Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06 Archiv

Das Gen des Selenoproteins PHGPx war in der Arbeitsgruppe im Verlaufe einer Expressionsklonierung als antiapoptotisches Gen für Burkitt-Lymphom-Zellen kloniert worden. Die Komplexität der kotranslationalen Inkorporation von Selenocystein, welches bei Selenoenzymen Teil des reaktiven Zentrums ist, limitiert die Überexpression und erschwert die funktionelle Analyse der Selenoproteine sowohl in vitro als auch in vivo. Die PHGPx und das ebenfalls Selenocystein-abhängige mitochondriale Thioredoxin/Thioredoxin-Reduktase-System sind bei der Detoxifikation von reaktiven Sauerstoffspezies beteiligt, die in der mitochondrialen Atmungskette erzeugt werden. Im Gegensatz zur PHGPx vermittelt die Thioredoxin- Reduktase ihre Schutzfunktion vor oxidativem Stress über Thioredoxin-abhängige Peroxidasen, die sogenannten Peroxiredoxine. Aufgrund einer möglichen Redundanz beider Systeme sollten beide Gene in Mäusen gezielt zerstört und bei Bedarf doppel-knock-out-Tiere erzeugt werden. Da das Fehlen der funktionellen, mitochondrialen Thioredoxin-Reduktase möglicherweise nicht mit dem Leben vereinbar ist, wurden Mäuse unter Verwendung des Cre/loxP-Rekombinationssystems etabliert, bei welchen das Gen zunächst aktiv ist. Die Inaktivierung der Thioredoxin-Reduktase 3 erfolgte durch Einkreuzen von transgenen Mäusen, die die Cre-Rekombinase in allen Geweben exprimieren. Die aus dieser Verpaarung abstammenden, heterozygoten knock-out-Mäuse zeigen keinen offensichtlichen Phänotyp. Erste Ergebnisse zeigen, dass homozygote TR3 knock-out-Mäuse wahrscheinlich embryonal oder perinatal letal sind. Bei der Inaktivierung des PHGPx-Gens in Mäusen wurden zwei Strategien verfolgt. Die lacZ knock-in-Strategie sollte ermöglichen, die Gewebeexpression der PHGPx zu studieren. Die konditionale knock-out-Strategie wurde parallel verfolgt, weil zu Beginn der Arbeit nicht abzusehen war, ob homozygote PHGPx knock-out-Mäuse lebensfähig sind oder ob Probleme mit der männlichen Fertilität zu erwarten sind. Schon lange war bekannt, dass die PHGPx im Hoden hoch exprimiert ist. Wie sich dann im Laufe dieser Arbeit herausstellte, handelte es sich bei dem konditionalen PHGPx knock-out ebenfalls um einen direkten knock-out. Durch die beabsichtigte konditionale knock-out-Strategie wurde ein Spermienkern-spezifisches, alternatives Exon des PHGPx-Gens zerstört. Diese neue Form der PHGPx wurde kloniert, das Hoden-spezifische Expressionsmuster und die Kernlokalisation des alternativenExons durch GFP-Fusionsproteine gezeigt. Geleitet von den in dieser Arbeit und von Ursini et al. (1999) beschriebenen neuen Funktionen der PHGPx in der Spermatogenese und den vergeblichen Versuchen, das veränderte PHGPx-Allel in Mäusen in die Keimbahn zu bekommen, wurden die Hoden und Spermien von den PHGPx- Chimären analysiert. Die Analyse der Chimären zeigte einen Phänotyp der partiellen Hodenatrophie und schweren Missbildungen der Spermien, der dem von Selendefizienten Nagetieren sehr ähnlich ist. Die bei diesen Chimären beobachtete Haploinsuffizienz führte zu der Entscheidung, die konditionale knock-out-Strategie für PHGPx zu ändern. Letztendlich gelang es, mit der neuen konditionalen knock-out- Strategie Keimbahntransmission zu erhalten. Dadurch wurde nicht nur das gesteckte Ziel, ein Maus knock-out-Modell für die PHGPx zu etablieren, erreicht, sondern es wurden viele zusätzlich wichtige neue Erkenntnisse über die Struktur und Funktion der PHGPx in der Spermienreifung gewonnen. Die Cre-vermittelte Inaktivierung des konditionalen PHGPx-Allels wird in Kürze erwartet.

Salmonellosen gehören weltweit zu den drei häufigsten registrierten, lebensmittelbedingten bakteriellen Darmerkrankungen. Dabei sind bestimmte S. enterica-Subspezies-I-Serovare an einen speziellen Wirt adaptiert, andere Serovare zeigen hingegen ein breites Wirtsspektrum. Der Krankheitsverlauf einer Salmonellose wird aber auch von der Spezies des infizierten Wir- tes bestimmt. Je nach infiziertem Wirt können beispielsweise milde bis akute Enterocolitis, aber auch schwere systemische Infektionen beobachtet werden. Um sich im Laufe ihrer Evolution optimal an ihre Wirte anzupassen, haben Salmonella spp. nach der Abspaltung vom kommensalen E. coli schrittweise neue Virulenzeigenschaften er- worben. Dies geschah vor allem über horizontalen Gentransfer (Ochman und Moran, 2001). Im ersten Schritt wurde die Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 (SPI1), später SPI2 erworben. Beide Inseln kodieren jeweils einen Typ-III-Translokationsapparat und dazu gehörende trans- lozierte Effektorproteine, welche die Wirtszellreaktionen zum Vorteil des Pathogens modulie- ren. Die Inseln sind zu unterschiedlichen Phasen der Salmonellosen aktiv. Das für die Wirts- zellinvasion verantwortliche Typ-III-Translokationssystem von SPI1 kann auch Effektoren in die Wirtszellen schleusen, die außerhalb der SPI1 kodiert sind. Der in SPI1 kodierte Translo- kationsapparat ist in Salmonella spp. hoch konserviert (Li et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der translozierten Effektorproteine bei der Evolu- tion von Salmonella spp. hin zu tierpathogenen Erregern untersucht. Es konnte gezeigt wer- den, daß die meisten SPI1-abhängig translozierten Effektoren (SipA, SipB, SipC, SptP, SopB, SopD und SopE2), ob innerhalb oder außerhalb von SPI1 kodiert, ebenfalls hoch konserviert vorliegen. Phylogenetische Analysen zeigten, daß diese konservierten Effektoren früh in der Salmonella-Entwicklung, nämlich zwischen 50 und 160 Millionen Jahren (im Zeitrahmen der SPI1-Aufnahme), akquiriert