Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19 Archiv

GPx4 besitzt vielfältige Funktionen im Redox-Metabolismus von Zellen. Ursprünglich wurde sie als ein Enzym beschrieben, das hoch effizient Phospholipidhydroperoxide zu den entsprechenden Alkoholen unter GSH-Verbrauch reduzieren kann. Weiterhin hatte sich in den letzten 10 bis 15 Jahren gezeigt, dass sie eine essenzielle Rolle als Thiolperoxidase in der Spermienreifung ausübt. Eine weitere Funktion stellt möglicherweise die eines Redox-Sensors dar, der auf die Änderung des zellulären Redox-Milieus mit der Aktivierung von antioxidativen Zellsignalwegen reagiert. Diese Funktion konnte bislang nur für das GPx4-Homolog in der Hefe nachgewiesen werden und kann aufgrund der Rolle, die die GPx4 bei der Spermienreifung in Mäusen spielt, auch für Säugetiere postuliert werden. Es handelt sich dabei um die Fähigkeit der GPx4 in ihrer Funktion als Thiolperoxidase Disulfid- oder auch Selenylsulfidbindungen zwischen anderen Proteinen zu bilden. Dabei ist die GPx4 vermutlich auch in der Lage, ihre eigenen Cysteine als Substrat zu akzeptieren, was allerdings im Falle der Spermienreifung zu einer Inaktivierung der peroxidativen Funktion führt. Diese Thiolperoxidasefunktion ist abhängig von der Menge an freiem GSH. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war es, mögliche Interaktionspartner in somatischen Zellen zu identifizieren, wobei die Thiolperoxidasefunktion der GPx4 bei Änderung des zellulären Redox-Milieus in Form von oxidativem Stress ausgenutzt werden sollte. Als Methode wählten wir ein modifiziertes Tandem-Affinity-Purification-enhanced-Verfahren (TAPe). Mit Hilfe dessen wurde eine mit einem Strep/Flag-Tag versehene GPx4 oder verschiedene Mutanten stabil in induzierbaren GPx4 Knockout murinen embryonalen Fibroblasten exprimiert, sodass die getaggte GPx4 mittels des TAPe Verfahren aus den Zellen aufgereinigt werden konnte. Um intrazelluläre GSH-Konzentrationen zu reduzieren und die GPx4 zu oxidieren, wurden die Zellen vor der Lyse mit BSO und tBOOH vorbehandelt. Die Eluate aus diesen Aufreinigungen wurden anschließend anhand der Massenspektrometrie, Silberfärbung und Western Blots analysiert. Es ließen sich eine ganze Reihe von Proteinen identifizieren, die ebenfalls eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung des intrazellulären Redox-Milieus spielen und an der Regulierung von Zellsignalwegen beteiligt sind. Nach den bisherigen Analysen bedarf es aber noch einer Bestätigung mittels co-Immunpräzipitation und Immunoblot-Analysen. Besonders aktuelle Erkenntnisse, die neue Zelltodsignalwege, wie zum Beispiel die Ferroptose, analysieren, stellen eine interessante und äußerst relevante Richtung für zukünftige Projekte in der Erforschung der GPx4 und ihrer Rolle als Redox-Sensor und Regulator von Zelltodsignalwegen dar.

Gestationsdiabetes mellitus (GDM) ist eine erstmalig in der Schwangerschaft aufgetretene oder diagnostizierte Glukosetoleranzstörung, die 3-8% aller Schwangerschaften betrifft (Metzger et al. 1998). Pathophysiologisch besteht eine große Ähnlichkeit zwischen GDM und Diabetes mellitus Typ 2, die genauen Mechanismen sind aber noch nicht bekannt (Metzger et al. 2007). Die Diagnose eines GDM bringt für Mutter und Kind verschiedene akute und langfristige Komplikationen mit sich. Veränderungen in der Plazenta mit ihren wichtigen metabolischen, endokrinen und immunologischen Funktionen während der Schwangerschaft (Gätje et al. 2011; Gude et al. 2004), könnten dabei eine wichtige Rolle spielen. Ziel dieser Studie war es daher, Expressionsveränderungen verschiedener wichtiger Rezeptoren, darunter nicht-steroidale Kernrezeptoren, wie der Vitamin D-Rezeptor (VDR), Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARγ) sowie die Estrogen-Rezeptoren α und β (ERα und β)und Human leukocyte antigen-G (HLA-G), in der Plazenta bei GDM zu untersuchen, um dadurch die pathophysiologischen Vorgänge in der Plazenta bei GDM besser verstehen zu können. Für diese Studie wurden die Plazenten von 40 Patientinnen mit GDM und von 40 gesunden Frauen verwendet. Beide Gruppen enthielten jeweils 20 Plazenten von männlichen Feten und 20 von weiblichen. Zunächst wurde die Expression der einzelnen Rezeptoren mittels immunhistochemischen Färbungen untersucht. Signifikante Unterschiede in der Expression einzelner Rezeptoren wurden mit Hilfe weiterer