Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 10/19 Archiv

Ektodomänenspaltung und Intramembranproteolyse des Amyloiden Vorläufer Proteins (APP) durch Alpha-, Beta- und gamma-Sekretase sind in die Pathogenese der Alzheimer Erkrankung (AD) involviert. Eine vermehrte proteolytische Prozessierung und Sekretion eines anderen Membranproteins, des Typ II Interleukin-1 Rezeptors (IL-1R2) wurde mit der Pathogenese der Alzheimer Erkrankung in Verbindung gebracht. IL-1R2 ist ein Abfangrezeptor, welcher vermutlich in der Lage ist, die schädlichen Effekte von Interleukin-1 im Gehirn zu begrenzen. Bis jetzt ist die proteolytische Prozessierung von IL-1R2 nur wenig verstanden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass IL-1R2 ähnlich wie auch APP prozessiert wird. In humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293) exprimiertes IL-1R2 unterläuft zuerst eine Spaltung der Ektodomäne durch eine Metalloprotease, was zur Freisetzung der Ektodomäne und einem in der Membran verbleibenden C-terminalen Fragment führt. Dieses Fragment wird durch Intramembranproteolyse des Gamma-Sekretase-Komplexes in eine intrazelluläre Domäne (ICD) gespalten. Die Intramembranproteolyse von IL-1R2 konnte durch einen hochspezifischen Gammasekretase-Inhibitor gehemmt werden und fehlte in Gamma-Sekretase-defizienten embryonalen Mausfibroblasten. Überraschenderweise erhöhen die Beta-Sekretase BACE1 und ihr Homolog BACE2 die Sekretion von IL-1R2, welche zu ähnlich großen C-terminalen Fragmenten wie auch bei der Alpha-Spaltung von IL-1R2 führen. Dies könnte bedeuten, dass beide Proteasen als alternative Alpha-Sekretasen agieren könnten. Darüber hinaus werden zahlreiche andere Membranproteine, die in dieser Arbeit untersucht wurden, nicht durch BACE1 und BACE2 geschnitten, was zeigt, dass beide Proteasen nicht am generellen Membranproteinumsatz beteiligt sind. Diese Arbeit zeigt, dass Il-1R2 und APP eine ähnliche proteolytische Prozessierung durchlaufen. Dies könnte somit eine Erklärung für die erhöhte Sekretion von IL-1R2 im Rahmen der Alzheimer Erkrankung sein.

Die protektive Wirkung von Immunsuppressiva auf den hepatischen I/R-Schaden deutet darauf hin, dass T-Zellen bei diesem alloantigen-unabhängigen Ereignis eine Rolle spielen. Die Mechanismen der Aktivierung bzw. der mikrovaskulären Rekrutierung von CD4+ T-Zellen bei alloantigen-unabhängiger I/R der Leber sind jedoch weitgehend ungeklärt. Ziele der vorliegenden Arbeit waren daher (1) die Rekrutierung von T-Zell-Subopulationen in den postischämischen hepatischen Mikrogefäßen in vivo zu untersuchen, (2) die Mechanismen einer Interaktion von CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R zu analysieren, (3) die Rolle von CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens zu beurteilen, (4) zu untersuchen, ob die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen MHC Klasse II-abhängig stattfindet und (5) zu analysieren, ob CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R mit Kupffer-Zellen interagieren. In der vorliegenden Studie konnte erstmals in vivo der Typ, die mikrovaskuläre Lokalisation und die Kinetik der Lymphozyten-Endothelzell-Interaktion während hepatischer I/R intravitalmikroskopisch charakterisiert werden. So konnte gezeigt werden, dass insbesondere CD4+ T-Zellen, und nicht CD8+ T-Zellen, während I/R in der hepatischen Mikrozirkulation akkumulieren. Diese Akkumulation tritt hauptsächlich in den Sinusoiden auf, nur zu einem geringeren Teil in den postsinusoidalen Venolen. Bereits nach 30-minütiger Reperfusion ist gegenüber der schein-operierten Gruppe eine signifikante Zunahme der