Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/07 Archiv

Als ein vom Menschen stark beeinflusstes und freizeitlich genutztes Ökosystem sind städtische Grünflächen in Hinblick auf zeckenübertragene Krankheiten von besonderem wissenschaftlichem Interesse. Zu diesem Zweck wurden Zecken monatlich über zwei Jahre in insgesamt neun verschiedenen Parks in fünf bayerischen Städten mit der Flaggmethode gesammelt und die Zeckendichte(Adulte und Nymphen/100m²) ermittelt. Neun Standorte wurden 2009 mittels spezifischer konventioneller und real-time PCRs auf die Anwesenheit von DNA von Babesia spp., A. phagocytophilum, Rickettsia spp.und Bartonella spp. untersucht sowie fünf ausgewählte Standorte zusätzlich auf Babesia spp. und A. phagocytophilum in 2010. Speziesdifferenzierungen wurden mittels Sequenzanalyse und Abgleich der amplifizierten PCR-Produkte mit der GenBank vorgenommen. Es wurden insgesamt 13.403 I. ricinus sowie jeweils eine I. frontalis und I. hexagonus gefangen. Die Zeckendichte variierte zwischen 15 - 53 Zecken/100m² in 2009 bzw 15 - 35 Zecken/100m² in 2010 abhängig vom untersuchten Standort. Eine Stichprobe von 6.593 Zecken (5.569 für A. phagocytophilum) wurde untersucht mit folgenden Ergebnissen: Babesia spp.(2009: 0,4% mit einem Larvenpool (Lp) à 2 Larven; 2010: 0,5-0,7% mit einem Lp à 5 Larven); A. phagocytophilum (2009: 9,5%; 2010: 6,6%); Rickettsia spp. (2009: 6,4-7,7% mit 76 Larven in 16 Lps). Sequenzanalysen ergaben die Anwesenheit von Babesia sp. EU1 (n= 25), B. divergens (n= 1), B. divergens/capreoli (n= 1), B. gibsoni-like (n= 1), R. helvetica (n= 272), R. monacensis strain IrR/Munich (n= 12) und R. monacensis (n= 1). Die Anwesenheit von Bartonella spp konnte nicht nachgewiesen werden. Coinfektionen wurden in 0,7% aller untersuchten Zecken in 2009 festgestellt. Eine weiterführende Analyse positiver A. phagocytophilum-Proben bezüglich des 16S rRNA-Gens ergab sechs verschiedene Sequenzvarianten, von welchen schon zwei mit Erkrankungsfällen im Menschen assoziiert wurden. Prävalenzschwankungen zwischen Jahren und Standorten sowie ein außergewöhnliches Speziesauftreten von Babesia spp. zeigen, dass das Vorkommen von zeckenübertragenen Pathogenen von einer Vielzahl biotischen und abiotischen Faktoren abhängig sein kann und das Habitat „Stadtpark“ dabei eine besondere Stellung einnimmt.