wurden. So handelt es sich hierbei um Faktoren mit einer basalen bzw. zentralen Virulenzfunktion, die Salmonella spp. von kommensalen Escherichia spp. unterscheiden. Es konnte gezeigt, daß die konservierten Effektorproteine SopE2 und SopB maßgeblich an der Wirtszellinvasion beteiligt sind (Mirold et al., 2001). Diese Invasion-vermittelnden Effek- toren sind weit entfernt von SPI1, in separaten chromosomalen Loci, kodiert. Diese Beobach- tung steht in gewissem Widerspruch zur klassischen Definition der Pathogenitätsinsel. Die invasionsrelevanten Effektoren SopB und SopE2 bilden zusammen mit dem SPI1- Translokationsapparat eine funktionelle Einheit (ein sogenanntes „Invasionsvirulon“), obwohl sie nicht -wie für Pathogenitätsinseln postuliert- auf demselben chromosomalen Element ko- diert sind. Zusammen mit den phylogenetischen Daten aus dieser Arbeit, deuten diese Ergeb- nisse daraufhin, daß der letzte gemeinsame Vorfahre aller heutigen Salmonella spp. bereits sämtliche für die Wirtszellinvasion benötigten Effektorproteine kodierte und daß die Modula- tion der Signaltransduktionswege in der Wirtszelle in S. bongori und in sämtlichen S. enteri- ca-Subspezies konserviert sind. Es wird vielmehr ein Translokationsmodul durch die SPI1 bereitgestellt, durch das sowohl konservierte als auch variabel vorkommende Effektorproteine in die Wirtszelle geschleust werden können. Es konnten jedoch auch Variationen festgestellt werden. Die beiden für die Effektorproteine SopE- und AvrA-kodierenden Gene sind variabel in der Salmonella-Population verteilt. AvrA ist am Rande der SPI1 kodiert und es wird vermutet, daß es nicht zum Kern der SPI1 gehört. Das variable SopE ist bei Zentisom 60 des Salmonella-Chromosoms, abgetrennt von SPI1 (Zentisom 63), kodiert. Das variable Effektorprotein SopE und wahrscheinlich auch AvrA tragen vermutlich als „Adaptationsproteine“ zur Feinmodulation der Wechselwirkung mit dem Wirt bei. Vermutlich existieren noch wesentlich mehr variable Effektorproteine, die zu dieser Feinanpassung beitragen. In dieser Arbeit wurde weiterhin der horizontale Transfer von sopE detailliert untersucht. SopE ist in Typhimurium auf SopEΦ, einem Bakteriophagen der P2-Familie, kodiert. SopE ist das erste Effektorproteingen, bei dem die horizontale Übertragung über den Mechanismus der lysogenen Konversion nachgewiesen werden konnte. Bisher war bei Salmonella spp. nur der Phagen-vermittelte horizontale Transfer durch Transduktion bekannt. Die spezifische Integra- tionsstelle von SopEΦ in das Salmonella-Chromosom wurde näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, daß SopEФ in der attL-Region eines bereits integrierten kryptischen Propha- gen (CP4-57) integriert ist, der seinerseits in ssrA, dem Gen für die kleine stabile tmRNS, integriert ist. Epidemiologische Untersuchungen wiesen zudem darauf hin, daß der Erwerb des sopE-Gens durch lysogene Konversion mit SopEФ einen selektiven Vorteil gegenüber sopE-negativen Typhimurium-Stämmen darstellen. SopE-tragende S. enterica-Subspezies-I-Serovar Typhi- murium-Stämme lösten in den siebziger und achtziger Jahren verstärkt Epidemien aus. Darü- berhinaus konnte gezeigt werden, daß SopEФ-Lysogene eine gesteigerte Virulenz aufweisen. Dies wurde sowohl in Zellkulturversuchen (diese Arbeit) als auch in Rinderinfektionsversu- chen (Zhang, zur Publikation eingereicht) experimentell nachgewiesen. Schließlich wurde in dieser Arbeit auf die Koevolution von Salmonella spp. und Virulenzfak- tor-tragenden Bakteriophagen untersucht. Es wurde festgestellt, daß die genetischen Mecha- nismen, welche den Modulaustausch zwischen Bakteriophagen vermitteln, auch dazu führen, die Flexibilität der Salmonella spp. bezüglich der Wirtsanpassung zu steigern. Dieser Mecha- nismus stellt möglicherweise für die Bakterien und damit auch für die assoziierten Bakteri- ophagen einen Selektionsvorteil dar. Es wurde beobachtet, daß der Virulenzfaktor SopE in einigen Serovaren der S. enterica-Subspezies-I nicht auf einem P2-ähnlichen sondern auf ei- nem lambdoiden Bakteriophagen kodiert ist. Es konnte demzufolge zum ersten Mal beobach- tet werden, daß ein Virulenz-vermittelndes Effektorproteingen in dem Genom zweier ver- schiedener Phagenfamilien kodiert ist und durch diese Phagen möglicherweise horizontal transferiert werden kann. Die ermittelten DNS-Sequenzen um sopE lassen vermuten, daß eine konservierte sopE-tragende Kassette (oder „Moron“) durch homologe Rekombination zwi- schen den zwei verschiedenen Bakteriophagenfamilien (P2- und lambdoid) transferiert wor- den ist. Diese Art des Transfers von Virulenzgen-Modulen zwischen verschiedenen Phagen- Familien erlaubt die flexible Neukombination von Phagen-kodierten Effektorproteinen. Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß variabel vorkommende translozierte Effektorpro- teine die Pathogen-Wirt-Beziehung optimieren können. Neukombinationen dieser Effektoren können über horizontalen Transfer hergestellt werden und somit die optimale Anpassung an die jeweiligen Wirte gewährleisten. Dabei spielt der horizontale Transfer von Virulenzgenen über konvertierende Bakteriophagen eine wesentliche Rolle. Günstige Kombinationen von variablen Effektorproteinen sind wahrscheinlich entscheidend an der Entstehung neuer Epi- demiestämme beteiligt. Die effizienten horizontalen Transfermechanismen zwischen ver- schiedenen Salmonella spp. als auch zwischen verschiedenen Phagenfamilien tragen so dazu bei, daß Salmonella spp. ein äußerst breites Spektrum von Wirten infizieren können und daß neue Epidemieklone mit höherer Frequenz entstehen können.

