Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 09/19 Archiv

Das Mammakarzinom ist eine Tumorerkrankung mit einem sehr heterogenen Krankheitsverlauf. Um den individuellen Krankheitsverlauf einer Patientin besser vorhersagen zu können und um individuelle Therapieentscheidungen treffen zu können, bedarf es prognostischer und prädiktiver Faktoren. Neben den etablierten Prognosefaktoren Tumorgröße, Lymphknotenstatus, Metastasierung und Grading werden momentan verschiedene biologische Faktoren untersucht. Darüber hinaus wird in letzter Zeit insbesondere die prognostische Bedeutung von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark diskutiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die prognostische Relevanz von den biologischen Faktoren HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 sowie deren Korrelation mit dem Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark bei Patientinnen mit Mamma-CA zu evaluieren. Insgesamt wurden Gewebeproben von 256 primären Mammakarzinomen mit bekanntem Knochenmarkstatus untersucht. Zunächst wurden aus den archivierten Gewebeblöcken sogenannte Tissue-Micro-Arrays (TMAs) hergestellt. An diesen TMAs wurde die Expression von HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen analysiert. Zusätzlich wurde das Tumorgewebe auf eine potentielle Genamplifikation von HER2 und Topoisomerase-IIalpha mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hin untersucht. Es stellte sich heraus, dass die meisten dieser biologischen Faktoren untereinander korrelieren. Darüber hinaus konnte eine signifikante Korrelation zwischen der Überexpression von HER2 und einem kürzerem krankheitsfreien Überleben der Patientinnen nachgewiesen werden. Weitere Korrelationen zwischen den einzelnen Faktoren und dem Krankheitsverlauf wurden nur in einigen Subgruppen gefunden. Keiner der untersuchten Faktoren stellte sich jedoch als unabhängiger prognostischer Faktor bezüglich eines kürzeren krankheitsfreien bzw. metastasenfreien Verlaufs oder eines kürzeren Gesamtüberlebens heraus. Diese Ergebnisse deuten daher lediglich auf einen kausalen Zusammenhang zwischen den von mir untersuchten Tumorsuppressormolekülen, Proliferationsmarkern und Wachstumsfaktorrezeptoren hin. Die Expression von HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 auf dem Primärtumor korrelierte nicht mit dem Vorhandensein von Tumorzellen im Knochenmark. Die Dissemination von Tumorzellen ins Knochenmark scheint daher ein von den untersuchten Faktoren unabhängiger Prozess zu sein. Allerdings korrelierte der Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark mit einem kürzeren Gesamtüberleben der Patientinnen. Bisher gehört die Knochenmarkspunktion zwar nicht zur Routinediagnostik beim primären Mammakarzinom. Allerdings wird diese Untersuchung in einigen Zentren empfohlen. Die weitere Charakterisierung von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark sowie die Evaluation von zirkulierenden Tumorzellen im peripheren Blut sind Gegenstand der aktuellen Forschung.

Beim Multiple Myelom sind die Myelomzellen hauptsächlich im Knochenmark lokalisiert, wo sie akkumulieren und durch ihr verdrägendes Wachstum zur Knochendestruktion und Beeinträchtigung der Hämatopoese führen. Die Wechselwirkung zwischen Myelomzellen und Knochenmarkmicroenvironment ist für die Pathogenese und Pathophysiologie des Multiplen Myeloms von entscheidender Bedeutung. In den letzten Jahren haben sich Hinweise gehäuft, dass durch direkten Zell-Zell-Kontakt zwischen Myelomzellen und Knochenmarkstromazellen die Empfindlichkeit der Myelomzellen gegenüber Zytostatika reduziert wird. Die zelladhäsionsvermittelte Chemoresistenz stellt in der Therapie des Multiplen Myeloms eine große Herausforderung dar. Die Fähigkeit der Bisphosphonate, die osteoklastäre Aktivität zu hemmen, hat sie zu einem festen Bestandteil der Myelomtherapie gemacht. Bisphosphonate und Statine greifen in den Mevalonatsignalweg ein und hemmen diesen an unterschiedlichen Stellen. In der