Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19 Archiv

Trotz einer deutlichen Verbesserung der Prognose bleibt der systemische Lupus erythematodes (SLE) eine unheilbare Autoimmunkrankheit mit hoher Mortalität und insbesondere Morbidität. Da bei unvollständig verstandener Pathogenese weiterhin nur symptomatische Behandlungen verfügbar sind, steigt die Prävalenz des systemischen Lupus kontinuierlich, wobei die verursachten Kosten durch Behandlung und Arbeitsausfall aktuell in den USA jährlich bei umgerechnet über 10 Mrd. Euro liegen. Bisher ist bekannt, dass der Endorganschaden durch das Auftreten von autoreaktiven T-Zellen und insb. B-Zellen sowie von diesen produzierten Autoantikörpern vermittelt wird, sodass die Behandlung in vielen Fällen der Chemotherapie niedrig-maligner B-Zell-Lymphome ähnelt und daher viele unerwünschte Nebenwirkungen mit sich bringt. Die genaue Art und Herkunft der nukleären Autoantigene ist bislang ebenso unbekannt wie die beteiligten molekularen Signalwege, wobei hier unter anderem Toll-like-Rezeptoren sowie deren intrazelluläre Signalkaskaden, inklusive der Interferon-regulatorischen Faktoren (IRFs) diskutiert werden. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle des Interferon-regulatorischen Faktor 4 (IRF4) in der Entstehung des systemischen Lupus erythematodes zu untersuchen. IRF4 wird fast ausschließlich in Zellen des Immunsystems exprimiert und reguliert als Transkriptionsfaktor die Entwicklung und Polarisierung von B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen. Zusätzlich wirkt IRF4 aber insbesondere in dendritischen Zellen auch als negativer Regulator des pro-entzündlichen Toll-like-Rezeptor-Signalweges. Diese duale Rolle von IRF4 spiegelt sich auch in den Auswirkungen auf die Krankheitsentwicklung im untersuchten murinen SLE-Modell wieder: Während im Vergleich zu IRF4-kompetenten (wt) Mäusen IRF4-defiziente (KO) Tiere deutlich früher und stärker ausgeprägt Zeichen der systemischen Entzündung zeigen, sind sie vor der Entwicklung der SLE-typischen Endorganschäden vollständig geschützt. So weisen IRF4-KO-Mäuse stark erhöhte Plasmaspiegel von IL-12 und TNF-α sowie eine ausgeprägte Splenomegalie auf, zeigen aber weder detektierbare Autoantikörper im Plasma noch die typische Lupusnephritis. Neben der Wichtigkeit von autoreaktiven Lymphozyten in der Pathogenese des SLE zeigt die vorliegende Arbeit damit, dass trotz hyperaktiver innater Immunität der autoimmune Endorganschaden vermieden werden kann, was perspektivisch die Möglichkeiten einer eher immunmodulatorischen als rein immunsuppressiven Therapie mit ihren zahlreichen Nebenwirkungen aufzeigt.

Das erweiterte hämodynamische Monitoring und aus ihm gewonnene Informationen sind für die Therapie schwerkranker Patienten von Bedeutung. Derzeit sind hierfür invasive Monitoring-Verfahren wie der Pulmonalarterienkatheter nach Swan und Ganz oder die kontinuierliche Pulskonturanalyse mittels PiCCO-Technologie als Goldstandard anzusehen. Aufgrund der generell mit invasiven Maßnahmen assoziierten Risiken und möglichen Komplikationen wird intensiv an leistungsfähigen nichtinvasiven Systemen geforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde der „Flexicuff“ – ein zum Zeitpunkt der Studie im Entwicklungsstadium befindliches Monitoring-System – untersucht. Es handelt sich beim Flexicuff um eine speziell konstruierte Oberarmmanschette zur nichtinvasiven Ableitung einer arteriellen Druckkurve, deren Funktionsweise und Messtechnik an freiwilligen Probanden und Patienten am Klinikum der Ludwig-Maximilians-Universität München untersucht wurde. In insgesamt 560 Messzyklen an 28 Probanden wurden Varianten des Flexicuffs getestet. Bei vorgegebenem Klemmdruck der Flexicuff-Manschette konnte eine Gewebedruckkurve mit Merkmalen einer invasiv abgeleiteten arteriellen Druckkurve abgeleitet werden. Ein Kalibrierungsfaktor, der den Pulsdruck der Gewebedruckkurve im Verhältnis zum arteriellen Pulsdruck beschreibt, variiert individuell erheblich und kann aus biometrischen Daten der Probanden nicht abgeleitet werden. Die Anwendung des – aus den Ergebnissen der Probandenversuche – optimierten Flexicuff-Systems war in 375 Messzyklen an 14 kontrolliert beatmeten Patienten mit invasiver arterieller Referenzmessung im operativen Umfeld problemlos möglich. Es zeigte sich aber, dass fest vorgegebene Klemmdrücke am kontrolliert beatmeten Patienten in Allgemeinanästhesie ungeeignet sind, Gewebedruckkurven abzuleiten, mittels derer sich Herz-Lungen-Interaktionsparameter wie die Pulsdruckvariation zuverlässig ableiten lassen. Vermutlich ist ein kontinuierlicher Anstieg des Klemmdrucks besser geeignet, um Informationen aus der Gewebedruckkurve am Oberarm abzuleiten, die für ein erweitertes hämodynamisches Monitoring verwendet werden können. Eine zukünftige Optimierung der Flexicuff-Manschette, des Messablaufs sowie die Entwicklung eines leistungsfähigen Algorithmus zur Berechnung von Herz-Lungen-Interaktionsparametern beruhen auf den in dieser Arbeit beschriebenen ersten Ergebnissen zum Flexicuff-System. Sie bedürfen der Evaluierung und Verifizierung in weiteren Studien.

