Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19 Archiv

Für die erfolgreiche Befruchtung einer Eizelle ist die Calcium-regulierte Akrosomreaktion des Spermiums eine essentielle Voraussetzung. Sie bewirkt nicht nur die seit langem bekannte Freisetzung hydrolytischer Enzyme aus dem akrosomalen Vesikel zur Penetration der Eihülle (Zona pellucida), sondern legt auch das für die Spermien-Oozyten-Erkennung notwendige Izumo-Protein auf der Spermienoberfläche frei. Erst durch die nach Eizellkontakt induzierte großflächige Verschmelzung von äußerer akrosomaler Membran und der darüber liegenden Plasmamembran an hunderten von Fusionsstellen wird genügend Izumo-Protein auf der inneren akrosomalen Membran exponiert, um eine stabile Verbindung mit dem kürzlich auf der Eizelloberfläche identifizierten Interaktionspartner Juno zu gewährleisten. Welche Regulationsmechanismen der Koordination dieser multiplen Einzelfusionsereignisse bei der Akrosomreaktion zugrunde liegen, ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt. In Neuronen wird die Präzision der Calcium-regulierten Neurotransmitter-Exozytose durch die cytomatrix of the active zone (CAZ), einem Netzwerk aus SNARE-regulierenden Gerüstproteinen, koordiniert. Aufgrund der funktionellen Parallelen zwischen den Exozytoseprozessen in Neuronen und Spermien sollte in der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob in Spermien ein analoges, CAZ-ähnliches Proteinnetzwerk die sich Reißverschluss-artig ausbreitende, multiple Fusionsporenbildung der Akrosomreaktion kontrolliert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das RIM2α-Protein die Hauptisoform der RIM-Proteinfamilie in Säugerspermien darstellt, deren Vertreter seit einiger Zeit als molekulare Knotenpunkte des CAZ-Proteinnetzwerkes an der Präsynapse gelten. Neben RIM2 wurde auch für ubMunc13-2, das in dieser Arbeit als prädominanter Subtyp der Munc13-CAZ-Proteinfamilie in Spermien identifiziert wurde, sowie für die beiden riesigen Gerüstproteine Piccolo/Aczonin und Bassoon eine distinkte Lokalisation in der akrosomalen Region von Nagerspermien nachgewiesen. Des Weiteren konnte belegt werden, dass RIM2 und ubMunc13-2 an Detergens-resistente Membranmikrodomänen in Spermien assoziiert sind, die seit einiger Zeit für die Rekrutierung der SNARE-Fusionsmaschinerie in Spermien bekannt sind. Eine potentielle Netzwerk-bildende Funktion von RIM2 wurde in in vitro Bindungsstudien, die u. a. mit massenspektrometrischen Analysen kombiniert wurden, bestätigt. Dabei zeigte sich, dass RIM2α sowohl testikuläres ubMunc13-2 als auch die CAZ-Proteine RIM-BP3 und das erstmals in Reproduktionsgewebe nachgewiesene ELKS/ERC2 sowie einige Zytoskelett-assoziierte Proteine bindet. Die funktionelle Bedeutung eines CAZ-ähnlichen Netzwerkes für die Akrosomreaktion wurde in quantitativen Exozytose-Analysen an epididymalen Spermien verifiziert. Eine selektive Blockierung einzelner Domänen von RIM2, aber auch von ubMunc13-2 und Piccolo/Aczonin reduzierte die Calcium-induzierte akrosomale Exozytoserate um mindestens 45 %. Die Funktion der α Isoform des RIM2-Proteins konnte durch funktionelle Exozytosestudien an RIM2α-defizienten Spermien einer entsprechenden Gen-defizienten Mauslinie verifiziert werden. Interessanterweise führte eine Erhöhung der intrazellulären Calcium-Konzentration durch das Calcium-Ionophor A23187 zu keinem signifikanten Unterschied der Akrosomreaktion von RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien. Dieser Befund könnte möglicherweise auf eine kompensatorische Wirkung anderer, ebenfalls in Spermien exprimierter RIM1- und RIM2-Isoformen zurückzuführen sein. Allerdings wurde für die Akrosomreaktion nach Stimulation mit isolierter und solublisierter Zona pellucida in RIM2α-defizienten im Vergleich zu Wildtyp-Spermien eine signifikante Reduzierung der akrosomalen Exozytose-Induktion festgestellt. Da die Applikation eines Calcium-Ionophors die Signalkaskade umgeht, die unter physiologischen Bedingungen zum Calcium-Influx und damit zur Membranfusion führt, scheint das RIM2α-Protein Komponenten der Signalkaskade und/oder die Calcium-Kanäle für die Akrosomreaktion zu rekrutieren. Somit könnte es dazu beitragen die gerichtete, großflächige Fusionsporenbildung nach Zona pellucida-Stimulation zu gewährleisten. Im Rahmen dieser Dissertation durchgeführte Untersuchungen deuten außerdem an, dass RIM2α eine Interaktion mit dem Multi-PDZ-Domänen Protein 1 (MUPP1) eingehen könnte. MUPP1 ist im Komplex