Literatur wird beschrieben, dass in adhärenten, de novo resistenten Zellen die HMG-CoA-Reduktase hoch reguliert wird. Basierend auf diesem Phänomen wurde Simvastatin bezüglich einer potentiellen Antimyelomwirkung getestet. Tatsächlich konnte gezeigt werden, dass Statine antiproliferativ wirken und in Myelomzellen Apoptose induzieren. Darüber hinaus überwinden sie im Kokulturmodell die zelladhäsionsvermittelte Chemoresistenz. Dabei wirken Statine in der Kokultur über eine Hemmung des HMG-CoA-Reduktase/GG-PP/Rho/Rho-Kinase-Signalweges. Obwohl bekannt ist, dass Bisphosphonate mit dem Mevalonatsignalweg interferieren, zeigten sie weder in der Monokultur noch in der Kokultur einen Antimyelomeffekt. Da Dosiserhöhungen im Menschen aufgrund der damit einhergehender Nebenwirkungen nicht möglich sind, wurde in der vorliegenden Arbeit Zoledronsäure in Kombination mit Simvastatin in niedrigen, klinisch einsetzbaren Dosen verabreicht. In dieser Zusammensetzung zeigten sie einen synergistischen proapaoptotischen Effekt sowohl in der Monokultur als auch in der Kokultur. Die erhobenen Daten können in der Therapie des Multiplen Myeloms als Grundlage für eine Kombinationschemotherapie aus Bisphosphonaten und Statinen dienen. Die Blockade von CAM-DR durch eine kombinierte Verabreichung von Bisphosphonaten und Statinen könnte auch bei anderen Tumorentitäten zu besseren Therapieergebnissen führen.

Das kleine Hitzeschockprotein αB-Crystallin ist in vielen verschiedenen Gewebetypen u.a. in der Niere nachweisbar. Es wird sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen exprimiert. Viele verschiedene Stressfaktoren induzieren in den betroffenen Zellen die Expression von αB-Crystallin, das – wie viele andere Hsps - als molekulares Chaperone die Zellen vor sonst letalen Umgebungseinflüssen schützt. Dies wird bewerkstelligt, indem es partiell oder komplett entfaltete, fehlgefaltete oder aggregierte Polypeptide bindet und deren native Konformation wiederherstellt, oder bei irreversibler Schädigung dem lysosomalen Abbau zuführt. Im Nierenmark stellen hohe extrazelluläre Konzentrationen an NaCl und Harnstoff, die im Rahmen der Harnkonzentrierung das interstitielle Milieu prägen, die größte Bedrohung für die Zellen der medullären Nephronanteile dar. Wie vorliegende Untersuchungen zeigen, exprimieren die Zellen der medullären Sammelrohre und der dünnen Schenkel der Henle-Schleife αB-Crystallin konstitutiv sehr stark und es macht im Innenmark etwa 2% des gesamten Zellproteins aus. Im Nierenkortex ist αB-Crystallin hingegen kaum nachweisbar. Da die αB-Crystallin Expression parallel zum osmotischen Gradienten vom Nierenkortex zum Innenmark ansteigt und in Diurese im Nierenmark signifikant abfällt, kann man davon ausgehen, dass die αB-Crystallin Expression wesentlich durch die interstitielle Osmolalität reguliert wird. Diese Annahme wird durch die vorliegenden in-vitro-Versuche mit MDCK-Zellen unterstützt, die zeigen, dass αB-Crystallin durch hypertonen Stress induzierbar ist. Interessanterweise führt auch eine erhöhte extrazelluläre Harnstoffkonzentration zur αB-Crystallin Induktion. αB-Crystallin wird daher vermutlich über andere Regulationsmechanismen induziert als beispielsweise Hsp72, ein gut untersuchtes Hsp in der Niere und TonEBP-Zielgen, welches durch erhöhte Harnstoffkonzentrationen nicht induzierbar ist. Dafür spricht auch, dass bei der Induktion von αB-Crystallin die JNK MAP-Kinase eine Rolle spielt und nicht die p38 MAP-Kinase, die an der Expression vieler anderer durch Hypertonizität induzierbarer Gene, u.a. Hsp72, beteiligt ist. Interaktionen zwischen αB-Crystallin und Stukturen des Zytoskeletts konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass αB-Crystallin im Rahmen der Harnkonzentrierung eine bedeutende Funktion für die Zellen im Innenmark der Niere zukommt und dass dessen Expression nicht nur durch hypertonen Stress, sondern auch durch hohe Harnstoffkonzentrationen und vermutlich mehrere andere Stressfaktoren im Nierenmark reguliert wird.