Methoden, wie Doppelimmunfluoreszenz, qRT-PCR, Zellkultur oder rt-MSP bestätigt. In unserer Studie konnten wir zeigen, dass bei GDM eine gesteigerte Expression von VDR vorliegt. Im Gegensatz zum VDR fanden wir eine Inhibition der PPARγ-Expression bei GDM. Mit Hilfe unserer in vitro-Versuche konnten wir zusätzlich die konzentrationsabhängige Regulation der Expression von VDR und PPARγ durch ihre Liganden belegen. Bei GDM lag weiterhin eine erhöhte Expression von ERα vor. Zudem konnten wir zeigen, dass der ERα-Promotor in GDM-Plazenten demethyliert vorliegt. GDM positive Plazenten wiesen zudem eine verminderte Expression von ERβ und HLA-G auf. Abschließend konnten wir für den VDR und ERβ geschlechtsspezifische Unterschiede in der Kontrollgruppe identifizieren: Die Plazenten männlicher Feten exprimierten mehr VDR bzw. ERβ als die der weiblichen. Die besonders ausgeprägten Expressionsveränderungen im EVT an der maternalen-fetalen Grenzzone könnten dafür sprechen, dass diese Teil der Regulation der Immunantwort und der Insulinresistenz in GDM-Plazenten sind. Weiterhin scheinen die Expressionsveränderungen einiger Rezeptoren eine Folge der bei GDM veränderten Konzentrationen bzw. Zusammensetzung der Liganden zu sein. Unsere Studie liefert wichtige Vorkenntnisse, um mit Hilfe klinischer Studien die allgemeinen Empfehlungen zur Nahrungszusammensetzung und Supplementation in der Schwangerschaft zu klären.

Eine effektive Regulation der Gewebedurchblutung erfordert eine Koordination der Reaktion einzelner Gefäßzellen bzw. verschiedener Gefäßabschnitte. Der zur Koordination erforderliche interzelluläre Signalaustausch kann zumindest teilweise über Gap Junction-Kanäle erfolgen, die als interzelluläre Verbindungen den Austausch von elektrischen und chemischen Signalstoffen zwischen benachbarten Zellen ermöglichen. Dieser Austausch kann über die Modulation der Permeabilität von Gap Junction-Kanälen reguliert werden. Aus Untersuchungen an Modellzellen (HeLA-Zellen) war bereits bekannt dass NO eine solche Modulatorwirkung ausübt, wenn die Gap Junctions nur Connexin 37 (Cx37) enthalten während kein Effekt von NO auf Gap Junctions zu beobachtet war, wenn Gap Junctions aus Cx43 oder Cx40 gebildet wurden. Da Endothelzellen normalerweise alle drei Connexine exprimieren, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, inwieweit NO in diesen Zellen überhaupt eine nachweisbare Wirkung auf die Gap Junction Permeabilität und damit auf den Signalaustausch entfaltet. Als Modell des Signalaustauschs wurde die Ausbreitung von Calciumwellen jeweils zwischen Endothelzellen oder glatten Muskelzellen allein oder zwischen beiden Zelltypen untersucht. Nach Auslösung von interzellulären Calciumwellen als Folge einer mechanischen Stimulation von einzelnen Zellen konnte zunächst gezeigt werden, dass die interzelluläre Ausbreitung von Calcium unter den gewählten Versuchsbedingungen über Gap Junctions-erfolgte. Im Gegensatz zum Modellsystem der HeLa Zellen, in denen nur Cx37 exprimiert war, zeigte NO in den Endothelzellen (humane Nabelschnur, alle drei Connexine exprimiert) abgesehen von einer geringradigen Verzögerung keinen Hemmeffekt auf die Gap Junction-abhängige Ausbreitung von Calcium-Signalen. Wurde jedoch Cx43 durch Behandlung mit siRNA herunterreguliert, führte NO auch in den Endothelzellen zu einer Hemmung der interzellulären Calciumwellenausbreitung. Auch in intakten Endothelzellen, die mit glatten Muskelzellen kokultiviert wurden, ließ sich bei genauerer Analyse ein Hemmeffekt von NO nachweisen. Dieser war jedoch auf die Zellbereiche beschränkt, in denen Endothelzellen und glatte Muskelzellen unmittelbar benachbart waren (myoendotheliale Junctions). In diesen myoendo-thelialen Gap Junctions, fanden wir auf der Endothelseite immunhistochemisch überwiegend Cx37 exprimiert. Aufgrund dieser präferentiellen Lokalisation von Cx37 scheint daher NO eine besondere Rolle bei der Modulation des Calciumaustauschs (und potentiell auch anderer Signalmoleküle wie IP3 oder cyclische Nukleotide) zu spielen. Die Kontrolle des Calciumaustauschs könnte funktionell eine calciumabhängige glattmuskuläre Kontraktion bei Endothelstimulation verhindern und somit die endothelabhängige Dilatation verstärken. Diese bisher unbekannte NO-Wirkung auf Cx37-exprimierende Gap Junctions könnte einen weiteren Mechanismus der Gefäßtonusregulation darstellen.

