Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19 Archiv

Das Hyper-IgE-Syndrom (HIES) ist ein seltener primärer Immundefekt, charakterisiert durch die klinische Trias: chronisches Ekzem mit einem Gesamt-IgE über 2000 IU/ml im Serum, rezidivierende Infektionen (insbesondere Abszesse, Infektionen des Respirationstraktes wie Pneumonien mit Pneumatozelenbildung und Candidainfektionen) und skelettbezogene Symptome (vergröberte Gesichtszüge, Milchzahnpersistenz, Skoliose, Spontanfrakturen und Überstreckbarkeit der Gelenke). Durch das Auftreten von skelettbezogenen Symptomen neben der klassischen immunologischen Trias (rezidivierende Abszesse, rezidivierende Pneumonien und erhöhtes Gesamt-IgE) wird das HIES nach Grimbacher et al. heute als Multisystemerkrankung bezeichnet (Grimbacher et al. 1999a). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind Ätiologie und Pathogenese noch unbekannt, so dass Definition und Diagnosestellung nur anhand klinischer Parameter zu stellen sind. Ziel einer Kooperation mit einer Arbeitsgruppe der National Institutes of Health (NIH) in Bethesda, USA, war es einen molekulargenetischer Nachweis eines Gendefektes zu finden. In dieser Arbeit wurden 68 Patienten mit Anfangsverdacht auf ein HIES analysiert. Bei 13 Patienten konnte ein HIES diagnostiziert werden. Bei 12 dieser Patienten fand sich ausnahmslos ein chronisches Ekzem (bei 75% bereits vor der vierten Lebenswoche manifest), Staphylokokken-Abszesse der Haut (bei 83% auch Organabszesse), rezidivierende Infektionen des HNO-Bereiches, eine Candidose der Mundschleimhaut sowie der Finger- und Fußnägel, ein Gesamt-IgE über 2000 IU/ml und einer Vergröberung der Gesichtszüge (HIES-typische Fazies). Bei 11 von 12 Patienten traten rezidivierende Pneumonien auf, die in 25% mit einer Pneumatozelenbildung einhergingen. Bei der Hälfte der HIES-Patienten fand sich eine IgD-Erhöhung über 100 IU/ml. 50% der Patienten hatten Spontanfrakturen, 67% eine Überstreckbarkeit der Gelenke und 60% der über sechzehnjährigen eine Skoliose. Eine Milchzahnpersistenz, ein erstmals von Grimbacher et al. beschriebener Befund, konnte mit einem Auftreten bei 73% unserer über sechsjährigen Patienten bestätigt werden (Grimbacher et al. 1999a). Der Vergleich von anthropometrischen Daten des Gesichtes mit Standardwerten der Literatur (Farkas LG 1994) ergab signifikant erhöhte Mittelwerte für die Nasenflügelbreite (z-Score=4), den äußeren (z-Score=6) und inneren Augenabstand (z- Score=2) und Normwerte für den Kopfumfang. Ein Patient hatte eine Craniosynostose. Zusätzlich traten bei jeweils einem weiteren Patienten eine zweifache Non-Hodgkin- Lymphom-Erkrankung (T- und B-Zelltyp), ein juveniler arterieller Hypertonus, eine beidseitig operationsbedürftige Katarakt, eine Echinococcus alveolaris-Infektion der Leber und eine Hämophilie A auf. Familiarität könnte bei diesen 12 Patienten nicht beobachtet werden. Eine vergleichbare infektions-immunologische Symptomatik (Ekzem, rezidivierende Infektionen der Haut und des Respirationstraktes und erhöhtes IgE) wie Patienten mit klassischem HIES zeigten 5 Patienten aus 5 konsanguinen Familien türkischer Abstammung. Abgesehen von einer milden Überstreckbarkeit der Gelenke bei einer Patientin konnten keine weiteren zahn- und skelettbezogenen Symptome festgestellt werden. Zusätzlich fanden sich bei diesen Patienten eine extreme Eosinophilie (bis 16000 Eosinophile per µl; vgl. Abb. 14), ungewöhnlich starker Molluscum contagiosum Befall und cerebrale Gefäß- und Blutungsprobleme, die zu einer hohen Letalität führten. Retrospektiv konnte in 4 der Familien ein weiteres bereits verstorbenes Geschwisterkind mit HIES diagnostiziert werden. Aufgrund von Konsanguinität und familiärem