Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19 Archiv

Der Gestationsdiabetes (GDM) ist definiert, als eine erstmals in der Schwangerschaft aufgetretene mittels Nüchternblutzucker oder mit einem standardisierten 75g oralen Glukosetoleranztest (oGTT) diagnostizierte Glukosetoleranzstörung. Der GDM gehört zu den häufigsten Schwangerschaftskomplikationen in Deutschland. Mitbedingt durch bessere Screeninguntersuchungen und strengere Diagnosekriterien, hat seine Inzidenz in den letzten Jahren stetig zugenommen. Da aktuelle Studien zeigen, dass bereits gering erhöhte Blutzuckerwerte in der Schwangerschaft mit einer Zunahme sowohl an maternalen als auch an kindlichen Komplikationen einhergehen, wurden die Diagnosekriterien modifiziert und im Jahr 2011 in einer neuen Leitlinie publiziert. Erstmals existiert nun eine gute Evidenzbasis zur Diagnose und Therapie des GDM. Ziel dieser Arbeit war es, in einer retrospektiven Analyse die Effektivität der aktuellen Therapie des Gestationsdiabetes anhand der Behandlungsergebnisse am Diabeteszentrum der LMU München, zu erfassen. Die Ergebnisse wurden mit den Daten aktueller internationaler Studien (ACHOIS, MFMU, HAPO) verglichen. Die Studie umfasste 297 Gestationsdiabetikerinnen (GDM-Kollektiv), die im Zeitraum vom 01.01.2008 bis 30.06.2011 im Diabeteszentrum der Medizinischen Klinik Innenstadt der LMU München betreut wurden. Davon entbanden 167 Patientinnen (LMU-Kollektiv) ihre Kinder in der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe der LMU München. Von diesen konnten zusätzliche perinatale Daten erhoben werden. Als Vergleichskollektiv (n = 8773) wurden alle Frauen erfasst, die im selben Zeitraum ebenfalls an der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe der LMU München entbanden. Der Vergleich der Baseline-Charakteristika der Frauen mit GDM und des Vergleichskollektivs bestätigte vor allem den präkonzeptionellen BMI als Risikofaktor für GDM. Diagnostik und Therapiebeginn erfolgte bei den Patientinnen mit Insulintherapie signifikant früher, als bei den Frauen mit rein diätetischer Therapie. Die Patientinnen im Insulin-Kollektiv wiesen signifikant höhere Nüchtern- und 1-h Werte im 75-g oGTT auf. Nach den alten Diagnosekriterien wären 55,5 % der Patientinnen im LMU-Kollektiv nicht als GDM diagnostiziert worden. Mitbedingt durch die neuen Kriterien kam es zu einem Anstieg der Inzidenz um 50%. Die Rate an mütterlichen und kindlichen Komplikationen war insgesamt gering. Im GDM-Kollektiv fand sich trotz Therapie ein höherer LGA-Anteil (Geburtsgewicht > 90. Perzentile) als im Vergleichskollektiv (14,5% vs. 5,3%), welcher höher lag, als in aktuell publizierten Interventionsstudien. Die Raten von SGA (Geburtsgewicht < 10. Perzentile), primärer und sekundärer Sectio caesarea waren im GDM-Kollektiv nicht erhöht. Um zu klären, weshalb es trotz strenger Therapievorgaben zu einer erhöhten LGA-Rate nach GDM kommen konnte, erfolgte eine Unterteilung des GDM-Kollektivs nach dem Geburtsgewicht (≤ 90. vs. > 90. Perzentile). Als einziger signifikanter Unterschied zeigte sich der Zeitpunkt der Diagnosestellung des GDM. Entsprechend lag der LGA-Anteil bei Diagnosestellung ≤ 28. SSW mit 5,6% auf dem Niveau des Vergleichskollektivs. Die an unserem Zentrum praktizierte, nach den Leitlinien der DDG orientierte GDM-Therapie, bewirkte eine sehr niedrige mütterliche und kindliche Komplikationsrate. Bei rechtzeitiger Diagnosestellung lag die LGA-Rate auf dem Niveau des Vergleichskollektivs und ist mit den Ergebnissen aktueller Interventionsstudien durchaus vergleichbar. Unsere Daten unterstreichen noch einmal die Bedeutung eines generellen GDM-Screenings bei allen Frauen. Parallel zur Therapie des GDM sollte in enger Zusammenarbeit mit den betreuenden Gynäkologen eine sonografische Kontrolle des fetalen Wachstums erfolgen um Therapieanpassungen entsprechend der Entwicklung des Kindes durchführen zu können.