The study reported in the first part of this thesis utilized optical imaging of intrinsic signals to visualize changes in orientation maps in cat visual cortex induced by pairing a visual stimulus with an intracortical electrical stimulation. We found that the direction of plasticity within orientation maps depends critically on the relative timing between visual and electrical stimulation on a millisecond time scale: a shift in orientation preference towards the paired orientation was observed if the cortex was first visually and then electrically stimulated. In contrast, the cortical response to the paired orientation was diminished if the electrical preceded the visual cortical stimulation. Spike-time-dependent plasticity has been observed in single cell studies; however, our results demonstrate an analogous effect at the systems level in the live animal. Thus, timing-dependent plasticity needs to be incorporated into our conception of cortical map development. While the pairing paradigm induced pronounced shifts in orientation preference, the general setup of the orientation preference map remained unaltered. In order to unravel potential factors contributing to this overall stability, we determined the distribution of plasticity across the cortical surface. We found that pinwheel centers, points were domains of all orientation meet, exhibited less plasticity than other regions of the orientation map. The resistance of pinwheel centers to changes in orientation preference may support maintenance of the general structure of the orientation map. The study that forms the second part employs optical imaging to visualize the retinotopy in mouse visual cortex. We were able to resolve the pattern of retinotopic activity with high precision and reliability in the primary visual cortex (area 17). Functional imaging of the position, size and shape of area 17 corresponded exactly to the location of this area in stained histological sections. The imaged maps were also confirmed with electrophysiological recordings. The retinotopic structure of area 17 showed very low inter-animal variability, thus allowing averaging maps across animals and therefore statistical analysis. These averaged maps greatly facilitated the identification of at least four extrastriate visual areas. In addition, we detected decreases in the intrinsic signal below baseline with a shape and location reminiscent of lateral inhibition. This decrease of the intrinsic signal was shown to be correlated with a decrease in neuronal firing rate below baseline. Both studies were facilitated by the development of a signal analysis technique (part III), which improves the quality of optical imaging data. Intrinsic signal fluctuations originating from blood vessels were minimized based on their correlation with the actual superficial blood vessel pattern. These fluctuation components were then extracted from images obtained during sensory stimulation. This method increases the reproducibility of functional maps from cat, rat, and mouse visual cortex significantly and might also be applied to high resolution imaging using voltage sensitve dyes or functional magnetic resonance.

1. Aus chromosomaler DNA von A. woodii wurde durch heterologe Starteroligonukleotide ein Bereich des Flagellingens mittels PCR amplifiziert. Durch die Verwendung dieses DNA-Fragmentes als Sonde wurden weitere 6 kBp an chromosomaler DNA von A. woodii kloniert, sequenziert und analysiert. 2. Innerhalb dieses klonierten DNA-Abschnittes wurden zwei partielle und fünf vollständige offene Leserahmen lokalisiert, die jeweils über eine Shine-Dalgarno-Sequenz verfügten und größer als 300 Bp waren. Durch Sequenzvergleiche ließ sich das Flagellingen (fliC) identifizieren. Stromaufwärts von fliC wurden offene Leserahmen (flgL, flgK) gefunden, die für die Haken-assoziierten Proteine 1 und 3 des A. woodii-Flagellums kodieren, sowie ein Leserahmen (orfA) dessen abgeleitetes Produkt keine Ähnlichkeit keinem bekannten Protein ähnlich ist. Durch die Expression von orfA in Minizellen von E. coli DK6 wurde aber gezeigt, daß orfA für ein Protein kodiert. Stromabwärts vom Flagellingen wurden keine Flagellengene identifiziert. Die abgeleiteten Produkte, der hier lokalisierten ORFs orfB und orfC zeigten keine Ähnlichkeiten zu in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen. Am 3'-Ende des klonierten DNA-Abschnittes war ein partieller ORF (orfD) vorhanden, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz große Ähnlichkeiten zu dNTP-Zucker modifizierenden Enzymen aufwies. 3. Aus Sphäroplasten von A. woodii wurden durch Solubilisierung, differentielle Zentrifugation und eine CsCl-Dichtegradientenzentrifugation ganze Flagellen inklusive des Haken-Basalkörper- Komplexes gereinigt. Durch die Analyse der Präparation in der SDS-PAGE wurden neben dem Flagellin sechs weitere Proteine als Bestandteil der Flagellen identifiziert. 4. Durch die elektronenmikroskopische Analyse der Haken-Basalkörper-Komplexe der Na + -abhängigen Flagellen von A. woodii konnte gezeigt werden, daß diese aus einem Haken, Stab und einem MS-Ring aufgebaut sind. Unterhalb des MS-Rings waren weitere Strukturen vorhanden. Diese Struktur entspricht den aus den H + -abhängigen Flagellen der Gram-positiven Organismen bekannten Strukturen. Durch die Gefrierbruchmethode konnten in der Cytoplasmamembran von A. woodii im elektronenmikroskopischen Bild Partikelringe nachgewiesen werden. Diese entsprechen in Struktur und Größe den Mot-Komplexen der H + -abhängigen Flagellen aus E. coli.5. Zur Analyse der Untereinheitenzusammensetzung der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurden Antiseren gegen die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und β generiert. Hierzu wurden die Untereinheiten a, b, c  und β als MalE-Fusionen in E. coli produziert und gereinigt. Die Untereinheit c2/c3 wurde durch Chloroform:Methanol-Extraktion aus der Cytoplasmamembran von A. woodii angereichert und durch Elektroelution aus einer SDS-PAGE gereinigt. 