Auftreten der Symptome in einer Generation wird bei diesen Familien ein autosomalrezessiver Erbgang vermutet. Dieses Krankheitsbild ist bisher nicht in der Literatur erwähnt und soll als autosomal rezessive Variante der HIES beschrieben werden. Mit diesen Familien wird aktuell eine Genom-weite Kopplungsanalyse durchgeführt. Sieben weitere Patienten zeigten durch eine geringere Ausprägung der Symptome eine milde Unterform des klassischen HIES. Differentialdiagnostisch ist eine andere Grunderkrankung wie z.B. eine schwere atopische Dermatitis nicht völlig auszuschließen. Aufgrund der klinischen Einschätzung wurden die 68 Patienten mit Anfangsverdacht auf ein HIES in vier Diagnosegruppen eingeteilt: „klinisch-gesichert HIES“, „HIESVariante“, „Verdacht auf HIES“, „kein HIES“. Wesentliche differentialdiagnostische Kriterien waren hierbei: Ekzemmanifestation vor der 6. Lebenswoche, infiltrierende Abszesse (Organabszesse), Nagelcandidose, Spontanfrakturen, Überstreckbarkeit der Gelenke und, als besonders spezifisches Merkmal, die Milchzahnpersistenz. Ein wichtiges weiteres Charakteristikum ist die HIES-typische Fazies, die nur bei den von uns persönlich gesehenen Patienten ausgewertet werden konnte. Der Vergleich der Mittelwerte für das Gesamt-IgE (95%-Konfidenzintervall) ergab keinen signifikanten Unterschied der verschiedenen Diagnosegruppen untereinander, so dass die Höhe des Gesamt-IgE zwar für HIES meist über 2000 IU/ml liegt, aber nicht als spezifisch für diese Erkrankung anzusehen ist. Diese klinischen Diagnosegruppen wurden mit dem Ergebnis eines Algorithmus, der zur Veranschaulichung des Entscheidungsprozesses bezüglich des HIES entwickelt wurde und in sechs Stufen Symptome bzw. Symptomenkomplexe des HIES auf ihr Vorhandensein getestet, verglichen. Ein vom NIH entwickeltes Scoresystem wurde auf seine Aussagefähigkeit zur Diagnosestellung überprüft (vgl. Tab. 3). Es ergab sich daraus, dass bei einem Scorewert von über 40 Punkten mit großer Wahrscheinlichkeit ein HIES vorliegt und bei einem Wert unter 20 Punkten die Diagnose verworfen werden konnte. Das NIH-Scoresystem und der Algorithmus ließen somit eine Aufspaltung zwischen den Patienten mit klinisch-gesichertem HIES und keinem HIES zu. Aus unserer klinischen Studie konnten somit konkrete Entscheidungshilfen zur Diagnosestellung gegeben werden, die es ermöglichen, das HIES früher zu erkennen, um so Lebensqualität und Prognose dieser chronischen Krankheit durch frühzeitige intensive antimykotische-antibiotische Therapie und Abszessspaltung weiter zu verbessern und assoziierte Merkmale (Milchzahnpersistenz, pathologische Frakturen, Skoliose und Lymphome) in die Therapie bzw. Prophylaxe einzubeziehen. Es wird vermutet, dass das klassische HIES einem monogenen, autosomal-dominanten Erbgang mit variabler Expressivität folgt. Mittels Linkage-Studie konnte ein signifikanter LOD score in der Region 4q21 bestimmt werden (Grimbacher et al. 1999b). Die Suche nach dem Gendefekt für das HIES ist bisher noch nicht abgeschlossen. Kopplungsanalysen von familiärem HIES am NIH und unsere klinische Studie legen nahe, dass es nicht nur unterschiedliche Phänotypen des HIES gibt, sondern auch unterschiedliche Gendefekte anzunehmen sind (Grimbacher 1999b). Sollte für das HIES ein Gendefekt nachgewiesen werden, so bestünde die Hoffnung, über die daraus resultierende biologische Störung (z.B. Proteindefekt) entscheidende Erkenntnisse zur Ätiologie und Pathogenese des HIES zu erlangen. Davon hängt schließlich die Möglichkeit einer kausalen Therapie, eventuell einer somatischen Gentherapie, ab, aber ebenso die genetische Beratung betroffener Familien und vielleicht auch Erkenntnisse für Erkrankungen des atopischen Formenkreises.