The goal of this project was the characterisation of a new guanine nucleotide exchange factor (GEF protein) for Rac GTPases in Dictyostelium discoideum. GEF proteins function as stimulating proteins of Rac GTPases which are of central importance in the regulation of actin-involving processes. Actin is a major component of the cytoskeleton, constituting a dynamic network of filamentous structures which provide the basis for elementary tasks of growth, differentiation, cell movement and cell division. The ameba D. discoideum is a haploid unicellular eukaryote. It serves as a model organism to study basic actin-involving processes in higher organisms. The D. discoideum genome has been fully sequenced recently and comprises a wide range of regulatory components for the actin cytoskeleton. The gene of a novel GEF protein with a coding sequence of 3597 bp was studied in detail. The gene was cloned and the sequence verified. The protein sequence of 1198 amino acids comprises three Calponin homology domains (CH) and one Dbl homology/Pleckstrin homology tandem domain which is a typical sequence feature of GEF proteins. On the basis of this domain architecture the protein was named 'Trix' in short for 'triple Calponin exchange factor'. The CH domains were classified as type 1 and type 1 CH domain (type 3 - type 3 - type 1). This resembles a novel combination of CH domains in a Rho GEF protein. A recombinant fragment carrying the three CH domains was shown to bind and bundle actin filaments which is not explained by the functions that have been described for CH domains so far. In vivo Trix is localised in the area of the actin-rich cell cortex as well as on the membranes of late endocytic vesicles. This suggests a regulatory role for Trix in the assembly or the disassembly of the actin coat that is associated with endocytic vesicles during the late stages of endocytosis. It was shown that Trix is mainly expressed during the vegetative stadium of D. discoideum which would be consistent with the increased endocytosis during growth. An association of Rac GTPases with late endocytic vesicles in D. discoideum was not described so far. Trix displayed no GDP/MANT-GDP exchange activity with the Rac GTPases Rac1a, RacC and RacE, hence the protein could not be allocated to a Rac GTPase signaling pathway. Some of the interactions between exchange factors and their respective Rac GTPases are of a very specific nature. Thus a potential activity of Trix might be directed against a Rac GTPase that has not yet been tested. The activation of Trix might also depend on further uncharacterised regulatory components. Finally, the results of the in vitro assays might differ from the in vivo situation as it has been demonstrated for other Rho GEFs. The Trix gene was disrupted in AX2 wildtype cells by a gene replacement approach. This allowed detailed characterisation of the protein's function in vivo. Trix is not an essential protein. There were no significant differences in the expression of important marker proteins, in phototaxis, chemotaxis, phagocytosis, cytokinesis, and growth of Trix- mutants. The mutant cells showed subtle changes in the organisation of the actin system as well as a slight delay during the developmental cycle. The most severe phenotypic deviation displayed by Trix- mutants consisted in a marked reduction of exocytosis. This provides further evidence for a regulatory function of the protein in exocytosis. The data suggest that Trix plays a role in the organisation of actin-involving processes in D. discoideum, especially in the regulation of the late endocytic cycle. Trix could not be allocated to a specific Rac GTPase signaling pathway and definite structural or dynamic tasks on the basis of the protein’s actin-binding and actin-bundling properties. The subtle phenotypic alterations in Trix- mutants might be due to a general redundancy in the functions of D. discoideum Rho GEF proteins.

