Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19 Archiv

Aspergillus fumigatus is a major opportunistic, filamentous fungal pathogen causing invasive aspergillosis (IA), a fatal systemic infection in immunocompromised patients with significant mortality rate. The fungal cell is protected by a rigid but highly dynamic cellular structure, the cell wall that forms the first level of defence against environmental stress. The cell wall being an essential and unique structure of the fungus has always been an ideal drug target. The major antifungal drugs used currently either target the fungal cell membrane or cell wall. However, due to the poor efficacy of current antifungal therapy, the CWI (cell wall integrity) pathway has emerged as the focus of research in recent years to discover potential molecular drug targets for designing antifungal therapy with novel mode of action. This signaling cascade is dedicated to monitoring and maintaining functional integrity of the cell wall, remodelling its structure in response to cell surface stress. This MAPK (mitogen activated protein kinase) cascade is highly coordinated to transduce the stress signals to the nucleus and consequently trigger necessary gene expression to counteract the stress. In this study, we explored the pivotal role of guanine nucleotide exchange factor (GEF), Rom2 in cell wall stress response and antifungal drug susceptibility. The findings of this work reveal that the Rom2 GEF is essential for viability of the pathogen. Additionally, characterization of a conditional rom2 mutant functionally links it to the previously identified CWI sensors, namely, Wsc1, Wsc3 and MidA in A. fumigatus. The conditional mutant shows severe growth defects under repressive conditions such as hyper-susceptibility to heat, Calcofluor white and Congo red, similar to the ∆midA mutant. Additionally, similar to the ∆wsc1, the rom2 mutant cultured under repressive conditions is increasingly susceptible to the actively used antifungal and inhibitor of cell wall β-1,3-glucan synthesis, echinocandin such as caspofungin. Furthermore, the Rom2 shows a sub-cellular localization similar to the Rho1 GTPase to hyphal tips and also physically interacts with the GTPase. Thus, these relevant findings establish the integral role of Rom2 as an intermediate relay molecule acting between the cell surface sensors and Rho1 GTPase as well as the downstream MAPK module. This study also reports a novel mechanism imparting echinocandin tolerance to the pathogen. This work explores two possibilities that may explain the fungistatic nature of echinocandins against Aspergillus: one either owing to incomplete inhibiton of β-1,3-glucan synthesis or that the cell wall β-1,3-glucan is not essential for A. fumigatus viability. In order to evaluate the role of the β-1,3-glucan synthase subunit, Fks1 in viability, growth and antifungal response of the mold, a conditional fks1 mutant was generated. Downregulation of fks1 expression results in characteristic growth behaviour which phenocopies the effect of wild type treated with echinocandins. The mutant cultured under repressive growth conditions also displays significant decrease in cell surface β-1,3-glucan and enhanced galactomannan shedding, marked with a compensatory increase in chitin content. Importantly, the growth of the conditional fks1 mutant is not completely abolished in presence of echinocandin and an fks1 deletion mutant is surprisingly viable. These results strongly reflect that β-1,3-glucan is not essential in A. fumigatus, and thereby justifies the limited activity of β-1,3-glucan synthesis inhibitor echinocandin on the mold. The novel findings of the work also suggest that presence of septa is an essential means of survival for A. fumigatus upon echinocandin treatment. Compounds inhibiting septum formation exhibit significant synergism with the echinocandin caspofungin. Thus, the present study identifies and proposes that septum inhibition is a promising strategy for enhancing echinocandin fungicidal potency and improving existing antifungal therapy.

