Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19 Archiv

Mykobakterien sind heterogene Krankheitserreger und befallen Mensch und Tier. Der bekannteste Vertreter ist das Mycobacterium tuberculosis als Hauptverursacher der Tuberkulose und wichtigster Vertreter des M. tuberculosis-Komplexes. Daneben gibt es Mycobacteria other than tuberculosis, die MOTTS, die für verschiedene Krankheitsbilder bei unterschiedlichen Spezies verantwortlich sind. In dieser Arbeit wurde der Versuch der molekularbiologischen Stammdifferenzierung bei einer größeren Zahl Formalin fixierter und in Paraffin eingebetteter Proben vorgenommen. Hierbei wurden sowohl Patientenproben als auch Proben aus dem veterinärmedizinischem Bereich herangezogen, die zunächst histologisch begutachtet wurden. Bei fünf von 12 veterinärmedizinischen Fällen wurden säurefeste Stäbchen in der Ziehl-Neelsen Färbung gefunden. In der molekularen Untersuchung wurden bei allen diesen Fälle bis auf einen, bei dem die DNA vermutlich gehemmt ist, und einem zweiten, der in der Färbung unauffällig war, die Anwesenheit von Mykobakterien bestätigt. Bei diesem in der Färbung unauffälligen Fall wurde das Vorhandensein von unbekannten Mykobakterien nachgewiesen. Bei den übrigen vier Fällen wurde dreimal das M. avium subsp. avium, normalerweise Erreger der Geflügeltuberkulose, und einmal das M. avium subsp. paratuberculosis nachgewiesen. M. avium subsp. paratuberculosis ist Erreger der Paratuberkulose, einer chronischen Enteritis bei Rindern. Es konnten keine Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes nachgewiesen werden. Aus dem Bereich der Humanmedizin wurden Patientenproben aus der Routinediagnostik histologisch und molekularbiologisch mit PCR und Spoligotyping untersucht. In der Ziehl-Neelsen-Färbung wurde histologisch nach Tuberkulose-typischen Auffälligkeiten wie Granulome, Epitheloidzellen und Nekrosen gefahndet. Anschließend wurden die Proben molekularbiologisch mit PCR auf β-Aktin als Hinweis auf replizierbare DNA und auf IS6110 als Hinweis auf Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes untersucht. IS6110-positive Proben wurden mit dem Ziel der genauen Stammdifferenzierung dem Spoligotyping zugeführt. Spoligotyping ist eine auf PCR basierende Technik, die gerne für epidemiologische Fragestellungen genutzt wird. Folgende weitere Ergebnisse wurden gewonnen: Die molekulare Untersuchung mittels PCR zeigte die Anwesenheit von M. tuberculosis-Komplex DNA in 36 von 65 humanen Fällen, wohingegen säurefeste Stäbchen in der Ziehl-Neelsen Färbung nur in elf Fällen entdeckt werden konnten. Alle IS6110 positiven Fälle wurden mit Spoligotyping weitergehend untersucht. Dreizehn Fälle boten M. tuberculosis spezifische Muster, während M. bovis spezifische Muster in vier Fällen erhalten wurden.

The clinical course of renal cell carcinoma (RCC) shows a high variability. Prognostic markers are essential to enable an individualized therapeutic strategy. The objective of this study was the identification of novel independent prognostic markers and potential therapeutic targets in RCC. The focus was on genes involved in epithelial-mesenchymal transition (EMT) and cancer stem cell biology. EMT enhances tumor cell motility and hence plays a critical role in invasion and metastasis in various carcinomas. A set of transcription factors acts as master regulators of EMT. Whether EMT is important for tumor progression in clear cell renal cell carcinoma (RCC) is unknown. Therefore, EMT-related genes were selected from the literature, and their role and prognostic relevance in RCC were analyzed. The known cancer stem cell marker CXCR4 and the associated TPBG gene were also analyzed in this project. Additionally, a novel filter strategy was used to analyze RCC oligonucleotide microarray data for identification of potential prognostic markers: genes with increasing expression during tumor progression (normal kidney < primary tumor < metastases) were selected for outcome analysis because they could be crucial for RCC biology. Expression of 46 EMT-related genes was analyzed using oligonucleotide microarrays and gene set enrichment analysis (GSEA) in tissue samples from normal kidney and G1 and G3 primary RCC, 14 samples each. Expression of selected EMT genes was validated by real-time polymerase chain reaction (PCR) in normal kidney, primary RCC and metastases in an independent cohort of 112 patients and then combined with