Aussiedler und jüdische Kontingentflüchtlinge (GUS-Immigranten) aus der Gemeinschaft Unabhängiger Staaten (GUS) bilden in Deutschland eine der größten Immigrantenpopulationen. Im Zeitraum zwischen 1991 und 2005 wurden über 2 Mill. GUS-Immigranten in Deutschland aufgenommen. Seit 2001 entwickelt sich eine HIV-Epidemie in den GU-Staaten, in denen Ukraine, Russische Föderation und Moldawien am meisten betroffen sind. Es fehlen bis jetzt die Untersuchungen über das Wissen hinsichtlich der HIV-Infektion und –Prävention sowie über die Einstellung zum Thema HIV/AIDS bei den GUS-Immigranten, was in der Zeit der hohen HIV-Prävalenz in ihren Herkunftsländern und laufender Aufnahme in Deutschland sehr aktuell erscheint. Ziel dieser kontrollierten Pilotstudie war das Wissen und die Einstellung zum Thema HIV/AIDS und HIV-Prävention, Informationsquellen, mögliches Verhalten beim Verdacht auf eine HIV-Infektion oder bei diagnostizierter HIV-Infektion bei den GUS-Immigranten zu untersuchen. 1.205 GUS-Immigranten im Alter zwischen 16 und 65 Jahren wurden mittels anonymer postalischer Befragung in München und in Bayern befragt und 6 HIV-positive bzw. STD-kranke GUS-Immigranten interviewt. 448 deutschsprachige Patienten der dermatologischen Allgemeinambulanz der Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Allergologie der Ludwig-Maximilians-Universität München (LMU) wurden anonym in der allgemeinen Poliklinik (als Kontrollgruppe) zu gleichen Themen befragt. Es wurde ein vierstufiger HIV/AIDS-Risikowissensindex (HIV/AIDS Transmission through Sex and Intravenous Drug Use, HATSIDU) zum Untersuchen des Wissens über das Risikoverhalten in Bezug auf HIV-Übertragung und Schutz vor einer HIV-Infektion beim Sexualkontakt und beim intravenösen Drogengebrauch ausgearbeitet. Es wurde festgestellt, dass mehr GUS-Immigranten (22,7 %) im Vergleich zur Kontrollgruppe (12,8 %) ihre Informiertheit über HIV/AIDS als schlecht einschätzten. Die GUS-Immigranten waren sehr gut über HIV-Übertragung durch Spritzen/Nadeln (96,5 % der richtigen Antworten) und Vaginalverkehr (83,4 %) informiert. Es fehlte ihnen aber das Wissen über HIV-Übertragung durch Anal- (67 %) und Oralverkehr (49,7 %). Außerdem glaubte ein erheblicher Teil (bis zu 30 %) der GUS-Immigranten an verschiedene HIV-Übertragungsmythen. Kondom und Einmalspritzen/-nadeln als Schutz vor einer HIV-Infektion waren bei den GUS-Immigranten sehr gut bekannt (entsprechend 91,8 % und 81,5 % der richtigen Antworten). Trotzdem war der Mittelwert des HIV/AIDS-Risikowissensindex (HATSIDU) bei den GUS-Immigranten (HATSIDU-Mittelwert 2,44) signifikant (p < 0,05) niedriger als in der Kontrollgruppe (HATSIDU-Mittelwert 2,84) und vom Alter, der Ausbildung und dem sozialen Status abhängig. So wurde der höchste HIV/AIDS-Risikowissensindex bei 40-49jährigen GUS-Immigranten mit einem Universitätsabschluss und bei Studenten festgestellt. Der niedrigste HIV/AIDS-Risikowissensindex war bei 60-65jährigen GUS-Immigranten mit einer 8-jährigen Schulausbildung und bei Rentnern zu beobachten. Der HIV/AIDS-Risikowissensindex war bei den Aussiedlern von der Aufenthaltsdauer abhängig: vor kurzem Eingereiste waren besser über HIV-Infektion und –Prävention informiert als die länger in Deutschland Lebenden. Geschlecht, Familienstatus, Herkunftsland und Religion spielten dabei keine Rolle. Die Interviews mit den HIV-positiven und STD-kranken GUS-Immigranten haben gezeigt, dass das Thema HIV/AIDS in dieser Immigrantengruppe tabuisiert ist, dass HIV-Positive Angst vor sozialer Zurückweisung und Diskriminierung haben, und dass die GUS-Immigranten die HIV-Gefahr nicht wahrnehmen. Die Unkenntnis der HIV-Übertragungswege schafft ein diskriminierendes und stigmatisierendes Umgehen mit den HIV-Positiven, was erhebliche Störfaktoren sowohl bei der HIV/AIDS-Präventionsarbeit, als auch bei der medizinischen, psychologischen Betreuung und Beratung von HIV-positiven GUS-Immigranten darstellen. Konventionelle HIV/AIDS-Präventionsbotschaften in Deutschland bleiben oft von den GUS-Immigranten nicht bemerkt, oder sie können wegen mangelnder Deutschkenntnis nur begrenzt verstanden werden. Es sollten die HIV-Präventionsbotschaften über HIV-Übertragung durch Anal- und Oralverkehr sowie die Aufklärung bezüglich der HIV-Übertragungsmythen den GUS-Immigranten vermittelt werden. In diesem Forschungsprojekt wurden zum ersten Mal die wissenschaftlichen Erkenntnisse über das Wissen zum Thema HIV/AIDS bei den Aussiedlern und jüdischen Kontingentflüchtlingen in Deutschland gewonnen. In Anbetracht der HIV-Epidemie in GUS, laufender Immigration sowie zunehmender beruflicher Migration aus GUS nach Deutschland, ist es zu erwarten, dass die Zahl der HIV-positiven GUS-Immigranten und –Migranten sowie die Aktualität des Themas HIV/AIDS in dieser Population in Deutschland zunehmen wird.

