin-Mutanten. 2. Untersuchungen zur physiologischen Funktion von Parkin. Im ersten Teil dieser Arbeit konnten verschiedene Mechanismen der Parkin-Inaktivierung aufgeklärt werden, welche den Funktionsverlust von Parkin erklären. Pathogene C-terminale Deletionsmutationen führten zur Missfaltung und Aggregation von Parkin. Im Gegensatz zu Wildtyp-Parkin nahmen diese Mutanten spontan eine missgefaltete Konformation an und lagen in Form von zytosolischen Aggregaten vor. Pathogene Punktmutationen in der N-terminalen Ubiquitin-like (UBL)-Domäne verringerten die Stabilität von Parkin. Diese Mutanten wurden rasch über das Proteasom abgebaut. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnte ferner gezeigt werden, dass in vivo zusätzlich zu Volllängen-Parkin eine kleinere Parkin-Spezies entsteht. Diese kleinere Parkin-Spezies ist gekennzeichnet durch das Fehlen der N-terminalen UBL-Domäne und wird aufgrund des Vorhandenseins eines internen Startcodons an Position 80 der humanen Parkin-Sequenz gebildet. Der zweite Teil der Arbeit konzentrierte sich auf die physiologische Funktion von Parkin. In Zellkultur-Modellen konnte festgestellt werden, dass Parkin nach Stressbehandlung hochreguliert wird und vor Stress-induziertem Zelltod schützt. Die Analyse von protektiven Signaltransduktionswegen konnte erstmalig zeigen, dass die Parkin-mediierte Aktivierung der NF-kappaB-Signaltransduktion essentiell ist für das neuroprotektive Potential von Parkin. Die vorliegende Arbeit lieferte Evidenz dafür, dass die E3-Ubiquitin-Ligase Parkin die NF-kappaB-Signalkaskade durch eine vermehrte regulierende Ubiquitylierung der zwei Signalmoleküle, IKK und TRAF2 aktiviert. Die in dieser Doktorarbeit dargestellten Ergebnisse ermöglichen Einblicke in die physiologische Funktion von Parkin sowie die Mechanismen, die zum Funktionsverlust von Parkin führen. Darüber hinaus können diese neuen Erkenntnisse einen Beitrag leisten zum besseren Verständnis pathogener Mechanismen der Parkinson-Erkrankung.

Endothelial cell survival is indispensable to maintain endothelial integrity and initiate new vessel formation. We investigated the role of SHP-2 in proliferation, survival and sprouting of human microvascular- and umbilical vein endothelial cells (HMEC, HUVEC) using antisense oligonucleotides (AS-ODN) and a pharmacological SHP-2 inhibitor (PtpI IV). Knock-down of SHP-2 decreased bFGF and PDGF dependent endothelial cell proliferation (p

Polyglutaminerkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen mit fatalem Verlauf, die sich durch selektive neuronale Degeneration und die Bildung intrazellulärer Aggregate auszeichnen. Verursacht werden sie durch eine Expansion einer Polyglutaminsequenz in einem für die Erkrankung spezifischen Protein, die Fehlfaltung und Aggregation des entsprechenden Proteins bewirkt. Die Aggregation wirkt dabei neurotoxisch, wobei Toxizität hauptsächlich durch lösliche Intermediate des Aggregationsprozesses vermittelt wird. Zur Untersuchung der frühen Aggregationsphase und der späteren Elongationsphase wurden in dieser Arbeit verschiedene fluoreszenzbasierte Methoden etabliert. Mit Hilfe dieser Methoden konnte gezeigt werden, dass nach proteolytischer Spaltung von GST-Htt-Exon1 das Monomer eine Konformationsumlagerung durchmacht, die von einer Dimerisierung oder Oligomerisierung gefolgt wird. Dimere oder Oligomere bilden dabei eine kompakte Struktur aus. Wachstum der Fibrillen erfolgt durch Anlagerung von Monomeren oder einer anderen bisher nicht identifizierten Spezies. Durch Distanzmessungen innerhalb verschiedener Spezies konnte gezeigt werden, dass unlösliche Spezies eine kompakte Struktur aufweisen, die spezifisch für unlösliche Spezies ist. Lösliche Spezies liegen dagegen in einer expandierteren Konformation vor. Molekulare Chaperone üben oftmals eine protektive Funktion auf Neuronen in neurodegenerativen Erkrankungen aus. In dieser Arbeit wurde untersucht, inwieweit das eukaryontische Chaperonin TRiC, das in einem RNA-interference screen als potentieller Suppressor der Huntingtin-Aggregation identifiziert wurde, Aggregation modulieren kann. Gereinigtes TRiC hat keinen Einfluss auf die frühe Phase der Htt-Exon1-Aggregation, vielmehr inhibiert es die Elongation von fibrillären Strukturen, indem es mit Htt-Exon1-Oligomeren interagiert. Diese Interaktion ist transient und ATP-unabhängig. Im Gegensatz dazu interagiert TRiC in Kooperation mit dem Hsp70/40-System mit Htt-Exon1-Monomeren und verhindert die Nukleation der Aggregation. Stattdessen wird ein „gefaltetes“ Htt-Exon1-Produkt mit einer neuartigen Konformation gebildet, das löslich, nicht-fibrillär und nicht-toxisch ist und ~500 kDa-Oligomere ausbildet. Diese Interaktion ist kooperativ, sequentiell und benötigt ATP, ähnelt also der kooperativen Interaktion von TRiC und Hsp70/40 in der de novo-Proteinfaltung und stellt möglicherweise einen natürlichen Faltungsweg für Huntingtin dar.