Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 14/19 Archiv

Ziel: 1)Etablierung einer immortalisierten hMSC-Zelllinie durch lentivirale hTERT-Transduktion. 2)Untersuchung der biologischen Effekt einer lentiviralen Transduktion von hTERT auf hMSCs. 3)Aufklärung des Transformationspotenyials von hTERT-transduzierten hMSCs. Material und Methoden: hMSCs wurden mit Lentiviren, die hTERT enthieten, transduziert. Konale hMSCs-hTERT wurden durch Isolation einzelner Zellen gewonnen. Die Expression von hTERT wurde mittels RT-PCR bestätigt. Die Zellproliferation wurde durch morphologische Beobachtung und Berechnung der “population doubling level”(PDL) und “population doubling time”(PDT) überwacht. Die Verhinderung der Seneszenz durch hTERT-Transduktion wurde durch Seneszenz-assoziierte β-gal-Färbung bestätigt. Dabei dienten nicht-transduziert hMSCs als Kontrollen. Der Stammzellcharakter von hMSC-hTERT wurde durch adipogene, chondrogene und osteogene Differenzierung überprüft. Zur Untersuchung der potenziellen tumorösen Transformation von lentiviral transduzierten hMSCs wurden Karyotypisierung und FISH-Analyse durchgeführt. Des Weiteren wurde der zeitliche Verlauf der Tumorsuppressor-Gene-Expression von RB1,TP53 und p21 untersucht, ein in vitro Softagar-Assay und in vivo Nacktmäusen Klonale und heterogene hMSCs-hTERT implantiert. Ergebnisse: hTERT wurde erfolgreich in hMSCs transduziert und “single-cell-picking”-Klone(SCP) konnten etabliert werden. In der RT-PCR wurde die hTERT-Expression bestätigt. Nicht-transduzierte hMSCs zeigten keine hTERT-Expression. Sowohl klonale, als auch heterogene hTERT-transduzierte hMSCs konnten über mehr als 500 Tage Kultiviert werden, während nicht-transduzierte hMSCs nach weniger als 250 Tagen seneszent wurden. Drei Phasen des Wachstums mit unterschiedlichen PDL und PDT konnten in hMSCs-hTERT beobachtet werden. Die Zellmorphologie der hMSCs-hTERT veränderte sich von einem gemischten Phänotyp in der “initialen Phase”(PDT 2,3 bis 5,5, PDL 20,7 bis 27,1) zu einem vermehrten Auftreten von flachen Zellen in der “Plateau-Phase” (PDT 9,2 bis 22,1, PDL 30,6 bis 48,2). Dies war ganz im zeitlichen Einklang mit dem Alterungsprozess von nicht transduzierten hMSCs. In der letzten und andauernden Phase zeigte sich eine hohe Anzahl von schnell wachsenden, kleinen und spindelförmigen Zellen (PDT von 2,1 bis 6,1, PDL 53,7 bis 105,6), welche aus einem Selbstselecktionierungsprozess in einer kontinuierlichen in-vitro Kultur hervorgegangen waren. Die erhaltene Differenzieungs-Kapazität der hTERT-transduzierten hMSCs wurde sowohl für klonale als auch heterogene hMSCs-hTERT durch eine positive Adipogenese-spezifische Oil-red-O-Färbung, Chondrogenese-spezifische Toluidinblau-Färbung und Osteogenese-spezifische von-Kossa-Färbung bestätigt. Zur Untersuchung einer potentiellen malignen Transformation der hMSCs-hTERT wurde eine Karyotyp-Analyse durchgeführt, die keine Auffälligkeiten zeigte. Darüber hinaus konnte eine unveränderte RB1, TP53 und p21 Tumorsuppressor-Gen-Expression nachgewiesen werden. Als Hinweis auf eine erhaltene Kontaktinhibition zeigten sich im Softagar-Assay keine Kolonien. Nach subkutaner Implantation der Zellen im Nacktmaus-Modell zeigte sich histologisch in vivo keine Tumorformation. Fazit: Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass eine lentivirale Transduktion von hMSCs mit hTERT eine effiziente und relative sichere Methode zur Erzeugung immortalisierter hMSCs ist. Obwohl es notwedig ist die Differenzierungskapazität und onkogene Potenzial für einen noch längeren Zeitraum zu untersuchen, konnte nach mehr als 500 tage in Zellkultur nachgewiesen werden, dass klonal expandierte lentivital hTERT-transduzierte hMSCs eine viel versprechende Zelllinie für die Forschung, aber möglicherweise auch für therapeutische Anwendungen zum Beispiel im Bereich “Tissue engineering” sein könnte.