Fragestellung: Das Ovarialkarzinom ist die fünfthäufigste Krebserkrankung bei Frauen. Trotz radikaler chirurgischer Interventionen und nachfolgender Chemotherapie beträgt das Fünfjahresüberleben nur 42%. Die anhaltend schlechte Prognose macht die Suche nach Zielmolekülen im Sinne einer „targeted therapy“ zur Erweiterung des Behandlungsspektrums nötig. Diese Arbeit soll neue Erkenntnisse über die Expression acht verschiedener Rezeptoren der Kernrezeptorsuperfamilie (THRα2, THRα1, THRα1/2, THRβ, THRβ1, RXRα, PPARγ und VitDR) im Ovarialkarzinom bringen und Aussagen zu ihrem prognostischen Stellenwert ermöglichen. Patienten und Methoden: Das untersuchte Kollektiv besteht aus Patientinnen, die an unserer Klinik zwischen 1990 und 2002 aufgrund eines Ovarialkarzinoms operiert wurden. Die Gewebeproben wurden nach den gängigen Methoden der Immunhistochemie bearbeitet, die Färbungen mittels IRS-Score bewertet und mit SPSS statistisch ausgewertet. Ergebnisse: Alle von uns untersuchten Rezeptoren werden im Ovarialkarzinom exprimiert und zeigen zusätzlich zu ihrem nukleären Vorkommen eine Koexpression im Zytoplasma. Speziell PPARγ und THRβ1 kommen überwiegend extranukleär vor. Die Analyse der Rezeptorexpression nach histopathologischen Subtypen ergab eine Spezifität von THRβ1 für klarzellige Ovarialtumore. THRα1/2 ist in allen Subtypen außer dem muzinösen exprimiert. Bei Tumorprogression erlischt die Expression mehrerer Rezeptoren: Mit Verschlechterung des Gradings kommt es zum Verlust von THRα2 in serösen Ovarialkarzinomen und tendenziell auch im Gesamtkollektiv. Beim serösen Ovarialkarzinom wirkt sich dies verkürzend auf das Überleben aus. Auch die Expression des THRβ1 in klarzelligen Tumoren und des VitDR in serösen Karzinomen sinkt signifikant mit der Verschlechterung des Gradings. In fortgeschrittenen FIGO-Tumorstadien verlieren die Karzinome außerdem ihre THRβ1 Rezeptoren, sowie seröse Tumoren tendenziell ihre THRα1/2 Rezeptoren. Zusammenfassung 4 THRβ erfährt als einziger Rezeptor eine Expressionszunahme bei Tumorprogression und ist im Stadium III der FIGO-Klassifikation deutlich überexprimiert. Die zytoplasmatische Expression von THRα2, THRβ und VitDR scheint zudem die Mortalität zu erhöhen. Außerdem zeigt sich eine lange Reihe an Rezeptorkorrelationen. Diskussion: Im Zuge der Entdifferenzierung des Gewebes zeigte sich für mehrere Rezeptoren (THRα2, THRα1/2 und THRβ1) ein intranukleärer Expressionsverlust. Die intranukleäre und zytoplasmatische Expression der von uns untersuchten Rezeptoren korreliert dabei umgekehrt proportional miteinander (Ausnahme VitDR). Eine persistierende intranukleäre THRα2-Expression ermöglich zumindest im serösen Ovarialkarzinom ein längeres Überleben, während die zytoplasmatische Expression von THRα2, THRβ und VitDR im Gesamtkollektiv hochsignifikant das Mortalitätsrisiko steigert. Diese Translokation im Rahmen der Tumorprogression könnte evtl. durch einen Enzündungsprozess oder durch eine Schilddrüsenstörung ausgelöst sein. Weitere Untersuchungen mit Vergleich der Rezeptorexpression im gesunden Ovarialgeweben und simultaner Messung von Schilddrüsenhormonen und Entzündungsparametern sind ausstehend. Die intranukleäre Expression von THRβ hingegen nimmt bei Tumorprogression zu. Sein Stellenwert in der Kanzerogenese des Ovarialkarzinoms ist genau wie seine Bedeutung in der Krebsentstehung anderer Tumore noch nicht geklärt. RXRα, PPARγ und THRα1 scheinen im Ovarialkarzinom eine untergeordnete Rolle zu haben.