Die Mastitis des Rindes ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzeltiererkrankung in der Milchwirtschaft. Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) zählen zu den wichtigsten Mastitiserregern, die jedoch zumeist sehr unterschiedliche Krankheitsbilder hervorrufen. So verursacht E. coli hauptsächlich transiente, akute klinische Mastitiden, während S. aureus als bedeutendster Verursacher chronischer bis subklinischer Mastitiden mit persistierendem Verlauf angesehen wird. In den letzten Jahrzehnten wurde die Pathophysiologie der entzündeten Milchdrüse eingehend wissenschaftlich bearbeitet. Frühe Zeitpunkte einer intramammären Infek-tion, zu denen die Pathogene zwar bereits erkannt wurden, aber noch keine klinischen Symptomen in Erscheinung getreten sind, wurden bislang in vivo noch nicht untersucht. Zu den ersten wirtsseitigen Ereignissen nach dem Eindringen und Erkennen der Patho-gene zählen Veränderungen in der Abundanz von mRNA-Transkripten immun-relevanter Gene. Vertreter dieser differentiell exprimierten Gene gehören z.B. zu den Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptiden. Diese sollen es dem Wirt ermöglichen, eine adäquate Immunantwort zu initiieren, welche als entscheidend für den klinischen Verlauf der Erkrankung gilt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Tiermodell zur Simulation der ersten 3 h nach dem Eindringen der Pathogene E. coli und S. aureus in das Euter etabliert. Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf der Untersuchung von Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene nach unterschiedlich langer Erregerexposition (1-3 h) in verschiedenen Kompartimenten der Milchdrüse. Dabei wurden die Lokalisationen Zitzenzisterne (ZZ), Drüsenzisterne (DZ) und das ventrale Euterparenchym (EU) näher untersucht. Großes Augenmerk lag auf einer strengen Standardisierung der Versuchs-tiere, um die Vergleichbarkeit der erzielten Ergebnisse sicherzustellen. Der Versuch umfasste 12 erstlaktierende Kühe der Rasse Holstein-Friesian mit makelloser Allgemein- und Eutergesundheit und einer Zellzahl < 50.000/ml Milch in allen 4 Eutervierteln. Bei den Tieren wurden 3 Euterviertel jeweils sequentiell über einen Zeitraum von 1, 2 und 3 h entweder mit 5*106 CFU E. coli1303 (n = 6) oder S. aureus1027 (n = 6) intrazisternal inokuliert. Ein Kontrollviertel blieb unbehandelt und diente der Ermittlung von Basisexpressionswerten. Mit Hilfe der unterschiedlich lange inokulierten Viertel konnte ein zeitlicher Verlauf der Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene extrapoliert werden. Wie erwartet traten innerhalb des dreistündigen Versuchszeitraumes keinerlei klinische Effekte bei den Versuchstieren auf. Die innere Körpertemperatur, der Leukozytengehalt im Blut, der SCC und verschiedene Milchinhaltsstoffe erfuhren keine Veränderungen, die auf die Pathogen-Exposition zurückzuführen waren. Durch wiederholte Unter-suchung von Milchproben im Versuchsverlauf wurde die bakterielle Vermehrung analysiert. Hierbei konnte eine Vervielfachung von E. coli um durchschnittlich das 30-fache festgestellt werden, wohingegen sich S. aureus innerhalb der ersten 3 h p. inoc. vergleichsweise schwach vermehrte (durchschnittlich 1,8-fach). Die beiden im Tiermodell verwendeten Bakterienstämme wurden parallel in vitro in Milch und in Nährmedium kultiviert, um deren Wachstum und Adaptationsfähigeit zu untersuchen. E. coli erreichte nach 14-stündiger Inkubation in Milch ein Maximum von 1,2*109 ± 2,5*108 CFU/ml (MW ± SD), während S. aureus mit 5,3*108 ± 8,9*108 CFU/ml (MW ± SD) eine deutlich schwächere und heterogenere