Das Ziel dieser Studie ist es, die Rolle des Kleinhirns bei der Verarbeitung vestibul ärer Signale besser zu verstehen. Entsprechend wurden in dem Experiment, auf welchem diese Arbeit aufbaut, Einzelzellableitungen rein vestibulärer Neurone im rostralen Nucleus fastigii von Affen (Macaca mulatta) durchgeführt. Die Affen wurden in einer Schaukelvorrichtung bei verschiedenen Frequenzen (0.06 - 1.4 Hz) und Orientierungen in vertikalen Ebenen einer sinusförmig vestibulären, passiven Stimulation unterzogen. Innerhalb einer Messung wurde hierbei die Stimulusfrequenz konstant gehalten, während die Stimulusorientierung langsam um 180 Grad gedreht wurde. In einem ersten Schritt wurden die 195 Messungen aus 28 Neuronen systemtheoretisch vorverarbeitet. Hierzu wurde hergeleitet, wie das Antwortsignal einer Messung bei dem gegebenen Stimulus unter der Annahme linearer spatio-temporaler Konvergenz, d.h. Konvergenz peripherer vestibulärer Afferenzen mit unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Eigenschaften, aussehen sollte. Mit der so erhaltenen Gleichung wurden die gemessenen neuronalen Entladungsraten gefittet. Es konnte dabei gezeigt werden, dass sich ein Großteil der Messungen gut fitten lässt. Die Neurone verhalten sich somit bei konstanter Stimulusfrequenz im allgemeinen wie lineare STC-Neurone. In Übereinstimmung mit Siebold et al. (1999) konnten dabei einige komplexe Eigenschaften der Neurone beobachtet werden. In vielen Messungen gibt es keine Stimulusorientierung, bei welcher der Gain verschwindet. Die Phasendifferenz zwischen Entladungsrate und Stimulus ändert sich hierbei langsam aber stetig mit der Stimulusorientierung. Bei einigen Neuronen konnte auch eine starke Abhängigkeit der Vorzugsorientierung von der Stimulusfrequenz beobachtet werden. Des weiteren ist die Phase in Richtung der Vorzugsorientierung oft stark frequenzabhängig. Darüber hinaus konnte mit dieser Fitprozedur zum ersten Mal gezeigt werden, dass der FN vermutlich einen Eingang aus dem Sakkulus erhält. Da der Sakkulus jedoch bei den verwendeten kleinen Stimulusamplituden nur wenig stimuliert wird, sollte dieses Ergebnis in zukünftigen Experimenten bei größeren Stimulusamplituden überprüft werden. Im Folgenden wurden 10 Messungen bei den Frequenzen 0.06 Hz und 0.1 Hz mit einem schlechten Signal-Rausch Verhältnis (geringer dynamischer Input, wenig Stimulusperioden) herausgenommen, so dass sich die Gesamtzahl der Messungen auf 185 reduzierte. Im nächsten Verarbeitungsschritt konnte gezeigt werden, dass sich die neuronalen Entladungsraten von 22 der 28 Neurone durch eine lineare Summation der Signale aus den Bogengängen und Otolithen fitten lassen. Die Qualität der Fits war bei den meisten Neuronen nur dann gut, wenn von einem Bogengangs- und zwei Otolitheneingängen, einem regulären und einem irregulären, ausgegangen wurde. Die Verwendung von nur einem Otolitheneingang führte im allgemeinen zu schlechten Fitergebnissen. Hierbei war es egal, welcher Art der Otolitheneingang - regulär, irregulär oder eine Mischung beider Typen - war. Die so berechneten Vorzugsorientierungen der Eingänge zeigten im allgemeinen entweder in etwa in die gleiche (Kanal- und reguläre Otolithenafferenz) oder entgegengesetzte (irregul äre Otolithenafferenz) Richtung. Hierdurch wurde eine mögliche Erklärung für das Zustandekommen der obigen, bis dahin unverstandenen komplexen Eigenschaften gewonnen. Unter der Annahme einer einfach gestalteten, zentralen, linearen Nachverarbeitung konnten noch vier weitere Neurone gefittet werden. Im Folgenden konnte eine relativ einfache systemtheoretische Beschreibung der Neurone durch zwei senkrecht aufeinanderstehende Transferfunktionen mit je fünf Parametern gefunden werden. 25 der 28 Neurone des FN können hierdurch im gesamten Frequenz- und Orientierungsbereich als lineare STC-Neurone beschrieben werden. Im letzten Teil der Arbeit konnte in einer Computersimulation gezeigt werden, dass bereits eine lineare Summation der Signale aus den Bogengängen und Otolithen genügt, um ein simuliertes zweidimensionales Pendel aufrecht zu halten, d.h. seine subjektive Vertikale zu bestimmen. Das sich im Gravitationsfeld befindliche Pendel besitzt in seinem Kopf (oberes Ende) simulierte Bogengänge und Otolithen. Diese geben ihre Signale direkt an simulierte Muskeln an seinem unteren Ende weiter. Diese einfache Rückkopplung genügt bereits, um dem simulierten Pendel im Gravitationsfeld die aufrechte Haltung zu ermöglichen und Störungen in Form von äußeren Kräften entgegenzuwirken.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine randomisierte, plazebokontrollierte Doppelblindstudie durchgeführt, in der Patienten mit Rektumkarzinom intraoperativ den Serinprotinasen-Inhibitor Aprotinin erhielten. Hauptziel dieser Studie war es, durch die Gabe von Aprotinin eine Senkung des intraoperativen Blutverlustes und eine Reduktion der Anzahl an zu verabreichenden Erythrozytenkonzentrate zu erreichen. Weitere Zielkriterien waren der Blutverlust, die Hämoglobinkonzentration und Gerinnungsparameter, die prä- und jeweils postoperativ untersucht und mit dem Kontrollkollektiv verglichen wurden. Weiterhin wurden die Patienten in Hinblick auf etwaige auftretende Nebenwirkungen untersucht.