follow-up data for survival analysis. Immunohistochemistry, Western blot and flow cytometry were performed to further examine the expression of CXCR4 and co-expression of CXCR4 and TPBG on the surface of RCC cells. GSEA and dChip software were used for microarray data analysis. The EMT gene set was preferentially expressed in primary tumors compared to normal tissue (false discovery rate FDR=0.01), but no difference between G1 and G3 tumors was found. Quantitative RT-PCR showed down-regulation of critical EMT genes like CDH2 and ZEB1 in metastases which suggests reversal of EMT during metastasis. Kaplan-Meier analysis demonstrated a significant better outcome for patients with low CXCR4, vimentin, fibronectin and TWIST1 mRNA levels. Multivariate analysis revealed that CXCR4 and vimentin up-regulation represent independent prognostic markers for poor cancer-specific survival of RCC patients. The microarray approach using filtering and further RT-PCR validation of progression-associated genes revealed that ATAD2, TET3, HELLS and TOP2A are independent and previously unknown predictors of poor outcome in RCC patients. Taken together, this study provides strong evidence that EMT occurs in RCC. Modulation of EMT in RCC, therefore, might represent a future therapeutic option. Expression levels of a number of EMT-related genes (like the genes encoding the cancer stem cell marker CXCR4 and vimentin) could be identified as independent prognostic markers. Using a novel filtering approach on array data, additional novel prognostic markers could be identified. These findings contribute to a better risk stratification of RCC patients that can support an individualized and optimized therapeutic strategy.

Einleitung: Zur in-vitro Diagnostik der Tuberkulose (TB) und latenten TB Infektion (LTBI) im Kindesalter werden derzeit zunehmend „Interferon-gamma (IFN-γ) release assays“ (IGRA) verwendet. Die Sensitivität der IGRA insbesondere im Kindesalter ist umstritten. Auch eine diagnostische Unterscheidung zwischen TB und LTBI ist mittels IGRA und anderen bisherigen basierten Testverfahren nicht möglich. In vorangegangen Studien zeigte sich der Biomarker „IFN-γ-inducible-protein-10“ (IP-10) als viel versprechend zur Diagnose der TB und LTBI. Ziele: In der vorliegenden Dissertationsschrift wurden die IP-10-Plasmakonzentrationen von Kindern mit TB, LTBI, Atemwegsinfektion (AWI) oder nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM)-Erkrankung ohne Stimulation der Proben, nach unspezifischer Mitogen-Stimulation und nach spezifischer Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis)-Antigen-Stimulation bestimmt. Die Antigen-stimulierten IP-10-Plasmakonzentrationen der TB- und LTBI-Gruppe wurden mit denen der NTM- und AWI-Gruppe verglichen. Darüberhinaus wurde beurteilt, ob eine Unterscheidung zwischen TB und LTBI anhand der IP-10-Plasmakonzentration möglich ist. Außerdem wurde die Konkordanz und Korrelation zwischen dem IP-10-ELISA und QuantiFERON -TB Gold In-Tube (QFT-IT) Test beurteilt und untersucht, ob der Biomarker IP-10 altersabhängig sezerniert wird. Material & Methoden: 48 Kinder wurden in die Studie eingeschlossen. Das mittlere Alter der Studienteilnehmer war 54 Monate. Alle Studienteilnehmer wurden zuvor in Deutschland entweder mit einer TB (n=11), LTBI (n=14), NTM (n=8) oder AWI (n=15) diagnostiziert. Unabhängig von der vorliegenden Studie wurden bei allen teilnehmenden Kindern IFN-γ-Werte mittels des QFT-IT-Testes bestimmt. Im Rahmen des QFT-IT wurden die für den Test notwendigen Blutproben entweder nicht stimuliert, mit einer unspezifischen Mitogenen-Substanz oder mit spezifischen M.tuberculosis-Antigenen stimuliert. Die jeweiligen Plasma-Überstände wurden asserviert und zur Bestimmung von IP-10 verwendet. Die IP-10-Konzentrationen wurden, in Zusammenarbeit mit dem Klinischen Forschungszentrums der Universität von Kopenhagen, mittels einem zu Forschungszwecken entwickelten ELISAs gemessen. Ergebnisse: Die IP-10-Plasmakonzentrationen ohne Stimulation, mit unspezifischer Mitogen- und spezifischer Antigen-Stimulation betrug für die TB-Gruppe 704 pg/ml, 12.966 pg/ml und 12.702 pg/ml; für die LTBI-Gruppe 366,5 pg/ml, 10.232 pg/ml und 9.109 pg/ml; für die NTM-Gruppe 309 pg/ml, 11.197 pg/ml und 97 pg/ml; und für die AWI-Gruppe 694 pg/ml, 5.401 pg/ml und 84 pg/ml. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen der IP-10-Konzentration der TB- und LTBI-Gruppe festgestellt werden (p-Wert= 0,24). Die IP-10- und IFN-γ- Plasmakonzentrationen der Kinder mit TB und LTBI korrelierten stark miteinander (rsp=0,65; p-Wert = 0,03 und rsp=0,79; p-Wert < 0,001). Der IP-10-ELISA und QFT-IT Test zeigten ebenso eine hohe Konkordanz (κ =0,96). Die IP-10-Sekretion war 18fach höher im Vergleich zur IFN-γ-Sekretion. Es konnte keine Korrelation zwischen dem Alter und der Mitogen-stimulierten IP-10-Konzentration nachgewiesen werden. Schlussfolgerungen: Die IP-10-Plasmakonzentration von Kindern mit TB und LTBI im Vergleich zu Kindern mit NTM und AWI ist signifikant nach spezifischer M.tuberculosis-Antigen-Stimulation erhöht (p-Wert > 0,001). Die qualitativen und quantitativen Testergebnisse des IP-10-ELISAs korrelieren stark mit denen des QFT-IT-Testes. Im Vergleich zu IFN-γ scheint IP-10 in höheren Konzentrationen und möglicherweise unabhängig vom Alter sezerniert zu werden. Das legt die Vermutung nahe, dass IP-10 zur Diagnose der TB und LTBI im Kindesalter in Zukunft Verwendung finden könnte.

In der vorliegenden Untersuchung wurden zu 554 geistig behinderten Besucherinnen und Besuchern von WbfMs verschiedene Daten zur Lebenssituation und zu ihrem gesundheitlichen Zustand erhoben. Es wurden darüber hinaus aktuell das Gewicht, die Körpergröße und der Bauchumfang gemessen. Ziel wear es zu ermitteln, inwieweit geistig behinderte Menschen zu einem höheren Prozentsatz als die deutsche Durchschnittsbevölkerung Übergesicht und Adipositas entwickeln. Ein besonderer Schwerpunkt lag in der Studie auf der Ermittlung von spezifischen Risikofaktoren bezüglich der Entwicklung einer Adipositas. Aus psychiatrischer Sicht sollte dabei v.a. überprüft werden, ob Psychopharmaka, die in der Untersuchtungsstichprobe von knapp einem Fünftel der Befragten eingenommen wurden, für das Auftreten von Adipositas eine besondere Rolle spielen.

Der SLE ist eine Autoimmunerkrankung aus der Gruppe der Kollagenosen, in deren Verlauf es durch einen Toleranzverlust zu einer fälschlichen Antwort des Immunsystems auf körpereigene Strukturen kommt. Das lange Pentraxin PTX3 ist ein inflammatorisches Akut-Phase-Protein und hat zahlreiche Funktionen im angeborenen Immunsystem. Um den Einfluss von PTX3 auf den SLE zu untersuchen, wurden B6lpr Mäuse verwendet, welche unter einem mit dem SLE vergleichbaren milden Autoimmunsyndrom leiden. In diese Mäuse wurde eine Ptx3-Defizienz eingekreuzt. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass PTX3 die systemische Autoimmunität entscheidend beeinflusst: Entweder führt PTX3 zu einer Aggravation der Klinik durch seine proinflammatorische Wirkung oder PTX3 hemmt die Krankheitsintensität über seine Steigerung der Phagozytose sowie die Hemmung der Selectin-P vermittelten Leukozyteninfiltration. Überraschenderweise beeinflusste das Fehlen von PTX3 die systemische Autoimmunität in B6lpr Mäusen kaum. So waren die Autoantikörper-produzierenden Plasmazellen sowie die Autoantikörper zwischen beiden Genotypen kaum verändert. Lediglich die Anzahl an „autoreaktiven“ CD4 und CD8 doppelnegativen T-Lymphozyten war in den Ptx3-defizienten B6lpr Mäusen signifikant erhöht. Es konnte gezeigt werden, dass PTX3 eine rasche Clearance apoptotischer T-Zellen intraperitoneal fördert und dass dies einen entscheidenden Beitrag für den Verlust der Immuntoleranz darstellen könnte. Umgekehrt könnte der Anstieg der „autoreaktiven“ T-Zellen durch die verschlechterte Clearance apoptotischer Zellen bedingt sein. Der Mangel an PTX3 zeigte auf Organ-spezifischer Ebene eine entscheidende Rolle bei der Ausprägung des SLE. Während die Lupusnephritis in den Mäusen unverändert blieb zeigte sich eine signifikant verstärkte Lungenschädigung in den Ptx3 knockout-Tieren. Ursächlich hierfür könnte die Anbindung von PTX3 an Selectin-P sein, durch die eine über dieses Adhäsionsmolekül vermittelte Leukozyteninfiltration an den Ort der Entzündung limitiert wird. Somit stellt PTX3 ein negativer Rückkopplungsmechanismus bei Entzündungen dar, da PTX3 vermehrt bei Inflammation gebildet wird, gleichzeitig aber die Leukozytenrekrutierung limitiert und somit das Ausmaß der entzündlich infiltrativ bedingten Lungenschädigung eindämmt. Defekte des Ptx3-Gens könnten ein genetischer Risikofaktor für die SLE bedingte Ausprägung von Lungenschädigungen des Menschen darstellen und so eine Behandlung mit rekombinanten PTX3 oder anderen PTX3-Agonisten eine mögliche spezifische Behandlungsstrategie darstellen.