6. Durch die Analyse der Cytoplasma- und Membranfraktion mit den fünf Antiseren ließen sich die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und ˜ in der Cytoplasmamembran nachweisen. 7. Die Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurde durch Blue-Native-PAGE aus der Membranfraktion isoliert. Durch die Auftrennung der ATPase in ihre Untereinheiten und deren aminoterminale Sequenzierung wurden die Untereinheiten a, b, c2/c3, α , β γ,δ und ε identifiziert. 8. Durch immunologische Methoden wurde die Untereinheit c1, das in F1FO-ATPasen einmalige 16-kDa-Proteolipid, als Untereinheit der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii erkannt. Die Na + -F1FO- ATPase von A. woodii ist die erste F1FO-ATPase mit einem Heterooligomer aus 8- und 16-kDa-Proteolipiden. 9. Die Untereinheit c1 wurde in A. woodii unabhängig vom Substrat und der Na + -Konzentration produziert. Allerdings wurden Hinweise auf eine erhöhte Expression des gesamten atp-Operons in Methanol-gezogenen-Zellen erhalten. 10. Ein Verfahren zur Reinigung der Na + -F1FO-ATPase unter Erhalt ihrer Untereinheitenstruktur wurde entwickelt. Die Na + -F1FO-ATPase wurde aus der Membranfraktion von A. woodii solubilisiert und durch Gelfiltration über Sephacryl S-400 und eine Glycerin-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Das gereinigte Enzym besaß alle neun Untereinheiten. Die spezifische Aktivität der gereinigten ATPase betrug 7 U mg Protein -1 und seine molekulare Masse 600 kDa.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen polaren Wachstums im phytopathogenen Basidiomycet Ustilago maydis. Zunächst wurde die zelluläre Rolle des t-SNAREs Yup1 analysiert. Ein temperatursensitiver Defekt im yup1-Gen hatte zu Störungen in der Zelltrennung und im polaren Wachstum von Sporidien geführt. Mutante Zellen bildeten dabei lange verzweigte Ketten aus verdickten Zellen. Die Lokalisation eines Yup1-GFPFusionsproteins auf beweglichen Organellen hatte zum Aufstellen eines spekulativen Modells geführt, bei dem Yup1 auf Endosomen die Fusion mit ankommenden endozytotischen Vesikeln vermittelt. Eine erstmalige Charakterisierung der Endozytose von U. maydis in dieser Arbeit zeigte, dass es sich bei den mit Yup1-GFP markierten, schnellen Organellen tatsächlich um frühe Endosomen handelte. Diese akkumulierten Zellzyklus-abhängig an Regionen aktiven Wachstums in BSDs. Die Akkumulation früher Endosomen im Apex von Hyphen war für das Spitzenwachstum erforderlich. In yup1ts-Zellen war bei restriktiver Temperatur eine gestörte Endozytose zu beobachten. Dieser Zusammenhang zwischen Zellmorphologie und polarer Sekretion einerseits und Endozytose andererseits deutete darauf hin, dass Membranrecycling über frühe Endosomen entscheidend am polaren Wachstum von U. maydis-Zellen im Speziellen und pilzlichen Hyphen im Allgemeinen mitwirkt. Mittels des Yup1-GFP-Fusionsproteins konnten die molekularen Grundlagen der beobachteten Bewegung von Endosomen untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass sich frühe Endosomen entlang von MT bewegen. Für diese Bewegung war in erster Linie das Kinesin Kin3 verantwortlich. Dieses Molekül ist ein neues Mitglied der Unc104/KIF1-Familie von Kinesin-ähnlichen molekularen Motoren und bewegt als solches vermutlich in Richtung der plus-Enden von MT. Gelfiltrationsexperimente legten nahe, dass Kin3 in der Zelle als Monomer vorliegt. Die N-terminale Motordomäne zeigte in vitro eine MTstimulierte ATPase Aktivität. Ein Kin3-GFP-Fusionsprotein lokalisierte in schnell beweglichen Flecken, die im Bewegungsverhalten den frühen Endosomen glichen. Ein Kin3-YFP-Fusionsprotein bewegte entlang von MT und kolokalisierte zudem mit einem Yup1-CFP-Fusionsprotein auf Endosomen. Die Deletion von kin3 führte zu einer starken Reduzierung der Endosomenbewegung. Die in vivo-Untersuchung der MT-Dynamik im Δkin3-Stamm ergab, dass der Großteil der Endosomen in Akkumulationen an den minus-Enden der MT konzentriert war. Entsprechend führte die Überexpression von kin3 zu einer verstärkten Konzentration der Endosomen an den plus-Enden von MT. Die Zellform einzelner Sporidien war im kin3-Deletionsstamm nicht verändert. Allerdings trennten sich die Zellen nach der Teilung wie in der yup1ts-Mutante nicht voneinander. Dieser Trennungsdefekt und ein verändertes Knospungsmuster führten zur Bildung von großen Baum-ähnlichen Zellaggregaten. Im Hyphenstadium führte die Deletion von kin3 außerdem zu einer deutlichen Störung des polaren Wachstums. Die nach Deletion von kin3 beobachtete Restbewegung der Endosomen beruhte fast ausschließlich auf der Aktivität des zytoplasmatischen Dyneins von U. maydis. Das konventionelle Kinesin von U. maydis, Kin2, zeigte ebenfalls einen Einfluss auf die Organisation und Position endosomaler Akkumulationen, obwohl es vermutlich nicht direkt am Transport einzelner Endosomen beteiligt ist. Die präsentierten Daten zeigen, dass Endosomen MT- und Zellzyklus-abhängig organisiert sind. Die Position der BSDs korrelierte dabei mit Funktionen der Endosomen bei der Zelltrennung, in der Bestimmung des Knospungsmusters und beim polaren Wachstum. Da die MT während des Knospenwachstums unipolar ausgerichtet sind, nutzt die U. maydis-Zelle das Wechselspiel des plus-Motors Kin3 und des minus-Motors Dynein, um die Endosomen Zellzyklus-abhängig an den plus- oder minus-Enden der MT zu akkumulieren.