Ziel dieser Arbeit: Renale Anämie ist eine der Hauptursachen für eine erhöhte Morbidität sowie geringere Lebenssqualität bei Patienten, die an chronischen Nierenerkrankungen leiden. Zur Behandlung der renalen Anämie werden gentechnologisch hergestellte Erythropoese-stimulierende Faktoren (Biologicals) eingesetzt, wobei biosimilare Antianämika in Europa seit 2007 auf dem Markt zugelassen sind. Bzgl. der pharmakologischen Äquivalenz biosimilarer Erythropoese-stimulierender Substanzen (ESAs) mit den originären ESAs gibt es in medizinischen Fachkreisen immer wieder Diskussionen. Da die Gabe Erythropoese-stimulierender Substanzen zu hohen wirtschaftlichen Belastungen für das Gesundheitssystem führt, haben Kostenträger im Bereich der Biologicals ein besonders großes Interesse an einer wirtschaftlichen Arzneimittelversorgung. Die Ziele dieser pharmakoepidemiologischen Beobachtungsstudie und der vorliegenden Dissertation sind deshalb (1) die Analyse des Arzneimittelverbrauchs – gemessen in defined daily doses (DDD) - von unterschiedlichen ESAs (Erstanbieterpräparate vs. Biosimilars, kurzwirksames vs. langwirksames Erythropoetin) in verschiedenen Nutzerkohorten chronisch nierenkranker Patienten mit renaler Anämie und eine Abschätzung ihrer Äquivalenz (Vergleich auf Äquivalenz). (2) die Berechnung Erythropoetin-bedingter Behandlungskosten von Original- und Biosimilarprodukten in unterschiedlichen Nutzerkohorten („Comparative Cost Efficiency“, Budget Impact Analyse). Methodik: Die Daten sind Behandlungs- und Apothekenabrechnungsdaten der Kassenärztlichen Vereinigung Bayerns aus der ambulanten vertragsärztlichen Versorgung im Beobachtungszeitraum 01. Januar 2008 bis 31. Dezember 2010. Eingeschlossen werden Patienten mit chronischer Nierenerkrankung und renaler Anämie, die über den Beobachtungszeitraum mit ESAs therapiert werden (ATC- Code B03XA). Hinsichtlich des Krankheitsstadiums wird zwischen präterminaler Niereninsuffizienz (KOHORTE PRÄDIALYSE) bzw. terminaler, dialysepflichtiger Niereninsuffizienz (KOHORTE DIALYSE) differenziert. Für die Äquivalenz-Analyse werden nur Patienten eingeschlossen, die über einen Zeitraum von mindestens sechs zusammenhängenden Quartalen kontinuierlich ESAs erhalten. Definierte Tagesdosen (DDD) und tatsächlich verordnete Tagesdosen (prescribed daily doses, PDD) dienen der Analyse des Arzneimittelverbrauchs. Apothekenbruttopreise (in Euro, €) werden für die ökonomische und die Budget Impact Analyse verwendet. Die Ergebnisdarstellung erfolgt aufgrund des Populationsbezugs mittels deskriptiver Statistiken. Ergebnisse: (1) In der KOHORTE PRÄDIALYSE (n = 8.799) werden 931 Patienten, in der KOHORTE DIALYSE (n = 16.895) 6.177 Patienten kontinuierlich über einen Zeitraum von ≥6 Quartalen mit ESAs therapiert. 64,4% der dialysepflichtigen Patienten erhalten Original-ESAs (= Erstanbieter-ESAs), 21,1% Biosimilar-ESAs und 14,6% Original- und Biosimilar-ESAs (%-Biosimilars an Gesamt: 35,7%). Der mediane DDD-Tagesverbrauch liegt bei 0,77 für kurzwirksames Original-Epoetin, bei 0,81 für langwirksames Darbepoetin alfa und bei 0,90 für M-PEG Epoetin beta. Der mediane DDD-Tagesverbrauch für kurzwirksames Biosimilar-Epoetin beläuft sich auf 0,82. Diese Ergebnisse werden durch eine Subgruppe von 1.886 Patienten (STABILE 12Q-KOHORTE) untermauert, die über einen kontinuierlichen Zeitraum von zwölf Quartalen mit kurzwirksamen Orignal-ESAs, langwirksamem Darbepoetin alfa und Biosimilar-ESAs behandelt werden. Der mediane DDD-Tagesverbrauch liegt dann entsprechend bei 0,80, 0,86 und 0,81. Nach einer Therapieumstellung von Original-ESA auf Biosimilar-ESA zeigt sich kein Mehrverbrauch. In der KOHORTE PRÄDIALYSE wird vorwiegend mit langwirksamem Darbepoetin alfa therapiert (47,7%). Der mediane DDD-Tagesverbrauch für kurzwirksame Original-ESAs, für langwirksames Darbepoetin alfa und für M-PEG Epoetin beta beläuft sich entsprechend auf 0,33, 0,49 und 0,54. (2) Unabhängig vom Krankheitsbild beträgt die Gesamtsumme der Arzneimittel-ausgaben für ESA-Erstanbieterprodukte und Biosimilars 132,6 Mio. € für den drei-jährigen Studienzeitraum. Die kumulierten definierten Tagesdosen belaufen sich in der KOHORTE DIALYSE auf 7.727.782,14 DDDs. Die durchschnittlichen DDD-Kosten betragen 10,79 € für Originale bzw. 8,56 € für Biosimilars. Eine Biosimilar-Substitutions-quote von 50% für diese Kohorte ergibt ein Einsparpotenzial von 6,14 Mio. € (Spannweite 3,07 – 9,22 Mio. € = 25-75%-Quote) für den Analysezeitraum 2008-2010. Schlussfolgerung: (1) Diese populationsbasierte Analyse zeigt einen ähnlichen Verbrauch an originären und biosimilaren Erythropoese-stimulierenden Substanzen für die KOHORTE DIALYSE. Für die KOHORTE PRÄDIALYSE quantifiziert diese Analyse einen mit 40-57% deutlich niedrigeren medianen DDD-Verbrauch für originäre ESAs als in der KOHORTE DIALYSE. (2) Eine weitreichende Verschreibung von Biosimilars bei chronisch nierenerkrankten Dialysepatienten mit renaler Anämie bietet ein nennenswertes wirtschaftliches Einsparpotenzial.