Vermehrung zeigte. Im Anschluss an diese Vorinkubation in Vollmilch wurde untersucht, ob sich die Pathogene an das spezifische Wachstumsmedium Milch anpassen konnten. Nach Umsetzen in frische Vollmilch zeigten die Pathogene jedoch kein verbessertes und beschleunigtes Wachstum im Vergleich zu in standardisiertem Medium vorkultivierten Bakterien. Um die Vergleichbarkeit mit früheren Experimenten sicherzustellen, wurden E. coli und S. aureus deshalb mit Nährmedium für die in vivo-Versuche präpariert. Drei Stunden nach Inokulation des ersten Euterviertels wurden die Tiere getötet und Gewebeproben innerhalb von 20 min aus den drei zu untersuchenden Lokalisationen (ZZ, DZ, EU) der einzelnen Euterviertel gewonnen. Die Proben wurden unmittelbar nach Entnahme in Stickstoff schockgefroren und bis zur Aufarbeitung bei -80°C tiefgefroren. Im Rahmen weiterer Untersuchungen fand dann die mRNA-Extraktion sowie die Analyse der Transkript-Abundanzen entzündungsrelevanter Kandidatengene (IL6, TNF, CXCL8, CCL20, S100A9, LAP, LCN2, MX2 und CYP1A1) mittels qRT-PCR statt. Die Auswahl geeigneter Gene erfolgte sowohl anhand eines orientierenden Vorversuchs in vivo als auch anhand bekannter, in vergleichbaren in vitro-Experimenten regulierten Genen der Milchdrüsenepithelzelle. Es konnte gezeigt werden, dass die Expressionsänderungen nach Kontakt mit E. coli deutlich stärker und homogener ausfielen als nach Kontakt mit S. aureus. Bereits nach 1-stündiger Erregerexposition konnten signifikante Steigerungen der mRNA-Expression einiger Gene verzeichnet werden. Dies galt vor allem für die Chemokine CCL20 und CXCL8 sowohl nach Exposition mit E. coli, als auch mit S. aureus. Für die Zytokine IL6 und TNF konnte eine rasche mRNA-Expressionssteigerung nach 1-stündiger intramammärer Inokulation von E. coli nachgewiesen werden, während eine Regulation im Euter mit S. aureus inokulierter Tiere erst nach 2 h und vergleichsweise schwächer eintrat. Die antibakteriell wirkenden Faktoren S100A9 und LAP waren den Chemo-kinen und Zytokinen zeitlich nachgeschaltet, wurden aber nur nach Exposition mit E. coli deutlich hochreguliert. Im Gegensatz zu in vitro-Untersuchungen mit Milch-drüsenepithelzellen konnte für die Gene LCN2, MX2 und CYP1A1 keine nennenswerte Regulation nach Inokulation mit E. coli und S. aureus festgestellt werden. Des Weiteren fiel auf, dass die untersuchten Kandidatengene invariant stärker in ZZ und DZ heraufreguliert wurden, als im EU. Meist ähnelten sich ZZ und DZ in Stärke und Verlauf der Expressionsänderung. Im ventralen Euterparenchym dagegen konnte nach Inokulation von E. coli nur für die Gene IL6, TNF, CXCL8 und S100A9 eine vergleichsweise schwache, aber statistisch signifikante Steigerung der mRNA-Expression aufgezeigt werden. Nach Inokulation mit S. aureus konnte in dieser Lokalisation keine Hochregulation der untersuchten Kandidatengene festgestellt werden. Das in dieser Arbeit etablierte Tiermodell zeigt erstmalig in vivo die frühe patho-genspezifische und kompartimentabhängige Regulation immunrelevanter Gene im Eutergewebe der Milchkuh auf. Es bietet damit eine gute Basis für holistische Ansätze zur Untersuchung sehr früher Ereignisse bei der Wirt-Pathogen-Interaktion. Mittelfristig soll hiermit aufgeklärt werden, welche wirts- und pathogenseitigen Mechanismen zur Entstehung akuter und chronischer Mastitiden führen und welche Faktoren persistente Infektionen der Milchdrüse fördern oder verhindern. Detaillierte Kenntnisse über solche frühen Ereignisse ebnen den Weg, Ansätze für eine verbesserte Mastitis-Diagnostik, -Prophylaxe und -Therapie bei der bovinen Mastitis zu finden.