Gegenstand vorliegender Arbeit sind Untersuchungen zu Aktionspotential-induzierten Kalzium-Signalen in unreifen Neuronen. In Widerspiegelung des hierzu gewählten zweigleisigen Vorgehens ist diese Dissertation in zwei Teile gegliedert: Im ersten Abschnitt wird die Entwicklung eines Softwarepaketes beschrieben, mit dem die Aufnahme und Analyse des für diese Arbeit relevanten Bilddatenteils erfolgte. Im zweiten Abschnitt wurden dann unter Anwendung dieser Software Experimente in heranreifenden Purkinje-Neuronen des Kleinhirns (Zerebellum) von Ratten und Mäusen durchgeführt. Besonderes Augenmerk galt in diesem Zusammenhang dem maturationsbedingt unterschiedlichen Grad der Ausprägung von intrazellulären Kalzium-Signalen infolge der Evozierung von somatischen Aktionspotentialen. Darauf aufbauend wurden Untersuchungen hinsichtlich der Bedeutung des intrazellulären Kalzium-Puffers Calbindin D28k (Calbindin) und dessen Rolle für das zeitliche wie räumliche Profil dieser Kalziumsignale durchgeführt.

Degenerative Gelenkerkrankungen (Osteoarthrose) gehören zu den am weitesten verbreiteten chronischen Erkrankungen der älteren Bevölkerungsschicht. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, Bildverarbeitungsmethoden zu entwickeln, die eine frühzeitige Diagnose degenerativer Veränderungen des Knorpels oder eine Prognose über die Erkrankungswahrscheinlichkeit bzw. ihren Verlauf ermöglichen. Dies ist notwendig, um rechtzeitig mit einer geeigneten Therapie beginnen zu können. Dreidimensionale Rekonstruktion der Knorpelplatten aus MRT-Schichtbildern Als erster Schritt wurde eine Technik für die 3D-Rekonstruktion der Knorpelplatten aus den segmentierten Schichtbildern entwickelt. Das rekonstruierte Knorpelmodell bietet die Möglichkeit, die Gelenkflächengröße und die Größe der Knorpelknochengrenze exakt und reproduzierbar zu ermitteln. In der Gelenkflächengröße wird ein wichtiger Parameter für die Lastverteilung innerhalb der Gelenke gesehen. Zum anderen dient sie als Basis zur ortsaufgelösten Berechnung und Visualisierung der Gelenkflächenkrümmung und Signalintensität. Die Methode zur 3D-Rekonstruktion lässt sich in verschiedene Phasen unterteilen. In der ersten Phase werden die Konturen des segmentierten Bereiches jeder Schicht berechnet und die Reihenfolge der einzelnen Konturpunkte im mathematisch positiven Sinn geordnet. Unter Verwendung von "a priori"-Wissen über die Knorpelform wird die Gesamtkontur jeder Schicht in einen Gelenkflächen- und einen Knorpelknochengrenzen- Anteil unterteilt. Die Konturen, die gemeinsam einer Knorpelfläche (Gelenkfläche oder Knorpelknochengrenze) zugeordnet wurden, werden über ein Dreiecksnetz zu einem dreidimensionalen Modell der Fläche verbunden. Das Dreiecksnetz kann in unterschiedlichen Auflösungen erzeugt werden, je nachdem ob jeder Konturpunkt in dieses Netz einbezogen oder eine vom Benutzer definierte Anzahl übersprungen wird. Dadurch wird eine Glättung der Oberfläche möglich. Durch Summation der einzelnen Dreiecksflächen wird die Gesamtgröße der beiden Knorpelflächen berechnet. Die Bestimmung der Gelenkflächen- und Knorpelknochengrenzengröße wurde an verschiedenen Testkörpern (Kugel, Zylinder, Ebene) validiert. Die Abweichung von der theoretischen Flächengröße der Testkörper lag zwischen 0 und 4%. Die Präzision (CV%) der Messung verschiedener Gelenkflächen des Kniegelenks bei 14 Probanden (WE-FLASH Sequenz, Auflösung 1;5x0;31x0;31mm3, 4-fach Messung) lag zwischen 2,0 und 3,6 %. Es ergab sich ein Verhältnis zwischen der biologischen Variabilität und dem Messfehler von 3,7:1 (Patella, Knorpelknochengrenze) bis 7,7:1 (Femur, Knorpelknochengrenze). Dies zeigt, dass mit der Methode verlässlich zwischen Individuen mit großen und kleinen Gelenkflächen unterschieden werden kann. Der Vorteil dieses Verfahren gegenüber vergleichbaren Ansätzen besteht darin, dass der segmentierte Bereich automatisch in einen Gelenkflächen- und Knorpelknochengrenzen-Anteil aufgeteilt wird. Auf dieseWeise wird eine getrennte Analyse beider Flächenanteile möglich. Die 3D-Rekonstruktion ist weitgehend unabhängig von der ursprünglichen Schichtorientierung und ermöglicht somit morphologische Untersuchungen der Gelenkfläche, wie z.B. eine Krümmungsanalyse. Krümmungsanalyse des Gelenkknorpels In einem nächsten Schritt wurden Techniken für eine Analyse der Gelenkflächenkrümmung entwickelt. Die Krümmung dient als Maß zur Beurteilung von Inkongruenzen zwischen patellofemoraler bzw. tibio-femoraler Gelenkfläche. Da das Ausmaß der Inkongruenz zwischen zwei Gelenkflächen Einfluss auf die Größe der Kontaktfläche zwischen diesen hat, wird hierdurch die Lastverteilung im Gelenk entscheidend bestimmt. Es wurde eine regionale Gaußsche und eine indirekte Krümmungsanalyse