Die diabetische Nephropathie ist derzeit weltweit der häufigste Grund für die terminale Niereninsuffizienz mit einem Anteil von einem Drittel aller Fälle. Im Verlauf der diabetischen Nephropathie kommt es zu einer zunehmenden Glomerulosklerose. Die Fähigkeit der parietalen Epithelzelle zur Ausbildung von extrazellulärer Matrix und ein möglicher Beitrag zur Glomerulosklerose ist bislang unklar. Daher sollte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle bei der diabetischen Nephropathie vermehrt extrazelluläre Matrix bildet und dadurch die Bowman’sche Kapsel verdickt. Diese Frage wurde unter Verwendung einer immortalisierten murinen parietalen Epithelzelllinie und einer primären humanen parietalen Epithelzelllinie im Zellversuch und Stimulation dieser Zellen mit hoher Glukosekonzentration (30mM), TGF-β1 und „advanced glycation endproducts“ nachgegangen. Außerdem wurde retrospektiv die Bowman’sche Kapsel von sechs humanen Nierenbiopsien mit diabetischer Nephropathie per Licht- und Transmissionselektronen-mikroskopie untersucht. Im ersten Schritt war die Aktivierung der parietalen Epithelzelle unter diabetischer Kondition Fokus der experimentellen Untersuchung. Hier lag ein zellspezifischer Effekt vor. Während für die humanen parietalen Epithelzellen keine funktionellen oder morphologischen Zeichen der Aktivierung gefunden werden konnte, zeigten murine parietale Epithelzellen eine Aktivierung nach Stimulation mit TGF-β1. Der zweite Schritt bestand in der Untersuchung der Bildung von TGF-β1 in parietalen Epithelzellen. Auch hier konnten unterschiedliche Stimulationseffekte bei den murinen und humanen parietalen Epithelzellen beobachtet werden. Während die humanen parietalen Epithelzellen weder auf Transkriptions-, noch auf Translationsebene eine geänderte Expression zeigten, exprimierten die murinen parietalen Epithelzellen in einem positiven Feedback-Mechanismus auf Transkriptionsebene verstärkt TGF-β1 nach Stimulation mit TGF-β1. Auf Translationsebene konnte eine verstärkte Bildung von TGF-β1 nach Stimulation mit „advanced glycation endproducts“ und eine verminderte Bildung nach Stimulation mit Glukose beobachtet werden. Der dritte Schritt beinhaltete die Untersuchung der Kollagenbildung in den parietalen Epithelzellen und die Vermessung der Bowman’schen Kapsel. Während Glukose in keiner der Zelltypen zu einer Änderung der Kollagengenexpression führte, induzierte TGF-β1 in den humanen und murinen parietalen Epithelzellen eine Hochregulation der Genexpression verschiedener Ketten von Kollagen IV und Kollagen I α 1. „Advanced glycation endproducts“ verstärkten die Transkription der Kollagene in den humanen parietalen Epithelzellen, wohingegen sie diese in murinen parietalen Epithelzellen herunterregulierten. In der retrospektiven histologischen Untersuchung von sechs Patienten mit diabetischer Nephropathie und sechs Vergleichspatienten wurde per Licht- und Transmissionselektronenmikroskopie die Dicke der Bowman’schen Kapsel vermessen. In den lichtmikroskopischen Messungen zeigte sich für die Patienten mit diabetischer Nephropathie eine signifikant verdickte Bowman’schen Kapsel. Diese Verdickung konnte bei Patienten mit diabetischer Nephropathie in den transmissionselektronenmikroskopischen Messungen bestätigt werden. Letztlich ist die Lichtmikroskopie die geeignetere Messmethode, weil hier eine höhere Anzahl an Glomeruli gemessen werden kann und sie einen Selektionsbias ausschließt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die parietale Epithelzelle unter diabetischer Kondition verstärkt extrazelluläre Matrix bildet und diese basal ablagert. In den murinen parietalen Epithelzellen ergaben sich Hinweise auf den Mechanismus der Aktivierung und einen positiven Feedbackmechanismus von TGF-β1 bei der diabetischen Nephropathie. Die Verdickung der Bowman’schen Kapsel ist von klinischer und diagnostischer Bedeutung, da die Ausbildung der parietalen Fibrose viele Funktionen der parietalen Epithelzellen und Bowman’schen Kapsel einschränkt und der Glomerulus letztlich sklerosiert bzw. verödet. Diagnostisch werden künftige Studien den Wert der Dickenmessung der Bowman’schen Kapsel als zusätzliches pathologisches Kriterium der Stadieneinteilung der diabetischen Nephropathie zeigen.