Helicobacter pylori ist ein gramnegatives, spiralförmiges Bakterium, dessen natürliches Habitat der menschliche Magen darstellt. Ungefähr 50% der weltweiten Bevölkerung gelten als infiziert, wobei die Infektion nur in 10% der Fälle symptomatisch ist. Komplikationen einer H. pylori Infektion sind chronische Gastritis, Ulcus ventriculi et duodeni, Magenkarzinom und gastrales MALT-Lymphom. Obwohl die gemeinsame Geschichte von Homo sapiens und Helicobacter pylori weit zurückreicht, wurde H. pylori und sein Zusammenhang mit diversen Magenerkrankungen erst in den 80iger Jahren des 20. Jahrhunderts bekannt, was dazu führt, dass noch viele Fragen unbeantwortet sind. Biolumineszenz Bildgebung in vitro und in vivo könnte bei der Antwortsuche behilflich sein. Die Möglichkeit durch biolumineszierende Erreger Infektionen longitudinal und quasi unmittelbar im lebenden Tier darstellen zu können ohne das Versuchsobjekt bei der Untersuchung zu zerstören, stellt eine große Chance dar, die schon bei vielen verschiedenen Bakterien genutzt wurde. Ziel dieser Arbeit war es mit Hilfe des Luciferase-Operons des Bakteriums Photorhabdus luminescens biolumineszierende H. pylori zu konstruieren und im Weiteren deren Überleben im Tiermodell zu testen. Dabei wurden verschiedene Konstrukte gewählt, die entweder das Lux-Operon (luxCDABE) im Ganzen exprimierten oder geteilt in seine funktionellen Einheiten luxAB und luxCDE. Weiter wurden verschiedene Insertionsorte und verschiedene Promotoren ausprobiert. Es gelang schließlich 7 verschiedene biolumineszierende H. pylori Mutanten mit verschiedenen Biolumineszenzintensitäten zu generieren. Von diesen H. pylori Mutanten konnte eine 8 Wochen nach Infektion aus dem Tier rückisoliert werden, wobei die Fähigkeit zur Biolumineszenz erhalten blieb. Die ersten Schritte auf dem Weg zu einem biolumineszierenden H. pylori und der Biolumineszenz Bildgebung desselben in vivo sind getan. Verbesserungen der Konstrukte, andere Promotoren, Insertionsorte, Modelltiere und neuartige CCD-Kameras lassen eine große Bandbreite an Variationen und Möglichkeiten zu, deren Ergebnisse sich in Zukunft weiter zeigen werden.

Methods based on nanotechnologies play a growing role in biomedical research. Quantum dots (QDs) are a group of engineered fluorescent nanoparticles suited for advanced imaging applications. The substitution of the particle’s surface with defined molecular structures could enable the adoption as targeted contrast agents or therapeutic devices for a variety of clinical approaches. However, important aspects such as the basic surfacedependent behavior of non-targeted QDs in the organism and arising health effects upon systemic administration remain incompletely understood. Acute inflammatory effects for instance are often initiated on the microcirculatory level and are probably relevant for cardiovascular pathologies observed in epidemiologic and experimental studies of certain nanoparticles. Most in vitro studies show that the surface structures of QDs and other nanoparticles seem to be predominantly accountable for different cytotoxic effects and a variable potential to liberate proinflammatory cytokines. Currently, no systematic in vivo studies have addressed surface-dependent interactions of QDs on the level of the microcirculation and assessed the resulting impact on biokinetics as well as on proinflammatory parameters. Thus, this thesis aimed to i) analyze the incidence of QDsurface- dependent acute microvascular interactions and their influence on key biokinetic parameters and ii) investigate acute immunomodulatory effects on the multistep process of leukocyte recruitment in vivo. For this, three types of commercially available QDs with different surface modifications: carboxyl-QDs, amine- and polyethylene glycol-QDs (amine-QDs) and polyethylene glycol-QDs (PEG-QDs) were used. The physicochemical characterization was done by dynamic light scattering (DLS) analysis and microscale thermophoresis. In a first set of experiments, circulating half-lives, tissue distribution in different organs, and hepatic as well as renal clearance were measured. Ex vivo analysis of QD tissue distribution was performed on selected tissue samples via transmission electron microscopy (TEM) and two-photon microscopy. By combining reflected-light oblique transillumination (RLOT) and fluorescence in vivo microscopy of the murine M. cremaster, interactions of QDs with components of the microcirculation as well as leukocyte migration parameters were visualized and quantified. The extreme short circulating half-life of anionic carboxyl-QDs was related to pronounced clearance by the mononuclear phagocyte system. Beyond this, further investigations showed, for the first time, that the continuous capillary endothelium of skeletal and heart muscle tissue has the capacity to directly extract carboxyl-QDs from the circulation by means of caveolaemediated endocytosis. Carboxyl-QDs were also taken up by perivascular macrophages in the surgically exposed but not in the native M. cremaster and led to a significant increase of adherent and (subsequently) transmigrated leukocytes in this model. Further experiments provided evidence for a probable involvement of mast cells in the intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)- and endothelial (E)-selectinmediated modulation of leukocyte recruitment. This process is most likely initiated by the endocytosis of carboxyl-QDs through activated perivascular macrophages. The primary activation of tissue-resident perivascular macrophages seems to be the consequence of tissue damage related to the surgical preparation of the cremaster muscle. This is supposedly a prerequisite for the endocytosis of carboxyl-QDs whereupon endothelial and mast cells seem to be secondarily activated in a paracrine fashion that then leads to an increase in leukocyte recruitment.