Intramembrane proteolysis - hydrolysis of membrane proteins within or close to their membrane-spanning regions - is a crucial cellular process that is conserved throughout all kingdoms of life. It is executed by distinct classes of polytopic membrane proteins, the intramembrane-cleaving proteases, that provide a hydrophilic, proteinaceous environment accommodating membrane protein substrates as well as water molecules within the hydrophobic membrane interior and catalyse peptide bond hydrolysis. In particular, intramembrane-cleaving aspartyl proteases have received attention as the presenilins, the catalytic subunits of the γ-secretase complex, were identified as key players in Alzheimer's disease pathophysiology. In addition to presenilins, mammalian genomes harbour presenilin homologues which include signal peptide peptidase (SPP) and SPP-like (SPPL) proteases. Among these, the Golgi-resident protease SPPL3 stands out as it is highly conserved among metazoa and SPPL3 orthologues are also found in plants. However, due to the lack of known substrates, SPPL3 has thus far hardly been characterised. Hence, the purpose of this study was to identify its substrates and elucidate its physiological function(s). In the first part of this study, the foamy virus envelope glycoprotein (FVenv) was identified as the first substrate of SPPL3. This allowed to study SPPL3's proteolytic activity in detail, with a focus on its substrate selectivity and sensitivity towards previously characterised inhibitors of intramembrane-cleaving aspartyl proteases. Importantly, this study revealed in addition that two other intramembrane-cleaving proteases, SPPL2a and SPPL2b, also endoproteolyse FVenv. SPPL2b in particular had been studied in detail before and therefore SPPL3- and SPPL2b- mediated endoproteolysis of FVenv were examined in parallel to directly compare these phylogenetically related intramembrane-cleaving proteases. This uncovered an unexpected idiosyncrasy of SPPL3 that clearly sets SPPL3 apart from other intramembrane-cleaving aspartyl proteases: SPPL3 endoproteolysed full-length FVenv and did not require the substrate's prior tailoring by another proteolytic activity - an otherwise common phenomenon among intramembrane-cleaving aspartyl proteases. In the second part, the physiological function of SPPL3 was investigated. Alterations in the cellular levels of proteolytically active SPPL3 turned out to impact the composition of N-glycans attached to endogenous cellular glycoproteins. SPPL3 over-expression was accompanied by a decrease in glycoprotein molecular weight, i.e. a hypoglycosylation phenotype, while loss of SPPL3 expression in cell culture models but also in vivo resulted in a hyperglycosylation phenotype. This led to the identification of Golgi glycan-modifying enzymes such as GnT-V and β3GnT1 as novel physiological substrates of SPPL3. Loss or reduction of SPPL3 expression, for instance, led to a marked intracellular accumulation of these enzymes, explaining the more extensive N-glycan elaboration and the hyperglycosylation phenotype observed under these conditions. At the same time secretion of these enzymes was reduced under these conditions. Together with additional observations such as the mapping of the SPPL3 cleavage site to the membrane-spanning region of GnT-V, this study demonstrates that SPPL3-mediated intramembrane proteolysis of such glycan-modifying enzymes liberates their active site-harbouring ectodomains. Acting in this manner, SPPL3 controls the intracellular pool of active glycan-modifying enzymes. Importantly, the finding that SPPL3 proteolytically cleaves full-length glycan-modifying enzymes and sheds their ectodomains is well in line with the observations made for FVenv and suggested that SPPL3 acts functionally equivalent to classical sheddases or rhomboid proteases but much unlike all other characterised mammalian intramembrane-cleaving