mit der Calcium/Calmodulin abhängigen Kinase II daran beteiligt, eine spontane, durch die sekundäre Reifung der Spermien im weiblichen Genitaltrakt begünstigte Akrosomreaktion zu verhindern. Als molekularer Knotenpunkt könnte RIM2 demnach sowohl eine spontane Exozytose verhindern als auch durch die Rekrutierung weiterer CAZ-Proteine und des Zytoskeletts die großflächige, multiple Fusionsporenbildung zur Freilegung von ausreichend Izumo-Molekülen auf der Spermienoberfläche sicherstellen. Eine Lokalisation in Detergens-resistenten Membranplattformen, wie sie auch für MUPP1 und die SNARE-Proteine in Spermien gezeigt wurde, könnte diese integrierende Funktion von RIM2 für die akrosomale Exozytose unterstützen.

Ein retrospektiv angelegter Vergleich der beiden gängigsten Therapieoptionen im Bereich der Behandlung der dislozierten distalen Radiusfraktur bei Kindern, deren Wachstumsfugen noch nicht verschlossen sind. Die Gegenüberstellung nimmt sowohl auf die klassische Reponierung als auch die Einbringung osteosynthetischen Materials im Sinne sogenannter Kirschner- Drähte Bezug.

Einleitung: Modell-basierte Vorhersagen für molekulare Netzwerke und zelluläre Interaktionen können durch zwei verschiedene Strategien der Systembiologie getroffen werden, die top-down und bottom-up Strategien. Die bottom-up Strategie beginnt bei a priori Wissen über einzelne Grundelemente und fügt diese zu größeren Einheiten wie Signalwegen oder ganzen Systemen zusammen. Top-down Strategien setzen bei Datensätzen eines Systems an und versuchen Netzwerke, Interaktionen oder Komponenten zu identifizieren, die für das Systemverhalten (z.B. Phänotyp) verantwortlich sind. Im Folgenden werden beide Strategien auf unterschiedliche Transkriptionsdaten angewendet und die Ergebnisse visualisiert. Beide Strategien können auf linearen Regressionsmodellen basieren. In dieser Arbeit werden lineare Regressionsmodelle höherer Ordnung mittels eines neuen visuellen Hilfsmittels, des Eruptionsdiagramms, verglichen. Methodik: Eruptionsdiagramme werden durch die Überlagerung zweier Vulkandiagramme erstellt. Beide Vulkandiagramme werden von derselben Datengrundlage generiert, stammen jedoch von zwei verschiedenen Modellen. Jedes Gen wird von einem Pfeil repräsentiert, welcher bei dem Punkt des Vulkandiagramms von Modell 1 startet und bei dem Punkt des Vulkandiagramms aus Modell 2 endet. Im Rahmen der Modellselektion können Eruptionsdiagramme als visuelles Hilfsmittel verwendet werden, um (ir)relevante Kovariaten, Störfaktoren und Effektmodifikation aufzudecken. Ergebnisse: Es werden zwei verschiedene Transkriptionsdatensätze analysiert: ein Maus-Infektionsdatensatz und ein humaner Asthmadatensatz. Für die Analyse des Infektionsdatensatzes werden verschiedene lineare Regressionsmodelle miteinander verglichen. Durch eine rückwärts-gewandte Modellselektionsstrategie wird gezeigt, dass durch die Infektionskovariaten erster Ordnung zusätzliche erklärende Kraft gewonnen wird. Durch das Eruptionsdiagramm werden Effekte zweiter Ordnung aufgedeckt. Ein Modellvergleich identifiziert die Kovariaten dritter Ordnung als Störfaktoren. Das Modell zweiter Ordnung, welches am besten zu den Daten passt, wird für die weiterführende Analyse verwendet. Die Ergebnisse der Interaktionskovariate werden in aggravating und alleviating Effekte unterteilt. Ein Interaktionseffekt ist alleviating (aggravating, neutral), falls der Effekt der kombinierten Kovariaten schwächer (stärker, identisch) als die Summe der individuellen Effekte dieser Kovariaten ist. Bei der bottom-up Analyse des Asthmadatensatzes werden die Daten nicht auf Einzelgenebene sondern auf Gengruppenebene analysiert. Zunächst wird das passende Regressionsmodell mit Hilfe des Eruptionsdiagramms aufgestellt. Der Einfluss der einzelnen Gene auf das globale Testergebnis der Gengruppen wird in diagnostischen Balkendiagrammen genauer untersucht. Eine Signalweganalyse der Gengruppen zeigt neue Biomarker und Signalwege für die Charakterisierung von allergischem und nicht-allergischem Asthma auf. Diskussion: Die Ergebnisse der Transkriptionsanalyse werden durch Anreicherungsanalysen auf ihre funktionelle Relevanz hin untersucht. Die Ergebnisse zeigten unterschiedliche funktionelle Eigenschaften der aggravating und alleviating Gene auf. Die Anreicherungsanalyse des Asthmadatensatzes der Gene, die von Störfaktoren beeinflusst werden und durch Effektmodifikation gekennzeichnet sind, weisen jedoch keine funktionellen Unterschiede auf.