Die vorliegende Arbeit stellt eine vergleichende –anatomische und physiologische- Untersuchung an der Netzhaut von Atheriniformes (Hornhechte, fliegende Fische, Halbschnäbler, Ährenfische, Zwischenkärpflinge, u. a.) dar. Ziel dieser Studie ist es, unter Berücksichtigung der verwandtschaftlichen Verhältnisse zu klären, inwieweit sich in Morphologie und spektraler Empfindlichkeit der äußeren Retina Anpassungen an die visuelle Umwelt zeigen. 13 Arten aus 8 Familien wurden licht- und elektronenmikroskopisch untersucht: Dermogenys pusillus, Hyporamphus affinis (Hemiramphidae); Parexocoetus mento (Exocoetidae); Belone belone, Tylosurus crocodylus, Xenentodon cancila (Belonidae); Scomberesox saurus (Scomberesocidae); Oryzias celebenensis (Oryziatidae); Ameca splendens (Goodeidae); Melanotaenia maccullochi, Glossolepis incisus (Melanotaeniidae); Atherina boyeri, Telmatherina ladigesi (Atherinidae). Die spektrale Empfindlichkeit der Photorezeptoren wurde bei D. pusillus, B. belone, M. maccullochi, A. boyeri und T. ladigesi mikrospektrophotometrisch, bei M. maccullochi außerdem histochemisch (NBT-Färbung) untersucht. Der Retinaaufbau entspricht bei allen untersuchten Vertretern der für diurnale Teleostier typischen Duplexretina. Bezüglich der morphologischen Befunde und spektralen Ergebnisse lassen sich zwischen den einzelnen Familien und mitunter sogar Arten z. T. deutliche Unterschiede feststellen. Dabei treten innerhalb eines Auges häufig regionale Unterschiede auf. Allerdings weisen bestimmte Gruppen auch gemeinsame Merkmale auf. So stellen neben den bei allen untersuchten Vertretern vorkommenden gleichen und ungleichen Doppelzapfen, bei den Belonidae und Scomberesocidae lediglich lange Einzelzapfen ein regelmäßiges Musterelement dar. Die übrigen Vertreter besitzen dagegen, zumindest in bestimmten Regionen, zusätzlich kurze Einzelzapfen. Melanotaenia weist mittlere Einzelzapfen an Stelle der kurzen und langen Einzelzapfen auf. Bei den meisten Arten lassen sich sporadisch bis lokal häufig, vermehrt in der ventralen Region, sowohl lineare als auch trianguläre Dreifachzapfen beobachten, bei A. splendens sogar Vierfachzapfen. Charakteristisch für die Atherinifomes ist ein vitreo-skleraler Dichtegradient der Ellipsoid-Mitochondrien, aus dem bei einigen Vertretern Riesenmitochondrien am skleralen Ellipsoidende resultieren. Melanotaenia und Oryzias besitzen an der Ellipsoidspitze ellipsosomenähnliche Körper, Ameca dagegen echte Ellipsosomen, die möglicherweise eine Synapomorphie der Cyprinodontoidea darstellen und durch selektive Filterung vermutlich der Kontrastverstärkung dienen. Während die Stäbchenanordnung bei den Ährenfischartigen keinerlei Regelmäßigkeiten aufweist, bilden die Zapfen im helladaptierten Zustand hochgeordnete Muster aus, die mitunter bis in die Synapsenregion verfolgt werden können. Reine und verdrehte Reihenmuster, sowie Viereckmuster kommen bei nahezu allen Vertretern vor, pentagonale Muster dagegen nur sporadisch. Einen bis dato in dieser Form einmaligen Mustertyp stellt das hexagonale Muster in der dorsalen Retina von B. belone dar, der möglicherweise eine Anpassung an das Sehen bei niedrigeren Lichtintensitäten darstellt. Reine und verdrehte Reihenmuster sowie Viereckmuster stehen häufig in direktem Zusammenhang mit lokalen Doppelzapfendichtemaxima. Solche Dichtehöchstwerte finden sich in der Regel in Retinaregionen, die Sehreize aus den Hauptblickrichtungen verarbeiten. Diese sind bei den Atheriniformes zumeist nach anterior, anterior-dorsad, anterio-ventrad, sowie dorso-temporad gerichtet. Die funktionelle Bedeutung von Dichtemaxima, Zapfenmuster und Zapfenverhältnissen wird unter Berücksichtigung der Lebensgewohnheiten des jeweiligen Vertreters in Zusammenhang mit den photischen Bedingungen seines Lebensraumes diskutiert. Während das λmax der Stäbchen mit Wellenlängen um 506nm relativ konstant erscheint, erstreckt sich die spektrale Empfindlichkeit der Zapfen bei den Atheriniformes von 369nm (UV) bis 576nm (rot). Dabei weisen A. boyeri (blau/grün) ein dichromatisches und T. ladigesi (UV/blau/grün), D. pusillus (UV/grün/rot) sowie B. belone (blau/brün/rot) ein trichromatisches Sehen auf. Das Zapfenpigmentrepertoire von M. maccullochi bietet die Voraussetzung für tetrachromatisches Sehen (UV/violett, blau, grün, rot). Verschiedene Opsinfamilien bei Melanotaenia und Dermogenys zeigen Polymorphismus. Hinweise auf ein Rhodopsin/Porphyropsingemisch, dessen Verhältnis innerhalb der Retina variiert, finden sich bei Telmatherina. Die zahlreichen unterschiedlichen spektralen Empfindlichkeiten lassen sich als Anpassung an die spektralen Eigenschaften des Lebensraumes, die intraspezifische Kommunikation oder den Nahrungserwerb deuten. Dabei spielen der violette und ultraviolette Bereich des Spektrums unter Umständen eine besondere Rolle als „geheime Wellenlängen“ im Rahmen der innerartlichen Verständigung. Vermutlich dient UV-Empfindlichkeit auch der Kontrastverstärkung und erleichtert somit die Beutedetektion. Als gemeinsames Merkmal, das den Atherinoidei und Cyprinodontoidei fehlt, besitzen die Exocoetoidei pigmentierte Strukturen im Augenbinnenraum, die wahrscheinlich modifizierte Processus falciformis darstellen. Während die fliegenden Fische und Halbschnäbler lediglich pigmentierte Zapfen in der Augenkammer aufweisen, zeigen Scomberesox und vor allem die Belonidae ein horizontales intraokulares Septum, das möglicherweise der Streulichtabsorption und als Blendschutz dient. Die Ergebnisse insgesamt machen deutlich, dass bei den Atheriniformes neben hochkonservierten Merkmalen auch abgeleitete Retinamerkmale zu beobachten sind, deren Ausprägungen einem starken evolutiven Wandel unterliegen. Sie stellen die Voraussetzung für die zahlreichen, vom Grundplan der Ordnung abweichenden Anpassungen an die im jeweiligen Mikrohabitat vorherrschenden Lichtbedingungen sowie an verhaltensökologische Gegebenheiten dar.