Anzahl akkumulierter CD4+ T-Zellen in den Mikrogefäßen der Leber zu beobachten, die Anzahl emigrierter CD4+ T-Zellen nimmt im Verlauf der Reperfusionszeit signifikant zu. Im Rahmen der Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens beteiligt sind. Über CD40L- und CD28-abhängige Signalwege ist die postischämische Akkumulation von Thrombozyten und Leukozyten in der hepatischen Mikrozirkulation von CD4+ T-Zellen abhängig. Darüber hinaus wird die Ausbildung des mikrovaskulären Schadens, gemessen anhand des sinusoidalen Perfusionsdefizites, sowie die Ausbildung des hepatozellulären Schadens, gemessen anhand der hepatischen Transaminasen, CD40L- und CD28-abhängig über CD4+ T-Zellen mediiert. Mittels simultaner Visualisierung zweier Zellpopulationen in vivo konnte in dieser Dissertations¬schrift erstmals nachgewiesen werden, dass CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R kolokalisieren. Unter Verwendung P-Selektin- und CD40L-defizienter Mäuse konnte in vivo nachgewiesen werden, dass eine feste Adhärenz zwischen Thrombozyten und CD4+ T-Zellen über P-Selektin und PSGL-1 vermittelt wird, während die kostimulatorischen Moleküle CD40 und CD40L eine reziproke Aktivierung unter Thrombozyten und CD4+ T-Zellen bedingen. In einem weiteren Abschnitt dieser Studie konnte unter Verwendung von blockierenden Antikörpern schließlich erstmals in vivo gezeigt werden, dass die im Rahmen der hepatischen I/R stattfindende Aktivierung von CD4+ T-Zellen MHC-Klasse II-unabhängig abläuft. Schließlich wurde in einem weiteren Abschnitt dieser Dissertationsschrift erstmals in vivo nachgewiesen, dass eine reziproke Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R vorliegt. Die Anzahl postischämisch akkumulierter CD4+ T-Zellen ist nicht nur nach vollständiger Depletion von Kupffer-Zellen, sondern auch nach selektiver Unterbindung der Signalwege über TNF-α und IL-6 sowie des Abfangens freier Sauerstoffradikaler signifikant vermindert. Vice versa konnte hier Anhand der Untersuchung der Phagozytoseaktivität von Kupffer Zellen mittels Latex-Beads gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen die Aktivität von Kupffer-Zellen beeinflussen. Weitergehende Untersuchungen zur reziproken Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen konnten unter Verwendung von Durchflusszytometrie zeigen, dass proinflammatorische Mediatoren wie TNF-α und IL-6, vornehmlich freigesetzt durch Kupffer-Zellen während hepatischer I/R, nicht nur direkt aktivierend auf CD4+ T-Zellen wirken, sondern auch sinusoidale Endothelzellen aktivieren können. Eine Aktivierung der sinusoidalen Endothelzellen mit entsprechender Alteration der Expression von Adhäsionsmolekülen, wie z.B. ICAM-1, VCAM-1 und VAP-1 stellt wiederum einen pathophysiologischen Mechanismus dar, der mit einer konsekutiven Verstärkung der Akkumulation von CD4+ T-Zellen nach I/R verbunden ist. Zusammenfassend weisen diese in vivo Daten darauf hin, dass hepatische I/R die Akkumulation und Emigration von CD4+ T-Zellen, jedoch nicht von CD8+ T-Zellen induziert. Adhärente CD4+ T-Zellen sind in Sinusoiden mit Thrombozyten kolokalisiert; dies lässt eine gegenseitige Aktivierung beider Zelltypen durch direkten Zellkontakt oder über die Aktivierung des Endothels vermuten. Eine CD4 T-Zell-Defizienz geht mit einer Verminderung der postischämischen Thrombozytenakkumulation und mit einer Reduktion des mikrovaskulären I/R-Schadens einher. Die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen in hepatischen Mikrogefäßen wird durch Kupffer-Zellen, wahrscheinlich über die Freisetzung von Sauerstoffradikalen, TNF-α und IL-6, vermittelt.