The genus Legionella consists of environmental bacteria which are the causative agents of the severe pneumonia Legionnaires’ disease. L. longbeachae and L. pneumophila are able to replicate intracellularly in human alveolar macrophages and aquatic or soil amoebae. In order to replicate within host cells the bacteria establish a compartment derived from the endoplasmatic reticulum (ER) which is called “Legionella-containing vacuole” (LCV). A bacterial intracellular multiplication/defective in organelle transport (Icm/Dot) type IV secretion system (T4SS) is essential for the formation of this LCV. The Icm/Dot T4SS enables translocation of effector proteins into the host cell. More than 100 effector proteins are presumably translocated during an L. longbeachae infection whereas around 300 translocated effector proteins are known for L. pneumophila. During maturation the LCV communicates with vesicles from the endocytic vesicle trafficking pathway, avoids fusion with lysosomes and instead fuses with the ER. Phosphoinositides (PI) such as phosphatitdylinositol-4-phosphate (PtdIns(4)P) are enriched on the LCV which mediate the binding of Icm/Dot translocated effector proteins like SidCLpn (substrate of Icm/Dot transporter) as well as its paralogous protein SdcALpn. The 73 kDa effector SidM but not the 106 kDa SidCLpn was found in a previous phosphoinositide pulldown assay with L. pneumophila lysate to be the major PtdIns(4)P binding protein. Using L. longbeachae lysate we showed binding of the 111 kDa SidCLlo to PtdIns(4)P in a phosphoinositide pulldown. This result was confirmed by protein-lipid overlay assays using “PIP-strips”. In further analysis the P4C (PtdIns(4)P-binding of SidC) domain was identified as a 19 kDa domain of SidCLlo located in the amino acid region 609 to 782. This P4C domain was located in the same region as the 20 kDa SidCLpn_P4C domain of L. pneumophila. Both P4C domains can be used as LCV markers. This was shown with GST-tagged proteins binding to LCVs in a cell homogenate. The two P4C domains show a sequence identity of only 45% and the full-length protein of 40%. Circular dichroism measurements revealed that the secondary structure of the two proteins is similar. Moreover, isothermal titration calorimetric measurements indicated a 3.4 higher affinity of SidCLlo towards PtdIns(4)P compared with SidCLpn. In RAW 264.7 macrophages infected with L. longbeachae we showed that endogenous SidCLlo as well as heterologously produced SidCLpn is translocated to the LCV in an Icm/Dot-dependent manner. The deletion of the sidCLlo gene led to a reduced recruitment of calnexin to the LCV in infected Dictyostelium discoideum. This effect was complemented by adding plasmid-encoded SidCLlo, SidCLpn or SdcALpn. The same recruitment defect for a L. pneumophila strain lacking the sidCLpn and sdcALpn genes was complemented by the production of SidCLlo and SidCLpn as published before. Therefore, these effectors play a role for pathogen-host interactions by promoting the recruitment of ER to the LCV. L. longbeachae or L. pneumophila wild-type strains outcompeted their sidC deletion mutant in a competition assay in Acanthamoeba castellanii. However neither of the deletion mutants were impaired in their growth in single strain replication experiments. In summary despite of the small sequence identity and the higher binding affinity to PtdIns(4)P of SidCLlo compared to SidCLpn both effector proteins seem to have similar functions during an infection of Legionella. For the characterization of L. longbeachae-containing vacuoles through proteomic analysis, LCVs had to be isolated from infected D. discoideum or RAW 264.7 macrophages. Endogenous SidCLlo or heterologously produced SidCLpn were used as LCV markers for the isolation. Pathogen vacuoles harbouring L. longbeachae were isolated by immuno-affinity purification using antibodies specifically recognizing SidCLlo or SidCLpn. Future investigations aim at optimizing the LCV purification protocol for L. longbeachae to determine the proteome composition of the L. longbeachae-containing vacuole.