The number of patients suffering from obstructive arterial disease is still increasing. Stimulation of a patient’s collateralization (arteriogenesis), though an auspicious therapeutic approach, is still not part of current therapy regimes. Further studies on the molecular level are needed to understand the genetic regulation in this process. The transcription factor early growth response 1 (Egr1) was shown to partic-ipate in leukocyte recruitment and cell proliferation in vitro. This work contributes to the acquisition of new insights into its mode of action in vivo. Using a model of peripheral arteriogenesis, Egr1 was found significantly upregulated in growing col-laterals of wild-type mice (WT), both on mRNA (2.24fold) and protein level (2.3fold). Egr1 stained positive in EC and vSMCs of collaterals as well as in nerves. In LDI measurements conducted over the period of 21 days evidenced a delayed perfusion recovery after femoral artery ligation in Egr1-/- mice compared to WT mice (day7: 0.46±0.05 in Egr1-/- vs. WT (0.73±0.04), day 14: 0.65±0.02 in Egr1-/- vs. 0.88±0.04 in WT and day 21: 0.79 ±0.03 in Egr1-/- vs. 0.96±0.02 in WT). Under baseline conditions, Egr1-/- showed increased levels of monocytes (521.89±52.9 cells/µl vs. 326.56±21.6 cells/µl in WT) and granulocytes (811.79±79.96 cells/µl vs. WT 559.88±34.57 cells/µl) in the circulation but reduced levels in adductor muscles (18.14±2.73 cells/µl vs. 51.22±4.38 cells/µl in WT) as evidenced by FACS analyses. After femoral artery ligation, more macrophages were detected in the perivascular space of collateral arteries in Egr1-/- (8.10±0.99 per vessel) vs. WT (6.12±0.45 per vessel) mice. The mRNA of leukocyte recruitment mediators monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and urokinase plasminogen activator (uPA) were found upregulated in both groups. Whereas other Egr family members (Egr2-4) did not show an upregulation in WT collateral arteries, they were found significantly upregulated in Egr1-/- mice suggesting a mechanism of counter-balancing Egr1 deficiency. A closer look at cell cycle regulators revealed that cyclin E and cdc20 were found upregulated in WT as well as in Egr1-/- mice. However, cyclin D1 was hardly detectable under Egr1 deficiency conferring Egr1 an unique role for cyclin D1 transcription. vSMC phenotype switch is a critical step towards vSMC proliferation and therefore arteriogenesis. In this context, the downregu-lation of alpha smooth muscle actin (αSM-actin) and of the transcriptional repressor, splicing factor-1 (SF-1) has been shown to be critical in vitro. During arteriogenesis, SF-1 has been found downregulat-ed in collaterals of WT mice but was 1.64fold upregulated in Egr1-/-. Similar was true for αSM-actin. Whereas in WT mice αSM-actin is downregulated at 12h after ligation Egr1 deficient mice evidenced an upregulation of αSM-actin. The strong upregulation of the nonselective proliferation marker ki67 in WT mice was not detectable under Egr1 deficiency evidencing furthermore a delay in vascular cell proliferation. Conclusion: Compensation for deficiency of Egr1 function in leukocyte recruitment can be mediated by other transcription factors; however, Egr1 is indispensable for effective vascular cell cycle progression and phenotype switch in arteriogenesis.