entwickelt. Um die Gaußsche Krümmungsanalyse durchzuführen, wurde eine B-Spline-Fläche durch definierte Oberflächenpunkte des 3D-Modells der Gelenkfläche interpoliert. Da für die B-Spline-Fläche eine mathematische Beschreibung existiert, war eine Bestimmung der beiden Hauptkrümmungen jedes Punktes auf der Fläche möglich. Auf diese Weise konnte für jeden Flächenpunkt die mittlere, maximale, minimale und Gaußsche Krümmung berechnet werden. Die Verfahren wurde an 5 Testkörpern mit bekannten Krümmungseigenschaften (Kugel, Zylinder, Ebene, Paraboloid, Hyperbolisches Paraboloid) validiert. Die maximale Abweichung vom theoretischen Krümmungswert betrug ca. 2%. Die Präzision [1m] der Gaußschen Krümmungsanalyse an den Kniegelenken gesunder Probanden lag zwischen 2,9 und 10,5 1m. Ergänzend zur exakteren Gaußschen Krümmungsanalyse wurde die indirekte Krümmungsanalyse entwickelt. Hierbei wurde durch eine Flächenexpansion des 3D-Modells die relative Flächenvergrößerung berechnet. Auf Basis dieser relativen Änderung wurde eine Krümmungsmaßzahl bestimmt. Die Anwendung auf Testkörper zeigte, dass dieses Verfahren eher eine qualitative Aussage über die Gesamtkrümmung einer Fläche liefert und daher eine exakte Gaußsche Analyse vorzuziehen ist. Das in dieser Arbeit entwickelte Gaußsche Verfahren zur Krümmungsbestimmung von Gelenkflächen hat das Potential, ein quantitatives Maß der Inkongruenz von Gelenken zu liefern. Dadurch wird es möglich, Punkte maximaler Belastung zu ermitteln, was Hinweise auf die Initiation und Progression von Knorpelschäden liefern kann. Darüberhinaus kann ein Zusammenhang zwischen der lokalen Belastung und daraus folgenden biochemischen Eigenschaften des Knorpels hergestellt werden. Globale und regionale Signalintensitätsanalyse In einem dritten Schritt wurden die Voraussetzungen für eine detailierte Strukturanalyse des Knorpelgewebes mit der MRT geschaffen. Zu diesem Zweck wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem sich die globale und regionale Signalintensität spezieller MRT-Sequenzen quantitativ und visuell (projiziert auf das 3D-Knorpelmodell) auswerten lassen. Je nach MRT-Sequenz lassen sich potentiell Aussagen über den Wasser-, Kollagen- oder Proteoglykangehalt des Knorpels in unterschiedlichen Regionen treffen. Dazu wird der segmentierte Knorpel automatisch in eine vom Benutzer definierte Anzahl von Tiefenzonen (Oberfläche - Knorpelknochengrenze) und Regionen (z.B. medial - lateral) eingeteilt. Die Signalintensität kann global über den gesamten Knorpel oder regional in den Tiefenzonen und Regionen ausgewertet werden. An 15 Probanden wurde für die Protonendichte ein signifikant (p < 0,001) höherer Wert des patellaren Knorpels gegenüber der lateralen Tibia festgestellt. Insgesamt konnte eine hohe Variabilität zwischen den Probanden beobachtet werden. Zwischen den männlichen und weiblichen Probanden ergab sich kein signifikanter Unterschied. Die Variation zwischen den Schichten war geringer als diejenige zwischen verschiedenen Individuen. Beim MT-Koeffizienten war eine signifikant niedrigere Signalintensität (p < 0,01) des Knorpels der medialen Tibia gegenüber der Patella und der lateralen Tibia zu beobachten. Es wurde ebenfalls eine hohe inter-individuelle Variabilität festgestellt. Auch beim MT-Koeffizienten war die Variation zwischen den Schichten geringer als diejenige zwischen verschiedenen Individuen. An 3 Probanden und 3 Präparaten wurde eine regionale Signalintensitätsanalyse der Protonendichte und einer Wasseranregungssequenz durchgeführt. Die Analyse der Protonendichte in den Tiefenzonen des Knorpels der Probanden ergab eine erwartete Abnahme hin zu tiefer gelegenen Knorpelbereichen. Insgesamt konnten konsistente Ergebnisse bei den untersuchten Probanden und Präparaten festgestellt werden. Sowohl die inter-individuellen Unterschiede als auch die signifikanten Unterschiede zwischen einzelnen Knorpelplatten korrelieren mit Ergebnissen aus der Literatur. Diese könnten in Zusammenhang mit unterschiedlichen mechanischen Belastungen der einzelnen Knorpelplatten stehen. Die konsistente Signalintensitätsverteilung bei den Probanden und Präparaten unterstützt die Vermutung, dass tatsächlich bestimmte Strukturkomponenten des Knorpels durch diese erfasst werden. Basierend auf den entwickelten Methoden sind verschiedene Untersuchungen zu den folgenden Themenkomplexen möglich: - Untersuchung funktioneller Anpassungsprozesse. - Dokumentation von Altersveränderung in der Knorpelzusammensetzung. - Diagnose der Osteoarthrose im Frühstadium. - Verlaufskontrolle bei Osteoarthrose. - Beurteilung des Therapieerfolgs und Evaluation neuer Medikamente. - Screening der Gewebezusammensetzung bei der In-vitro-Züchtung von Knorpelgewebe zur späteren Implantation.