Neurodegenerative diseases such as Alzheimer´s disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD) are defined by progressive and selective loss of neurons. With increasing age the risk of developing a neurodegenerative disease exponentially rises. To date these diseases are untreatable, imposing a significant medical, social and financial burden onto our ageing society. Typical features of neurodegenerative diseases are abnormal aggregation of a disease characterizing protein and its deposition in pathological inclusions. A unifying feature in the majority of ALS cases and several subtypes of FTD is the pathological deposition of the TAR DNA-binding protein of 43kDa (TDP-43) or the Fused in Sarcoma (FUS) protein. Furthermore, stress granule (SG) marker proteins are consistently detected in FUS inclusions, suggesting that SGs might be involved in the formation of FUS inclusions. However, whether pathologic TDP-43 inclusions contain SG marker proteins is still controversially discussed. In this thesis I demonstrate that cytosolically mislocalized full-length TDP-43 is recruited into SGs, whereas C-terminal fragments of TDP-43 (TDP-CTFs) fail to localize to SGs. In accordance with these cell culture data, spinal cord inclusions in ALS and FTD patients contain full-length TDP-43 and SG marker proteins. In contrast, hippocampal inclusions are enriched for TDP-CTFs but are SG marker-negative. Thus, the protein composition of TDP-43 inclusions determines whether SG marker proteins are co-deposited in TDP-43 inclusions or not. By analyzing the prerequisites for SG recruitment of TDP-43 and FUS, I demonstrate that cytosolic mislocalization of TDP-43 and FUS is required for their localization in SGs. Additionally, I found that both proteins have the same requirements for SG recruitment, as their main RNA-binding domain and a glycine-rich domain are essential for SG localization. A detailed analysis of the protein composition of FUS inclusions in ALS and FTD cases unveiled that FUS inclusions in FTD cases contain not only FUS, but all FET (FUS, Ewing sarcoma protein (EWS), TATA binding protein-associated factor 15 (TAF15)) family proteins. Here, I provide evidence that this cytosolic deposition of FET proteins can be mimicked in cultured cells by inhibition of Transportin-mediated nuclear import, which causes cytosolic mislocalization of all FET proteins and recruitment of these proteins in SGs. In contrast to FTD cases, FUS inclusions in ALS cases contain only FUS, but not EWS and TAF15. In line with that, I show that ALS-associated FUS mutations result in cytosolic mislocalization of FUS that is upon subsequent cellular stress sequestered into SGs. These SGs then contain only FUS but not EWS or TAF15, demonstrating that mutant FUS is unable to co-sequester EWS or TAF15. In addition, I contributed to two studies that revealed that nuclear import defects are involved in the pathogenesis of ALS and FTD. ALS associated FUS mutations are frequently located within the proline-tyrosine nuclear localization signal (PY-NLS) of FUS and thus disrupt Transportin-mediated nuclear import and cause cytosolic mislocalization of FUS. EWS and TAF15 also contain a PY-NLS and thus are imported into the nucleus via Transportin. This interaction between Transportin and FET proteins can be modulated by arginine methylation that reduces Transportin binding. In FTD patients with FUS inclusions, this post-translational modification seems to be defective, as FUS inclusions in these cases contain hypomethylated FUS. Taken together, these data provide evidence that nuclear import defects and sequestration of FUS and TDP-43 in SGs are consecutive steps in the pathogenesis of ALS and several subtypes of FTD.