aspartyl proteases. To examine whether these observations hold also true on a global cellular scale, a proteomic approach was undertaken in the third part of the study to define the SPPL3 degradome of HEK293 cells in conditions of SPPL3 over-expression. On the one hand, this led to the identification of numerous novel, mostly Golgi-resident candidate SPPL3 substrates and, considering the physiological implications, suggests that SPPL3 is very intricately linked to Golgi function. On the other hand, this approach supports the initial hypothesis that SPPL3 acts as a cellular type II membrane protein-selective sheddase. Taken together, this study provides the first in-depth characterisation of the intramembrane protease SPPL3 and reveals the cellular function of SPPL3. SPPL3 displays considerable and marked differences to other intramembrane-cleaving aspartyl proteases and emerges as a fundamental cellular sheddase that exhibits strong selectivity for type II-oriented, Golgi-resident membrane proteins. Products of SPPL3-mediated endoproteolysis of these Golgi factors are secreted and/or may be subject to intracellular degradation which compromises their catalytic activity. Thus, SPPL3 indirectly controls protein glycosylation in the Golgi apparatus.

Interstitial lung diseases (ILD) are severe chronic lung diseases characterized by an increased deposition of extracellular matrix in the lung interstitial space, leading to a thickening of the alveolar walls and impairment of the gas exchange. One of the most common entities in this category is idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) with a mean survival time of 2 to 3 years from diagnosis. Until now, there is no curative therapy available and the symptomatic anti- inflammatory treatment and oxygen supplementation cannot prevent the development of the end stage pulmonary fibrosis. The chemokine receptor CCR2 is important for leukocyte recruitment to inflamed tissues through interaction with CCL2 (MCP-1). The blockade of the CCR2/CCL2 pathway attenuated the development of pulmonary fibrosis in mouse models. However, CCR2+ T-lymphocytes acquired regulatory functions in experimental arthritis during the course of disease. Therefore, it is unknown whether CCR2+ T cells are involved in the pathogenesis of IPF or, on the contrary, represent an unsuccessful effort of the immune system to limit the disease. Observations in paediatric patients with different forms of ILDs suggested a role for CCR2+ T cells in pulmonary fibrosis. To characterize these T cells, flow cytometric studies were performed using the bleomycin mouse model of pulmonary fibrosis. The kinetic of CCR2+ T cells in BALF, lung tissue, and spleen following intratracheal administration of bleomycin (BLM) was assessed at time points between day 3 and day 21. To determine, if the constellation of naïve, central memory and effector memory T cells changes after BLM treatment, and to which of these subtypes CCR2+ T cells belong to, the cells were additionally stained for CD62L and CD44. For further characterization of CCR2+ T cells, chemokine receptor co-expression with CCR2 was investigated at the time point of the maximal presence of CCR2+ T cells. Total T cell numbers increased in BAL and lung tissue but not in spleen. Percentages of CD62LlowCD44hi effector memory T cells increased in lung tissue in the early phase of BLM induced fibrosis, while the CD62LhiCD44low naïve T cell population decreased. The percentage of CCR2+ T cells increased following BLM treatment with a maximum on day 12. The majority of CCR2+CD4+ T cells showed a Tem phenotype. CCR3, CCR4, CCR6, CXCR4, and CXCR5 expressing cells increased within the pulmonary CD4+ T cell population following bleomycin treatment. Among CD8+ T cells from treated mice, CCR5, CCR6, and CXCR5 positive cells were increased. CCR7 was highly co-expressed with CCR2 in saline and bleomycin treated mice, whereas co-expression of CCR3, CCR4, CCR6 and CXCR5 increased significantly in treated mice. The results indicate an activation of pulmonary T cell populations following bleomycin treatment. CCR2+CD4+ T cells probably take part on this T cell response as they exhibit an effector memory phenotype and increase following BLM treatment. In contrast, the stable percentages of the different T cell subtypes in spleens gave no hint for a systemic T cell reaction. The pattern of chemokine receptor expression argues against a Th1 polarization and towards a Th2, Th17 or TFH polarization of CCR2+ T cells.