Learning complex movement sequences requires an active, attentional selection of the content that is learned. The selection mechanism can not be investigated in classical stimulus-guided sequence learning paradigms because it requires a movement sequence production that is not triggered by external stimuli. In deferred imitation learning the whole stimulus sequence is presented and reproduction is started only after the presentation has ended. In order to investigate how the selective control of the learning process proceeds in natural learning situations and to investigate all influencing parameters we developed a new paradigm in which long sequences were learned by deferred imitation learning. In this task a long sequence of stimuli was presented on a graphic tablet and reproduced by manual pointing after the stimulus presentation was finished. Since the sequence exceeded the capacity of working memory because of its length it had to be reproduced and learned in several trials. Therefore, an attentional selection was required during learning. In our first study a method for evaluating reproduction performance in the new learning paradigm was developed. The assignment of reproductions to target positions posed a major methodological difficulty. This problem was solved by introducing an assignment algorithm that takes the order of reproduction into account. The algorithm was explained, it was further compared to an algorithm that performs a nearest neighbor assignment and finally validated by a comparison to a human operator assignment. The results showed that the assignment algorithm is an appropriate method for analyzing long sequences of pointing movements and is suitable for evaluating reproduction performance and learning progress in deferred imitation learning of long sequences. In the second study we investigated further how long sequences of pointing movements are acquired. Long-term retention tests showed that the sequences were retained for at least two weeks in long-term memory. A transfer test showed that the sequences were represented in an effector independent representation. The distributions of pointing positions were analyzed in detail in order to characterize the control signal of the pointing movements. The analysis showed that position errors to successive target positions were not dependent on the movement direction and further, that directional error did not propagate to reproductions of successive target positions. These results suggest that end points rather than movement trajectories are memorized in this learning task. Our third study evaluated the organization and reorganization of the sequence representation in memory. The change in sequence reproduction without intermediate presentations showed that the remembered target positions drifted away from the initial representation, where the target drift saturated after about 5 trials. The analysis of the drift direction of representations of single target positions showed that there was no systematic drift direction for single subjects. Further it indicated that the representation did not drift to similar, but to different patterns across subjects. In order to investigate whether sequences are encoded in chunks or as single target positions we performed an experiment in which two target positions in a well learned sequence were exchanged. We analyzed the effect of the target exchange on target positions neighboring the exchanged target position. The target exchange effected neither the position nor the variance of neighboring memorized target positions. These results support the view that single target positions rather than chunks of target positions are memorized. Thus our study suggests that the sequence acquisition is guided by an active selection process which is able to quickly acquire abstract movement plans. Our findings further support the view that these movement plans are represented as strings of independent, absolute target positions.

Among the long-term unemployed, health limitations are often a hindrance to successful reintegration in the jobmarket. This quasi-experimental controlled study examines the effects of a health promotion intervention program, combining individual sessions based on Motivational Interviewing and participatory group sessions including physical activity. Over a period of three months, the participants of the intervention group (n=179) showed more improvement compared to the control group (n=108) in terms of motivation for lifestyle changes towards more physical activity and more healthy nutrition. In terms of smoking and alcohol, no significant intervention effects were detected. The results of the study show the effectiveness of the described health promotion program regarding a lifestyle change towards more healthy nutrition and more physical activity.