Deregulation of the cell cycle regulator cyclin D1 in a wide variety of tumors has highlighted the role of cell cycle alterations in cancer. Genomic amplifications, mutations or balanced chromosomal translocations involving this gene are believed to lead to its aberrant overexpression in tumors. Somatic mutations in the 3’UTR of cyclin D1 gene have been reported in breast cancer, neuroblastoma and mantle cell lymphoma patients although their contribution to the cyclin D1 deregulation is unclear. In our study, we confirmed a regulatory role of the 3’UTR in cyclin D1 expression. Our results demonstrated that deletion of the cyclin D1 3’UTR significantly alters cyclin D1 protein expression and function. Similarly, the introduction of mutations observed in MCL patients in the cyclin D1 3’UTR significantly increased the expression of the cyclin D1 protein. These results underline that in malignancies such as MCL, truncation of the 3’UTR due to genomic deletions or somatic mutations is a likely cause of cyclin D1 overexpression. In order to ascertain whether the deletion of the cyclin D1 3’UTR could impart proliferative properties to cells, thereby contributing to transformation, we assessed the phenotype of fibroblasts retrovirally transduced with cyclin D1 with or without the 3’UTR. Interestingly our results demonstrated marked changes in cyclin D1 function upon deletion of the cyclin D1 3’UTR. Cells expressing cyclin D1 without the 3’UTR proliferated significantly more than those expressing the full length cyclin D1. Similar results were observed in rat ileum epithelial cells which lack the endogenous cyclin D1. Thus our data confirm that the deletion of the 3’UTR confers a proliferative advantage to cells. Furthermore, in this dissertation, we focused on the different potential regulatory elements of the cyclin D1 3’UTR to assess their role in controlling cyclin D1 expression. We reasoned that elements in the 3’UTR that are responsible for the controlled expression of the cyclin D1 protein are lost in 3’UTR deleted tumors. Therefore, it would be interesting to specifically pinpoint the role of these elements and highlight their contribution to cyclin D1 protein expression. It is assumed that since AU-rich elements (AREs) in the 3’UTR of cyclin D1 could have a potential destabilizing effect on the cyclin D1 mRNA, their loss could contribute to the observed overexpression of cyclin D1. Importantly, using highly sensitive reporter assays, we showed that the targeted loss of AREs from an otherwise intact 3’UTR leads to a decrease in reporter expression. These results demonstrate that the loss of these cis-acting elements in 3’UTR deleted tumors cannot account for cyclin D1 overexpression and there must be additional factors involved. Using bioinformatic analysis, we identified putative binding sites for microRNAs, small regulatory non-coding RNAs that have been shown to have important roles in cancer. Our study confirmed that microRNAs of the miR-15/16 family and the miR-17-92 cluster directly target the cyclin D1 gene through post-transcriptional regulation. These microRNAs have been shown to be involved in a cell cycle regulation and in a number of malignancies, especially in B-cell lymphoma. The various forms of cyclin D1 generated by deletions or mutations in the 3”UTR of cyclin D1 in tumors exclude these microRNA binding sites. Taken together, our results demonstrate a regulatory role for the 3’UTR in cyclin D1 expression and function. We show that the deletion of the cyclin D1 3’UTR leads to cyclin D1 overexpression and confers a proliferative advantage to cells. Finally, our results characterize the regulators functions of the different cis and trans-acting elements of the cyclin D1 3’UTR and identify this region as a bona fide target of cell cycle regulatory microRNAs. Extending these findings to other oncogenes, it is conceivable that the escape of 3’UTR mediated regulation by the acquisition of additional mutations of this region is an under-appreciated mechanism in the pathogenesis of cancer.

Episodic memory, i.e. memorization of information within a spatiotemporal environment, is affected by Alzheimer's disease (AD) but its loss may also occur in the normal aging process. The purpose of this study is to analyze and evaluate episodic memory in patients with AD by examining their cognitive skills in episodic memory through the introspection technique. A new method was used, wherein we assessed mental images of the subject's own past recalled in the mind like projected pictures and movies. Experiment 1 is designed to determine the effect and process of normal and pathological aging on cognitive skills in episodic memory using the introspection technique. Two groups were observed towards this purpose: 21 patients with AD and 19 normal control subjects. All subjects were chosen from ages from 55 to 70 and were administered standardized neuropsychological tests (K-DRS and MMSE-K). All subjects were asked to retrieve their episodic memory of the previous day, week, month, and a day remote from testing day. The answers were analyzed, focusing on their specific features such as emotional state, color, and time order. In the following day, the subjects were tasked to recall again all images that they reproduced in the previous day's test in order to observe impairment of anterograde memory. Results showed that patients failed to arrange the retrieved images in time order and their images of the previous day were unclear in color and were stationary like photographs, even when they reproduced the mental images at as much quantity as controls. They also could not remember particular events of yesterday, only their general occurrence. These results suggest that in the early stage of AD, difficulties in the retrieval of recent episodic memory begin to occur, and qualitative impairment happens earlier than quantitative. The third chapter supports these results with further evidence, analyzing from a clinical viewpoint 3 patients with AD, 1 patient with mild depression and 2 controls. In Experiment 2 the emotional intensity of episodic memory within different categories of memory (yesterday, week, month, and remote) was investigated by comparing healthy elderly people and AD patients. The subjects’ voice intonations were estimated by 8 valuators. As a result, the emotional intensity of AD patient was evaluated lower than controls. It appears that patients in the early stage of AD are impaired in the ability to express emotions during emotional episodic memory retrieval compared to healthy elderly adults.