The aim of this study was to characterize the role of Rev-interacting cellular proteins in controlling the function of Rev in the host cell. The HIV-1 protein Rev plays an essential role in the temporal regulation of the virus gene expression by stimulating the expression of viral structural proteins. Rev enhances the nucleocytoplasmic transport and the translation of unspliced and single spliced viral mRNAs by binding with high affinity to a specific target element on the HIV-RNA. It was assumed that interaction with cellular factors is essential for Rev function. At the onset of this study, only a few potential cofactors were known with no clearly defined functional relevance. So we decided to search for new Rev-interacting factors using the yeast two-hybrid system. In this work a new Rev-interacting protein has been identified, by screening a Jurkat T cell cDNA library. The protein was termed Risp (Rev-interacting shuttle protein), because it shuttles between the nuclear and the cytoplasmic compartments. The Risp gene is widely expressed in human cells and conserved among various species, most probably as part of a larger gene. High amino acid homology (99%) with the C-terminal part of a large brain cDNA clone for KIAA0592 protein has been found, whereas no obvious homology to proteins with known function was observed. However, a weak and partial similarity appeared with several RNA-/DNA-binding and shuttle proteins. This might indicate that the Risp protein - or the larger protein containing it - could be a member of a new family of nucleocytoplasmic shuttle proteins with RNA-/DNA-binding function. Next, the intracellular localization and shuttling of Risp was investigated. In HeLa cells Risp- GFP localized in both nuclear and cytoplasmic compartments, but clearly accumulated in the cytoplasm, indicating the presence of a strong nuclear export signal (NES). The identification of a NES sequence was confirmed by deletion analysis of Risp and by nuclear microinjection of BSA-fusion proteins conjugated to peptides from the C-terminal part of Risp. Treatment with leptomycin B, a drug which has been shown to specifically block Crm1 (exportin) mediated export, resulted in nuclear accumulation of Risp-GFP, showing that the nuclear export of Risp, like that of Rev, is Crm1-dependent. Using bioinformatic tools able to detect weak homologies with high specificity, sequence comparisons between Risp and all currently known Rev interacting factors were performed. This analysis for the first time revealed a common motif shared between Rev and Rev-interacting cellular factors, termed RIP. The region of Risp harboring the RIP motif was neither essential nor sufficient for the Rev-binding in the yeast two hybrid system, suggesting no direct correlation between RIP and the Rev-binding ability. Preliminary experiments suggested, that Risp, as a Rev-interacting protein, is able to inhibit Revtrans- activation, while Risp does not interfere with Tat in a Tat-trans-activation assay. The overexpression of Risp-GFP reduced the production of the Rev-dependent structural viral protein p24gag up to 70%. In addition a previously unrecognized sequence motif in the activation domain of Rev with intrinsic nuclear import activity was found and tested in transfection and microinjection assays. This motif (“PPXXR”) is conserved in various RNA-binding proteins and was proposed to mediate nuclear translocation of the cellular functional homologue of HIV-1 Rev Sam68.

This work comprises detailed studies by scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM), fluorescence staining combined with confocal laser scanning microscopy (CLSM), as well as serial sectioning analyses and reconstruction techniques to elucidate the development of the larval and adult musculature of several basal representatives of the molluscan classes Polyplacophora, Bivalvia, Scaphopoda, and Gastropoda. Special reference is given to the shell musculature. In addition, aspects of the myo-anatomy of adult Solenogastres are reconsidered. A further part of this study deals with scaphopod shell morphogenesis and expression of the homeobox gene engrailed (en), in order to gain insights regarding the scaphopod-bivalve relationship. The results enable far reaching conclusions regarding the evolution and the phylogeny of the Mollusca. Solenogastres TEM analysis of adult Solenogastres revealed a mesenchymate body wall musculature which consists of outer ring, intermediate diagonal, and inner longitudinal muscles and resembles the condition of other worm-shaped taxa. The ventrally inter-crossing dorso-ventral musculature, which is diagnostic for the Mollusca, is arranged in multiple serial units along the anterior-posterior body axis. Polyplacophora During development, the chiton larva undergoes an intermediate stage in which the dorso-ventral musculature is serially arranged as in adult Solenogastres. The concentration into seven (and later eight) functional shell plate muscle units is a secondary condition which takes place after metamorphosis. Thus, assumptions of a primarily "segmented" (i.e. annelidlike) character of the polyplacophoran shell plate musculature are rejected. In addition, the anterior (i.e. pre-trochal) body region of chiton larvae shows a muscular grid which is lost at metamorphosis and resembles the body wall musculature of adult aplacophoran (Solenogastres + Caudofoveata) molluscs. Both, the multiple seriality of the dorso-ventral muscles and the apical muscle grid are regarded as ontogenetic recapitulation of the basal molluscan condition which is fully expressed in the adult body plan of Solenogastres. This infers a non-segmented, worm-shaped ancestor at the base of molluscan evolution. The existence of a larval ring-shaped muscle that underlies the prototroch cells (prototroch muscle ring) is a shared feature of polyplacophoran, gastropod, and bivalve larvae (see below) and