Prionerkrankungen gehören zu den neurodegenerativen Erkrankungen und können sowohl genetisch übertragen als auch erworben werden. Sie verlaufen bisher ausschließlich letal. Verursacht werden sie durch das PrPsc, die pathologische Isoform des physiologisch vorkommenden PrPc. Ein – teilweise noch kontroverser – Einfluss von Kupfer auf die Pathologie wurde mehrfach dargestellt. Bisherige Arbeiten haben diesen Einfluss jedoch insbesondere anhand der Bindung an die Oktarepeatregion untersucht; zunehmend wächst allerdings das Interesse an den Kupferbindungsstellen außerhalb dieser Region: unter anderem insbesondere am Histidin 95 (His95). Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig der Einfluss der Kupferbindung an der murinen Aminosäure Histidin 95 des Prionproteins (PrP) in vivo nach Infektion untersucht. Da die Erreger von Scrapie und CJD eine ähnlich Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur besitzen [51, 168], sind wahrscheinlich die Ergebnisse aus Tiermodellen - zumindest teilweise - auf das menschliche Prionprotein übertragbar. Zur Untersuchung wurden transgene Mäuse verwendet, die ein mutiertes PrP mit einem Aminosäure-Austausch von Histidin zu Glycin an der Position 95 des Prionproteins explizieren. Zur Abgrenzung des Einflusses der Mutation nach Infektion wurde vorab eine Charakterisierung der nicht infizierten Mäuse durchgeführt: Die Mäuse nach Mutation (H95G-Mäuse) sowie das mutierte Prionprotein (H95G- PrP) wurden vor Infektion ausführlich untersucht und mit Wildtypkontrollen verglichen. Immunhistochemisch, histologisch und klinisch zeigte sich vor Infektion kein Unterschied zwischen H95G-Mäusen und Wildtypmäusen. Anschließend erfolgten diese Untersuchungen bei RML-infizierten H95G- und Wildtypmäusen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal anhand von homozygoten HG95+/+-Mäusen mit Prnp-/- Hintergrund und Prnp+/+-129/Sv- C57/Bl6-Kontrollmäusen ein signifikanter Einfluss der Kupferbindungsstelle am Histidin 95 auf die Pathologie und das Überleben nach Prioninfektion gezeigt werden. Die Ergebnisse wurden bei den Mäusen nach Infektion zweiter Passage geprüft. Hierdurch konnte eine stabile, signifikant verkürzte Inkubationszeit bei den H95G- Mäusen im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen werden. Nach Infektion konnte weiterhin gezeigt werden, dass die H95G-Mäuse in fast allen beurteilten Hirnregionen reproduzierbar signifikant mehr plaqueartige PrPsc-Ablagerungen sowie reproduzierbar signifikant geringere spongiforme Veränderungen aufwiesen. Im Bereich des Kleinhirns zeigten sich signifikant deutlicher ausgeprägte, in den untersuchten Cortexbereichen signifikant geringer ausgeprägte synaptische PrPsc- Ablagerungen nach RML-Infektion, die teilweise reproduzierbar waren. Wahrscheinlich werden diese Ergebnisse beeinflusst durch den hier gezeigten veränderten Abbau des H95G- PrPsc, das im Gegensatz zum Wildtyp-PrPsc hauptsächlich über den a-Abbaumechanismus abgebaut wird, sowie den möglichen höheren Konzentrationen von H95G-PrPc.