Bcr-Abl, eine onkogene Tyrosinkinase, ist maßgeblich an der Entstehung der chronischen myeloischen Leukämie (CML) sowie einem Teil der Fälle von akuter B-lymphoblastischer Leukämie (B-ALL) beteiligt. Die essentielle Rolle der Kinase-Aktivität von Bcr-Abl für dessen leukämogenes Potential konnte in zahlreichen Arbeiten demonstriert werden. Entsprechend ist Bcr-Abl Zielstruktur des ersten klinisch geprüften Tyrosinkinase-Inhibitors, STI571. STI571 führt bei Anwendung während der chronischen Phase der CML zu einer anhaltenden hämatologischen Remission, die nicht selten begleitet wird von einem kompletten Verschwinden Ph-positiver Zellen aus dem Knochenmark (zytogenetische Remission). In dieser Arbeit konnten zusätzlich zu Bcr-Abl weitere, therapeutisch relevante Zielstrukturen für die Behandlung Bcr-Abl-positiver Leukämien identifiziert werden. Es handelt sich hierbei um die Mitglieder der Familie der Src-Kinasen, die über einen komplexen Mechanismus, letztlich aber unabhängig von der Aktivität der Abl-Kinase, aktiviert werden (siehe Abschnitt 3.1 und 3.2). Tierexperimente zeigten, dass diese Kinasen zumindest im Rahmen der Bcr-Abl-positiven B-ALL von essentieller Bedeutung sind (siehe Abschnitt 3.3). Diese Beobachtung war vor allem deswegen interessant, weil gerade die Bcr-Abl-positive B-ALL nur ein sehr schlechtes Ansprechen auf STI571 als Monotherapie zeigt und weil STI571 Src-Kinasen weder direkt noch indirekt über Bcr-Abl inhibierte. Durch Exploration des Bindungsmodus von STI571 konnte eine Bindetasche in Abl identifiziert werden, die Grundlage für die hohe Spezifität von STI571 ist (Abschnitt 3.4). Die dabei gewonnenen Daten wurden zur Etablierung eines Zellkultursystems genutzt, das die Selektion und Validierung einer neuen Substanzklasse, der dualspezifischen Src-/Abl-Inhibitoren, ermöglichte. PP1 und CGP76030 waren Prototypen derartiger Inhibitoren. Sie blockierten die Aktivität von Src-Kinasen und Abl über einen identischen Bindungsmechanismus. Experimente mit Bcr-Abl-positiven Zellinien deuteten darauf hin, dass die alleinige oder additive Inhibition von Src-Kinasen durch diese Inhibitoren eine zusätzliche Option für die Therapie Bcr-Abl-positiver Leukämien darstellt (Abschnitt 3.5). Dies gilt insbesondere für Patienten mit fortgeschrittener Leukämie oder dann, wenn sich aufgrund spezifischer Punktmutationen eine Resistenz gegenüber STI571 ausgebildet hat. Derartige Substanzen sollten daher in naher Zukunft in Tiermodellen getestet werden.

Epithelzellen spielen im Immunsystem eine wichtige Rolle als Vermittler zwischen äußerem Milieu und darunterliegender Mukosa. Epithelzellen treten als Erste mit potentiellen Pathogenen in Kontakt: durch die Sekretion von Zytokinen als Warnsignale an umliegende Zellen können sie eine Entzündungsreaktion einleiten. Yersinia enterocolitica ist ein enteropathogener, vorwiegend extrazellulär lokalisierter Erreger, der eine akute Enterokolitis, Sepsis und immunologische Folgeerkrankungen verursacht. Die Rolle der intestinalen Epithelzellen bei der Infektion mit Y. enterocolitica ist bisher nicht ausreichend erörtert. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung des von Epithelzellen initiierten Zytokin-Netzwerks während der frühen Phase der Y. enterocolitica- Infektion. Hierzu wurden HeLa-Zell-Monolayer mit verschiedenen Y. enterocolitica- Stämmen infiziert und mittels Reverser Transkriptions (RT)-PCR zunächst wichtige Zytokine identifiziert. Die Kinetik der Zytokin-Produktion wurde durch semiquantitative RT-PCR analysiert sowie die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der Zytokine mittels ELISA quantitativ erfasst. Die Stimulation von epithelialen Zellen mit rekombinanten humanen Zytokinen lieferte weitere Informationen über die Funktion der einzelnen Zytokine. Zum anderen wurden die Mechanismen der Wirt-Pathogen- Interaktion analysiert, die das Zytokin-Netzwerk während der initialen Phase der Y. enterocolitica-Infektion auslösen. Die Auswirkungen der Hemmung der bakteriellen Invasion (durch PI3-Kinase-Inhibitoren) sowie der bakteriellen Proteinsynthese (mittels Antibiotika) wurden untersucht. Durch die Infektion von Epithelzellen mit verschiedenen bakteriellen Mutantenstämmen gelang es, die Bedeutung des chromosomal kodierten Oberflächenproteins Yersinia Invasin zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt: 1. Y. enterocolitica pYV– induziert eine Stunde nach Infektion von HeLa-Zellen die de novo-Synthese von IL-8-, IL-1a-, MCP-1-, IL-1b-, GM-CSF- und TNF-a- mRNA. Y. enterocolitica pVY+ hemmt durch bestimmte Yersinia outer proteins die de novo-Synthese aller untersuchten Zytokine in HeLa-Zellen. 2. Die Zytokin-mRNA-Produktion in HeLa-Zellen nach Y. enterocolitica pYV–-Infektion erreicht nach 3 h ihr Maximum, um 5–6 h nach Infektion wieder auf Normalwerte abzufallen. IL-8 wird hierbei als Erstes und in den größten Mengen produziert. Diese pro-inflammatorische Zytokin-Antwort ist wahrscheinlich verantwortlich für den histopathologisch beobachteten massiven Einstrom von Immunzellen in infizierte Peyer’sche Plaques, was deren Zerstörung zur Folge hat. 3. Nur IL-8, MCP-1 und GM-CSF werden von HeLa-Zellen sekretiert, IL-1a und IL-1b verbleiben intrazellulär. IL-1a stimuliert bei HeLa-Zellen eine proinflammatorische Zytokin-Antwort, nicht jedoch IL-8, MCP-1 oder GM-CSF. Dies spricht für eine spezielle Rolle von IL-1: es könnte als ‚Verstärker-Zytokin’ dienen, das erst im späteren Verlauf der Infektion, nach Lyse der infizierten Zellen, freigesetzt wird und eine erneute Zytokin-Produktion verursacht. 4. Die Zytokin-Induktion nach Y. enterocolitica-Infektion von HeLa-Zellen ist wahrscheinlich nicht LPS-vermittelt. 5. Auch nach Hemmung der bakteriellen Invasion durch Wortmannin, einem PI3- Kinase-Inhibitor, beobachtet man die gleichen Zytokin-Antwort: schon die Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle genügt, um eine inflammatorische Zytokin- Reaktion auszulösen. 6. Wir zeigten, dass die Zytokin-Induktion durch die Bindung von Yersinia Invasin an b1-Integrine der Wirtszelle vermittelt wird: Eine Invasin-defiziente Y. enterocolitica- Mutante löst (ebenso wie ein nicht-invasiver E. coli-Stamm) keine Zytokin- Reaktion in HeLa-Zellen aus. Der Transfer des Invasin-Gens in E. coli hingegen vermittelt diesem die Fähigkeit, eine inflammatorische Zytokin-Antwort auszulösen. 7. Die Invasin-induzierte Zytokin-Antwort nach Y. enterocolitica pYV– ist unabhängig von bakterieller Proteinbiosynthese oder einem intakten Typ III-Sekretionssystem: auch Gentamicin- oder Hitze-getötete Yersinien induzieren eine inflammatorische Zytokin-Antwort wie metabolisch aktive Yersinien. Diese Ergebnisse verdeutlichen zum einen die wichtige Rolle von Epithelzellen bei der Generierung von Signalen zur Initiation der Abwehrreaktion des Immunsystems gegen Y. enterocolitica. Zum anderen wurde Yersinia Invasin als Pathogenitätsfaktor charakterisiert, der gezielt eine zelluläre Entzündungsreaktion der Darmmukosa auf eine Y. enterocolitica-Infektion initiiert.