suprataxic homology of this organ is proposed. Bivalvia Besides a rather complicated set of larval retractor muscles, the veligers of autobranchs (i.e. all Bivalvia except the Protobranchia, the latter with a test-cell larva) exhibit a distinct prototroch muscle ring similar to chitons and gastropods. Both systems are entirely larval and are resorbed during metamorphosis. Scaphopoda The general ontogeny and especially myogenesis in the dentaliid scaphopod Antalis entalis proceeds much more direct than in polyplacophorans or gastropods. Accordingly, distinct larval muscle systems are lacking. However, the paired cephalic and pedal retractors both form additional fibers which project into the region of the prototroch and are lost at metamorphosis. The existence of a distinct, paired cephalic retractor system, which is also found in the basal gastropod and cephalopod bauplan but not in the Bivalvia, suggests a clade comprising the Scaphopoda and Gastropoda + Cephalopoda. This is strengthened by expression data of the homeobox gene engrailed, which plays a significant role in molluscan shell formation. While two dorso-lateral centers of engrailed expression, which correspond to the two centers of initial shell calcification, are found in early bivalve veligers, engrailed is exclusively found in mantle margin cells surrounding the single anlage of the embryonic scaphopod shell. In contrast to bivalves, the scaphopod shell is thus formed from a single center of calcification, and a scaphopod-bivalve sistergroup relationship is therefore rejected. Gastropoda Primitive gastropods, such as the patellogastropods Patella vulgata and Patella caerulea, show one pair of asymmetrically positioned larval retractor muscles which have distinct insertion sites at the embryonic shell. Another strict larval muscle system is the prototrochal muscle ring. All these muscle are lost before, during, or shortly after metamorphosis. Parts of the adult mantle musculature as well as the muscles of the cephalic tentacles are formed prior to metamorphosis, while the buccal musculature is of entire postmetamorphic origin. The process of gastropod ontogenetic torsion is mainly caused by muscular activity of the larval retractors, while the adult shell musculature arises after the completion of torsion. Thus, ontogenetic torsion is regarded as an entirely larval process inferring that the arrangement of the adult shell musculature - which can often be reconstructed by muscle scars on fossilized shells - is not indicative for the question whether paleozoic univalved molluscs were torted or not.

Die vorliegende Arbeit stellt eine Charakterisierung der im Jahr 1995 von Wissenschaftlern der Firma Abbott Diagnostics (North Chicago, USA) entdeckten flaviähnlichen, im Tamarinen vorkommenden GB-Viren, GBV-A und GBV-B, sowie des humanen GB-Virus-C dar. GBV-A und GBV-B sind beide im sogenannten “GB-Agens H205”, das als Referenzmaterial dient, vorhanden. GBV-A und GBV-B wurden isoliert und charakterisiert. Da GBV-A im Gehirngewebe in höheren Konzentrationen als GBV-B vorhanden war, gelang die Isolierung von GBV-A durch eine Tamarinpassage mit verdünntem inokuliertem Gehirnmaterial. GBV-B wurde durch Tamarinpassage des Serums eines Affen, der nach Ausheilen der GBV-A-Infektion noch GBV-B-RNA positiv war, in reiner Form gewonnen. In Re- und Kreuzinfektionsstudien mit Tamarinen konnte eine homologe Immunität gegen den gleichen Erreger, aber das Fehlen einer Kreuzimmunität gegen den anderen Erreger gezeigt werden. Die Untersuchung von histologischen Schnitten der Organe infizierter Krallenaffen mit Hilfe der in situ-Hybridisierung gab Aufschluß über den Ort der Replikation dieser Viren. GBV-B ist der Erreger einer Hepatitis bei Krallenaffen und war mit einer für dieses Virus spezifischen Sonde durch Hybridisierung im Zytoplasma von Hepatozyten nachzuweisen. Mit einer für GBV-A spezifischen Sonde wurde dieses Virus nur in Gehirngewebe nachgewiesen. Für das humane GBV-C wurde der Lymphknoten, genauer das Zytoplasma der Lymphozyten, als Replikationsort ermittelt. Eine Leberpathogenität dieses Virus konnte nicht gefunden werden. Klinische Studien könnten eine Assoziation von GBV-C mit Erkrankungen des lymphatischen Systems untersuchen. Entsprechend der Lokalisation des Hybridisierungssignals im Bereich der Lymphknotenrinde (überwiegend B-Lymphozyten) konnten, nach Auftrennung von PBMCs mit Hilfe des MACS-Systems in einzelne Zellfraktionen, die B-Lymphozyten als hauptsächlicher Replikationsort wahrscheinlich gemacht werden. Weitere Hinweise auf die Replikation von GBV-C in Lymphozyten lieferte die in vitro-Infektion von PBMCs durch GBV-C mit einem anschließend beobachteten Anstieg der GBV-C-Konzentration im Kulturüberstand. In knochenmarktransplantierten Patienten wurde durch weitgehende Zerstörung des Knochenmarks ein Absinken der GBV-C-Konzentration gezeigt. Nach der Regeneration des lymphatischen Systems wurde häufig die ursprüngliche GBV-C-Konzentration wieder erreicht. Auch dieses Ergebnis läßt sich durch die Replikation von GBV-C in Zellen des lymphatischen Systems erklären. Zur Bestimmung der Prävalenz von GBV-C wurde ein Enzymimmuntest zum Nachweis von E2-Antikörpern mit rekombinanten Virusproteinen und monoklonalen Antikörpern gegen dieses Virus entwickelt. Ein 39 As langes Peptid im C-Terminus eines C-terminal verkürzten E2-Proteins war die antikörperbindende Domäne des monoklonalen Antikörpers. Für GBV-C hatten Hämophile, Homosexuelle und Prostituierte ein erhöhtes Infektionsrisiko. Deshalb ist neben dem parenteralen Übertragungsweg auch die sexuelle Übertragung des Virus bedeutend. Für eine sexuelle Übertragung des Virus spricht, daß bei Homosexuellen das Vorhandensein von Antikörpern gegen GBV-C mit der Anamnese einer durchgemachten Syphilis oder Gonorrhoe korreliert. Normalerweise führt die Produktion von E2-Antikörpern zu einer Elimination von GBV-C und einem Ausheilen der Infektion.