Seit Beginn der 1990er Jahre sind protektive Wirkungen von Tacrolimus auf Ischämie-Reperfusionsschäden der Leber bekannt. Die in bisherigen experimentellen Arbeiten beschriebene Spenderpräkonditionierung erscheint jedoch wegen potenzieller Nebenwirkungen klinisch nicht umsetzbar. Eine amerikanische Arbeitsgruppe konnte dabei in einer klinischen Pilot-Studie zeigen, dass die Spülung humaner Lebern mit Tacrolimus (20ng/ml) vor Implantation zu einer signifikanten Reduktion von Ischämie-Reperfusionsschäden nach Lebertransplantation führte. Unsere Arbeitsgruppe hat umfangreiche Untersuchungen mit Glutathion als Therapeutikum von Ischämie-Reperfusionsschäden nach warmer und kalter Ischämie durchgeführt. Gleichzeitig scheint, dass intrazelluläres Glutathion bei Anwesenheit hoher Konzentrationen von ROS über die Induktion von Radikalkettenreaktionen beziehungsweise die Thiolierung anderer Proteine selbst als Mediator von Ischämie-Reperfusionsschäden fungieren kann. In Vorarbeiten untersuchten wir die Wirkung von Tacrolimus im isoliert-perfundierten Modell der Rattenleber. Die Vorbehandlung mit Tacrolimus bewirkte bei Zufuhr von H2O2 eine Verringerung des ROS-induzierten zellulären Schadens, ausgedrückt in einer dosisabhängigen, signifikanten Verringerung des LDH-Efflux. Als Ursache hierfür wird eine verminderte intrazelluläre Akkumulation von zytotoxischem GSSG diskutiert, das nach Tacrolimus-Gabe vermehrt in Galle und Blut freigesetzt wurde, während die Aktivität der an Bildung und Abbau von GSH/GSSG beteiligten Enzyme Katalase, GSH-Peroxidase und GSSG-Reduktase unverändert war. Dieser Effekt konnte durch Gabe des p38 MAPK Inhibitors SB203580 imitiert werden. Wir übertrugen daraufhin das Konzept der Tacrolimus-Rinse in das Modell der arterialisierten, orthotopen Lebertransplantation an der Ratte. Die Spülung der Leber (20ml) mit Tacrolimus unmittelbar vor Implantation in den Empfängerorganismus führte zu einer signifikanten Reduktion des Ischämie-Reperfusionsschadens, gemessen in Transaminasen, LDH sowie Gallefluss. Das höchste Ausmass an Zytoprotektion wurde durch eine Tacrolimus-Konzentration von 10 ng/ml erreicht, wobei die protektive Wirkung der Tacrolimus-Rinse in der 10 ng-Gruppe stärker ausgeprägt war als in der 50 ng-Gruppe. Die Ursachen für diese inverse Dosis-Wirkungsbeziehung sind unklar, zumal keine statistische Signifikanz zwischen den beiden Gruppen besteht. Außerdem fehlen bislang systematische Untersuchungen zur optimalen Tacrolimus-Dosis in dieser Versuchsanordnung. Als Wirkmechanismus der Tacrolimus-Rinse postulieren wir - aufbauend auf Voruntersuchungen im isoliert perfundierten Modell und den erhobenen in-vivo-Daten - Veränderungen der zellulären Glutathionhomöostase: Hepatozyten setzten im Modell der Lebertransplantation nach Tacrolimus-Rinse vermehrt zytotoxisches GSSG in Blut und Galle frei, wodurch ROS-vermittelte Zellschäden während der Reperfusion minimiert werden. Zusammenfassend kann aufgrund der bisherigen Untersuchungen gezeigt werden, dass die Tacrolimus-Rinse eine neue und klinisch praktikable Therapieoption von Ischämie-Reperfusionsschäden der Leber darstellen könnte.