Ziel der Querschnittstudie ist es, die Assoziation zwischen sportlicher Aktivität der Mutter zur Frühgeburtlichkeit (Geburt vor der vollendeten 37. Schwangerschaftswoche) zu untersuchen. Methode In einer multivariaten Untersuchung wurde die Assoziation der sportlichen Aktivität zur Frühgeburtlichkeit anhand der umfassenden „BabyCare“ Daten mit insgesamt 14 528 teilnehmenden Schwangeren untersucht. Die sportlich aktiven Frauen wurden in zwei Gruppen zusammengefasst: Frauen, die in der Schwangerschaft ausschließlich empfohlene Sportarten ausüben und Frauen, die mindestens eine Sportart ausüben, von der in der Schwangerschaft abgeraten wird. Darüber hinaus wurde in Anlehnung an die Empfehlung des American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) die in der Schwangerschaft empfohlene sportliche Intensität von zwei bis vier Stunden Sport in der Woche untersucht und für für weitere potenzielle Risikofaktoren der Frühgeburtlichkeit wie „Alter“, „Beruf“, „BMI“, „vorzeitige Wehentätigkeit“, „vorzeitiger Blasensprung“, „Rauchen“, „Hypertonie“, „Diabetes mellitus“, „Arbeitsbedingung: Stehen“, „Arbeitsbedingung: körperlich schwere Arbeit“ und „Stress“ kontrolliert. Ergebnisse Weder die Frauen, die in der Schwangerschaft empfohlene Sportarten ausüben, noch die Frauen, die Sportarten ausüben, von denen abgeraten wird, zeigen eine signifikante Assoziation zur Frühgeburtlichkeit. Die Studie zeigte einen nahezu signifikanten protektiven Zusammenhag zur Frühgeburtlichkeit für die Ausübung von Sportarten im empfohlenen Intensitätsbereich OR 0,76 (KI 95 % [0,54; 1,07]; p- Wert 0,12). Schlussfolgerung Sportlich aktive Schwangere können von den positiven Effekten sportlicher Aktivität profitieren. Bei sportlich aktiven Frauen treten weniger häufig Übergewicht, Gestationsdiabetes, Thrombosen und Depressionen auf. Außerdem leiden sie seltener an schwangerschaftsbedingten Beschwerden wie Ödemen und können lumbo- pelvine Schmerzen vermutlich besser verarbeiten. Zu den positiven Effekten auf die Geburt zählen weniger häufige Geburtskomplikationen und eine bessere Toleranz der Geburtsschmerzen. Weitere Studien zur Untersuchung des möglichen protektiven Zusammenhangs von der Ausübung von in der Schwangerschaft empfohlenen Sportarten in der empfohlenen Intensität zur Frühgeburtlichkeit sind nötig.

Plattenepithelkarzinome der Bindehaut sind seltene Neoplasien der Bindehaut. Sie sind jedoch die häufigsten malignen Tumore der Augenoberfläche. Bisher hat sich noch keine einheitliche Therapiestrategie zur Behandlung dieser Malignome durchgesetzt. Für frühe Stadien dieser Karzinome bestehen mehrere unterschiedliche Therapiemodalitäten, wobei hier lokal angewandte Chemotherapeutika an Bedeutung gewinnen. Für fortgeschrittene Stadien bleibt die chirurgische Therapie allerdings die einzige erfolgversprechende Behandlungsmethode, wobei es wenige Daten zu den Langzeitergebnissen gibt. Deswegen wurde diese retrospektive Studie angelegt. Es wurden die Daten von insgesamt 38 Fällen ausgedehnter Plattenepithelkarzinome der Bindehaut erhoben. Diese Studie zeigt, dass eine lokale chirurgische Exzision fortgeschrittener Tumore oftmals noch möglich ist, auch wenn bereits angrenzende Strukturen betroffen sind. Dennoch kann bei fortgeschrittenen Fällen eine orbitale Exenteration nicht bei jedem Patienten vermieden werden. Bei einer unzureichenden Behandlung oder einer sehr späten Erstdiagnose kann diese Erkrankung einen letalen Ausgang nehmen. In der vorliegenden Studie treten Rezidive fortgeschrittener Tumore häufiger auf, als in der Literatur beschrieben. Dies wird darauf zurückgeführt, dass sich diese Studie selektiv mit fortgeschrittenen Stadien befasst, während die bisherige Literatur eine Stadieneinteilung nicht weiter berücksichtigt. Rezidive können selten auch erst nach fünf Jahren auftreten. Wenn diese späten Fälle früh genug erkannt werden, können sie auch durch eine weitere lokale Exzision erfolgversprechend behandelt werden.