The fungus Ustilago maydis is the causative agent of corn smut disease. Prerequisite for successful infection is the fusion of two compatible haploid sporidia and formation of a dikaryon. This process is controlled by the two mating type loci a and b. The a-locus encodes a biallelic pheromone/pheromone receptor system which is responsible for cell-cell recognition and fusion of the sporidia. The subsequent pathogenic development is controlled by the multiallelic b-locus, encoding two homeodomain proteins, bW and bE. After fusion of haploid sporidia, bW and bE proteins from different alleles can form heterodimers, triggering downstream cascades of regulatory processes. These control filamentous growth, penetration of the plant surface, growth inside the plant and induction of galls. The aim of this work was the isolation of genes regulated by the bW/bE heterodimer that play a role during early pathogenic development. For this U. maydis strains were constructed in which bW and bE genes from different alleles can be turned on and off in a regulated fashion. These strains were used in a non-radioactive RNA-fingerprint analysis to identify differences in the transcriptome in response to the formation of the bW/bE heterodimer. The screen covered more than half of all genes transcribed in U. maydis, and 348 amplicons appeared to originate from differentially expressed genes. Further analysis of 48 chosen amplicons led to the identification of 12 previously unknown b-regulated genes. Of those, 7 are upregulated, 5 are downregulated. Therefore the bW/bE heterodimer is a central regulator, triggering a vast change in the transcriptome. For one of the upregulated genes, frb52 encoding a DNA polymerase X homolog, direct regulation by the bW/bE heterodimer could be shown. Deletion of this gene has no effect on mating and pathogenicity, providing no hint as to the role of the protein in these processes. Another upregulated gene encodes a MAP kinase homolog, named Kpp6. Kpp6 has an unusual amino terminal extension of 150 amino acids that exhibits no similarity to any known protein sequence and has no apparent function. kpp6 is not only induced after b-induction, but also shows a different shorter transcript in response to pheromone. Present data indicate that both transcripts encode for the same polypeptide. Deletion of kpp6 leads to a greatly reduced pathogenicity. In infections of corn plants with deletion mutants, no anthocyanin production of the plant is visible, an early defense reaction normally seen in infections with wild-type cells. Therefore Kpp6 has a crucial role in the early infection process and mediates most likely the communication between fungus and plant. Analysis of three of the downregulated genes led to the identification of a cluster of six genes (the cab locus) that are upregulated during phereomone stimulation and shut off after successful cell fusion. Unlike all the other genes known to be upregulated upon pheromone response, this regulation is independent of the transcription factor Prf1. The regulatory role of Prf1 seems to be restricted to the mating type genes, prf1 itself, and genes necessary for pheromone processing or transport. The expression of the cab locus genes is negatively regulated by the pheromone MAP kinase cascade and positively regulated by the cAMP signalling cascade. This antagonistic control points to a differential interaction between the two signalling modules and the processes regulated by the bW/bE heterodimer during different stages of the early infection process.

Die Überproduktion des Myc-Proteins ist eine Ursache für die Entstehung einer großen Anzahl von humanen Tumoren. Die Erforschung der Myc-Funktionen ist daher ein wichtiges Ziel der Tumorbiologie. Mit einem neuartigen Zellsystem wurde in dieser Arbeit die Rolle von Myc für das Wachstum von Zellen untersucht. Das Zellsystem P493-6 ist eine B-Zellinie, in der die myc-Expression durch ein Tetrazyklin-Vektorsystem regulierbar ist und das erste menschliche Zellsystem, in dem Myc konditional untersucht werden konnte. Diese Linie exprimiert kein endogenes myc, so daß Myc-Funktionen nur von der Expression des exogenen, konditionalen Myc abhängen. Der Zusatz von Tetrazyklin (Tc) im Kulturmedium bewirkt die Repression von myc und den Zellzyklusarrest. Durch Auswaschen von Tc kann myc wieder induziert werden und die Zellen treten wieder in die Zellzyklusprogression ein. In früheren Arbeiten wurde in dieser Zellinie bereits der Einfluß von Myc auf die Zellzyklusregulation untersucht (Pajic et al. 2000). Diese Untersuchungen wurden in dieser Arbeit erweitert, mit Augenmerk auf die Myc- Funktion im Zellwachstum. Myc löste in P493-6 keine Apoptose aus, wenn dem Kultivierungsmedium Serum entzogen wurde. Myc konnte bei Serum-Entzug nicht den Eintritt in die DNA-Synthesephase induzieren. Stattdessen wurden Myc-Funktionen im Zellwachstum beobachtet. Myc steigerte bei Serum-Entzug die Proteinsynthese, die Aktivität von Stoffwechselenzymen und bewirkte so die Zunahme an Zellmasse und -Größe. Zum ersten Mal wurde damit gezeigt, daß Myc-Expression Zellwachstum induziert, ohne daß die Aktivierung des Zellzyklus erfolgen muß. Zellwachstum kann also durch Myc über einen eigenen, Zellzyklus-unabhängigen Weg reguliert werden. Diese Ergebnisse wurden durch andere Arbeiten über Maus- und Drosophila-Myc bestätigt. Da Myc als Transkriptionsfaktor beschrieben wurde, wurden in der vorliegenden Arbeit neue Myc-regulierte Gene mit modernen Array- und Genchip-Analysen identifiziert. Insgesamt konnten 108 Gene identifiziert werden, die neue Kandidatengene für direkte Regulation durch Myc sind. Viele dieser Gene sind am Ablauf von Stoffwechselwegen beteiligt, wie Aminosäure- und Proteinsynthese, Lipid-Metabolismus, Proteinfaltung und –umsatz, Nukleotid- und DNA-Synthese, Transport, Nukleolus-Funktion, Transkription, Spleissen und oxidativem Stress, was die Beobachtungen der Zellwachstumsregulation bestätigt. Die Identifikation von Myc-Zielgenen, die an der Signaltransduktion beteiligt sind, war eine neue Beobachtung. Neben Komponenten der Signaltransduktion wurden auch Wachstumsfaktoren-, und Wachstumsfaktorrezeptoren als Myc-Zielgene identifiziert. Damit ist Myc an der Regulation von autokrinen und parakrinen Stimulierungs-Signalwegen beteiligt, die die Proliferation entscheidend beeinflussen. Die Ergebnisse des Genexpressionsprofils ist außerdem von Bedeutung für das Verständnis der Zellzyklusaktivierung in B-Zellen.