Bei einem Massenanfall Verletzter und Erkrankter (MANV) übersteigt das Patientenaufkommen initial die Behandlungskapazitäten, so daß in dieser Phase noch keine individualmedizinische Patientenversorgung möglich ist [Rebentisch 1986; Hansak 1998; Sefrin 1998; Veronesi and Kompare 1998]. Um einen gezielten Überblick über das Patientenaufkommen zu erhalten, besondere Verletzungen oder Erkrankungen zu registrieren und die zur Verfügung stehenden Ressourcen möglichst effizient einzusetzen, muß in dieser Situation eine Patientensichtung (Triage) durchgeführt werden. Im Rahmen dieser Sichtung soll vor Ort in möglichst kurzer Zeit eine Einstufung sämtlicher Patienten nach zunehmender Verletzungsschwere erfolgen und auf deren Basis über die Art und Reihenfolge der medizinischen Behandlung entschieden werden. Ziel der vorliegenden, prospektiven Studie war es, bestehende Richtlinien der Patientensichtung unter Realbedingungen zu evaluieren, um deren Prozeßqualität im Weiteren verbessern zu können. Außerdem wurde die Aussagekraft und Praktikabilität gängiger Triagekriterien sowie notfall- bzw. katastrophenmedizinischer Einschätzungskategorien und Score-Systeme untersucht. Während des Zeitraums vom 19.September bis 04.Oktober 1998 wurden insgesamt 1.976 Patienten gesichtet und das Sichtungsergebnis auf speziell entworfenen Dokumentationsprotokollen festgehalten. Als Studienort wurde die Notfall- und Sanitätsstation während des Oktoberfestes in München gewählt, wo nahezu regelhaft ein großer Anfall von Notfallpatienten innerhalb kurzer Zeit besteht. Aufgrund der gut ausgebauten Versorgungsstruktur ist dort in der Regel eine Individualversorgung der Patienten sichergestellt, so daß durch zusätzliches Personal diese Beobachtungsstudie realisiert werden konnte. Aus dem gesichteten Gesamtkollektiv von 1.976 Patienten rekrutierten sich insgesamt 220 Patienten, deren weiterer medizinischer Verlauf bis zur Entlassung von der Notfall- und Sanitätsstation bzw. aus der Klinik, in die sie zur weiteren Versorgung transportiert wurden, im Detail nachverfolgt wurde. Die auf den verschiedenen Protokollen dokumentierten Aussagen der triagierenden Notärzte wurden mit den entsprechenden Daten der im Anschluß erfolgten regulären Patientenversorgung verglichen. Die Auswertung sämtlicher auf diese Weise zusammengetragenen Daten lieferte neben zahlreichen Einzelergebnissen folgende Hauptaussagen: Im Rahmen der Triage unter katastrophenmedizinischen Bedingungen besteht im untersuchten Patientenkollektiv die Tendenz, Patienten als zu kritisch verletzt bzw. erkrankt einzustufen. Dies galt sowohl für die Einteilung nach den Sichtungskategorien (21% bei Kategorie I und 36% bei Kategorie II), als auch nach dem NACA-Score (46% bei NACA-3 und 47% bei NACA-4). Eine zu harmlose Einschätzung wurde hingegen nur in weniger als 3% der Fälle vorgenommen (0,7% bei Kategorie III, 1,0% bei den NACA-Stufen 1 und 2 sowie 2,3% der NACA-Stufe 3). Unter dieser Strategie werden potentiell kaum kritisch Kranke und Verletzte „übersehen“, jedoch würde dies im Realfall zu einer unnötig hohen Bindung von Personal und Material führen. Empfehlenswert für die Praxis ist, nicht zuletzt deshalb, eine zeitnahe Nachtriagierung und Neueinstufung der gesichteten Patienten durchzuführen. Der benötigte Zeitaufwand für die Triageuntersuchung betrug im Median 30 Sekunden und lag damit deutlich unter den in der Literatur empfohlenen Richtwerten. Weitere 31 Sekunden mußten im Median jedoch noch für die anschließende Triagedokumentation aufgewandt werden. Um angesichts des im MANV herrschenden Zeitdrucks eine möglichst zeiteffektive Sichtung durchführen zu können, sollten dem triagierenden Arzt ausreichend Dokumentationskräfte zur Verfügung stehen. Außerdem sollte ein ausgereiftes und standardisiertes Dokumentationssystem für den MANV flächendeckend etabliert werden, was gegenwärtig in Deutschland so nicht etabliert ist. Um Verbesserungen der Prozeßqualität der Triage von Notfallpatienten beim MANV zu ermöglichen, wurde auch die Prognoserichtigkeit bezüglich der Anzahl und Art notwendiger Krankenhaustransporte bestimmt. Der entsprechende Vergleich der Triageprognosen der Studienärzte zu Transportindikation und gegebenenfalls Transportmittelart ergab eine Prognoserichtigkeit von lediglich 67 % hinsichtlich der Transportindikation sowie von lediglich 59 % hinsichtlich der Transportmittelart. Versorgungsmodalitäten wie Transportfragen sollten daher nicht schon im Rahmen der initialen Triage, sondern erst später nach einer genaueren Abklärung des Patientenzustandes entschieden werden. Dies setzt jedoch auch voraus, daß zeitnahe Nachtriagierungen und gegebenenfalls Neueinstufungen aller gesichteten Patienten durchgeführt werden. Die Transportpriorität sollte dabei unabhängig von der Dringlichkeit und dem Ausmaß notfallmedizinischer Therapie festgelegt werden. Die Überprüfung der Aussagekraft und Praktikabilität der beiden notfall- bzw. katastrophenmedizinischen Bewertungssysteme NACA-Score und Sichtungskategorien aus der Katastrophenmedizin unter den Bedingungen eines MANV zeigte für beide Systeme deutliche Mängel auf. Beide, auf subjektiven Kriterien beruhenden Einschätzungssysteme sind nur eingeschränkt auf die spezielle Situation des Massenanfalls Verletzter und Erkrankter übertragbar. Nach den Ergebnissen dieser Studie wäre die Entwicklung eines auf den Erkenntnissen notfallmedizinischer Patientenversorgung beim Großschadensfall basierenden, zeiteffektiven und einheitlichen Bewertungs- und Dokumentationssystemes für den MANV dringend indiziert.