Hypothyreoidismus und Struma werden nicht nur beim Menschen infolge von Jodmangel beobachtet, sondern auch bei verschiedenen Tierarten - darunter auch das Rind. Obwohl zur Diagnosestellung Referenzwerte der Schilddrüsendimensi-on von Bedeutung sind, wurden diese bisher in der Rindermedizin noch nicht er-mittelt. Ziel der vorliegenden Studie war es, Grundlagen für die sonographische Vermes-sung der Schilddrüse von Kälbern zu erarbeiten, eine Beziehung zwischen sonographisch bestimmtem und tatsächlichem Volumen der Schilddrüsenlappen zu berechnen, Orientierungswerte für das Schilddrüsenvolumen klinisch unauffäl-liger Kälber zu ermitteln und den Einfluss von Körpermasse, Alter, Rasse und Geschlecht zu untersuchen. Außerdem sollten die T4-Konzentration der Proban-den untersucht werden. In die Untersuchung wurden 40 lebende und 43 tote Probanden im Alter von ≤ 3 Monaten der Rassen Deutsches Fleckvieh (n = 72), Deutsches Schwarz-buntes Rind (n = 5) und 6 Tiere anderer Rassen einbezogen. Bei allen Probanden wurde am Tag der Entlassung aus der Klinik bzw. am Tag der Euthanasie eine Sonographie der Schilddrüse durchgeführt. Es wurden die Dimensionen Länge (parallel zur Halsachse als kranio-kaudale Ausdehnung), Breite (senkrecht zur Halsachse als latero-mediale Ausdehnung) und Höhe (senkrecht zur Halsachse als ventro-dorsale Ausdehnung) jedes Schilddrüsenlappens bestimmt. Der komplette Messvorgang wurde bei jedem Probanden fünf Mal wiederholt. Bei euthanasierten Tieren wurde die Schilddrüse freipräpariert, mittels Schieblehre die Dimensionen vermessen und das Volumen durch die Wasserverdrängungsmethode ermittelt. Bei allen Probanden wurde Blut entnommen und T4-Konzentration im Serum be-stimmt. Aus den wiederholten Sonographiemessungen konnten folgende Variationskoeffi-zienten (Vk) für die Beschreibung der Präzision der unterschiedlichen Dimensio-nen ermittelt werden: Vk rechts Länge: 3,04 %, Vk links Länge: 3,97 %, Vk rechts Breite: 7,26 %, Vk links Breite: 7,34 %, Vk rechts Höhe: 3,89 % und Vk links Höhe: 3,21 %. Die Dimensionsmessungen ergaben für den rechten Schild-drüsenlappen (Mittelwert ± Standardabweichung): LS: 30,14 ± 2,96 mm, BS: 9,74 ± 1,48 mm und für HS: 22,11 ± 2,47 mm, für den linken Lappen: LS: 30,10 ± 3,60 mm, BS: 10,35 ± 1,71 mm und HS: 21,99 ± 2,73 mm. Zwischen Sonographie- und Schieblehremessungen (euthanasierte Tiere) ergaben sich folgende Korrelationskoeffizienten: rechter Lappen: rL = 0,80, rB = 0,10, rH = 0,79, linker Lappen: rL = 0,59, rB = 0,19, rH = 0,62. Zwischen mittels Wasserverdrängungsmethode bestimmten Volumen und aus den Sonographiemessungen ermittelten Werten konnte folgende Regressionsgleichung aufgestellt werden: VW [ml] = 0,632 x [(LS x BS x HS)rechter Lappen + (LS x BS x HS)linker Lappen] (L: Länge = kranio-kaudale Ausdehnung, B: Breite = latero-mediale Ausdehnung, H: Höhe = ventro-dorsale Ausdehnung). Zwischen dem sonographisch ermittelten absoluten Volumen und den Faktoren Alter, Geschlecht und Rasse bestand kein signifikanter Zusammenhang (p > 0,05), während zwischen dem sonographisch ermittelten Volumen (VSono) und der Kör-permasse (KM) eine lineare Beziehung (VSono [ml]= 4,397 + 0,071 x KM [kg]) berechnet werden konnte. Der Mittelwert der T4-Konzentrationen betrug 81,4 nmol/l mit einer Standardab-weichung von 33,4 nmol/l. Es bestand ein signifikanter Unterschied zwischen lebenden Tieren mit Entlassungsstatus „geheilt“ und euthanasierten Probanden hinsichtlich der T4-Konzentrationen. Die euthanasierten Kälber hatten niedrigere T4-Konzentrationen (64,9 nmol/l ± 57,3 nmol/l) als die mit Entlassungsstaus „ge-heilt“ (99,2 nmol/l ± 24,6 nmol/l mit p ≤ 0,001). Männliche Tiere zeigten signifi-kant niedrigere T4-Konzentrationen (90,2 nmol/l) als weibliche Kälber (103,0 nmol/l mit p = 0,019). Die vorliegende Arbeit beschreibt als erste Studie Orientierungswerte für die Vermessung und Volumenbestimmung der Schilddrüse mittels Sonographie bei Kälbern.