Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19 Archiv
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Die Objektivierung der Wirkung von thermotherapeutischen Maßnahmen in Form von perkutanen Wärmepackungen in der Rehabilitationsmedizin stellt ein wichtiges, jedoch noch ungeklärtes Problem dar. In dieser Arbeit wird durch den Einsatz der nichtinvasiven Oberflächen-Elektromyographie und der Messung der dabei wich-tigen Parameter, nämlich der getrennten Analyse der Frequenzen (TURNS) und der Amplituden (RMS), der Versuch gemacht , das individuelle Verhalten der Skelett-muskulatur vor und nach Wärmeapplikation zu beleuchten. Die Untersuchung erfolgt dabei nicht im Ruhezustand, sondern im ersten Teil in kurzen aufsteigenden isometrischen Kraftreihen (10%, 30%, 50% und 80%MVC) und im zweiten Teil bei länger anhaltender isometrischer Kraft (30% und 50%MVC). Durch Einsatz eines neu entwickelten Dynamometers für die Mm. extensores carpi radialis konnte die Kraft dabei kontrolliert werden. Kraftreihenversuch: An jeweils 21 Probanden (11 Männer, 10 Frauen, 20-30 Jahre) in Versuchs- und Kontrollgruppe wurden für unterschiedlich starke isometrische Kontraktionen der Mm. extensores carpi radialis die Parameter TURNS und RMS ermittelt. Nach 20-minütiger Wärmeapplikation wurde der Ablauf wiederholt. Dabei zeigte sich eine signifikante Erhöhung der TURNS für die Kraftbereiche 30%, 50% und 80%MVC (gepaarter T-Test; p< 0,05). Die RMS-Veränderungen hingegen waren nicht signifikant . Ermüdungsversuch: An 22 Probanden (12 Männer, 10 Frauen, 20-30 Jahre) wurden vor und nach Wärmeapplikation anhaltende isometrische Kontraktionen für die Kraftbereiche 30% und 50% MVC durchgeführt und dabei in 4 Sekunden-Abständen TURNS- und RMS-Werte ermittelt. Hier zeigte sich für beide Kraftbereiche sowohl im Versuch ohne, als auch im Versuch unter Wärmeapplikation ein Abfall der TURNS-Werte. Die RMS-Werte nahmen im Verlauf der Kontraktion in allen Abschnitten zu. Unter Wärmeeinwirkung blieben die RMS jedoch zu jedem Zeitpunkt signifikant unterhalb der Werte im Standardversuch. Folgerung: Die Unterschiede der myoelektrischen Aktivität bei unterschiedlichen thermischen Wärmereizen lassen sich auf mehrere Ursachen zurückführen. Zum einen beeinflußt die Temperatur die Leitungsgeschwindigkeit, welche mit der Frequenz im Zusammenhang steht. Zum anderen spielen Rekrutierung, Synchronisierung und Feuerrate unterschiedlicher motorischer Einheiten eine Rolle. Dabei konnte deutlich gezeigt werden, daß die elektrische Aktivität, gemessen an den Amplituden (RMS), die Kontraktionskraft des Muskels wiedergibt und im wesentlichen unabhängig von thermischen Reizen ist. Erst im Verlauf einer Kontraktion nehmen die Werte zu, wobei dieser Anstieg unter Wärme deutlich geringer ist. Der Frequenzparameter TURNS, der unter Wärmeeinfluß bei konstanter Kontraktionskraft signifikant höhere Werte aufweist, stellt einen guten Verlaufswert dar, um die Wirkung von thermischen Reizen zu erfassen. Speziell an Muskelgruppen, an denen die Dynamometrie Schwierigkeiten bereitet, könnten mittels Untersuchung der TURNS-Werte unter Konstanthaltung der RMS-Werte Hinweise über den Kontraktionszustand des Muskels unter physikalischen Stimuli erhalten werden. Diese Arbeit stellt somit eine Methode vor, die der Objektivierung therapeutischer Anwendungen in der physika-lischen Rehabilitationsmedizin dient.
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Aufgabenstellung: Ziel der empirischen Studie war es, zwei Operationsmethoden zur Behandlung der weiblichen Stressinkontinenz hinsichtlich der klinischen Verläufe und der durch die Patientinnen bewerteten Ergebnisse darzustellen. Hierzu wurden Daten von 35 Patientinnen erhoben, die wegen Stressinkontinenz nach der endoskopischen Blasenhalssuspension (BHS) am Krankenhaus Moabit/Berlin versorgt worden waren. Als Vergleichgruppe dienten fünfzehn Patientinnen, die wegen Stressinkontinenz eine Faszienzügelplastik nach Fischer an der Fachklinik St. Joseph II/Berlin erhalten hatten. Methode: Als historische Kohortenstudie angelegt, wurde nach einem Follow-up von mindestens drei Monaten an alle Patientinnen, die am Krankenhaus Moabit im Zeitraum 1989-93 und am St. Josephkrankenhaus im Zeitraum 1987-1992 behandelt worden waren, ein Fragebogen zur aktuellen Symptomatik der Stressinkontinenz und zur präoperativen, perioperativen und aktuellen Lebensqualität verschickt. Klinische Daten zum präoperativen Status und zum perioperativen Verlauf wurden aus den Krankenakten der Patientinnen entnommen. Ergebnisse: In die Studie konnten 75 % aller Frauen, die die Einschlusskriterien erfüllten, einbezogen werden. In der BHS-Gruppe betrug die Heilungsrate/Besserungsrate bezogen auf den Inkontinenzgrad nach einer mittleren Beobachtungszeit von zehn Monaten 43 % bzw. 51 %. In der FZP-Gruppe lag die Erfolgsrate nach durchschnittlich drei Jahren bei 27 % bzw. 53%. In dieser Gruppe befanden sich fünf Rezidivpatientinnen bezogen auf eine vorangegangene Inkontinenzoperation. Vier von ihnen profitierten von dem Eingriff. Es kam in beiden Gruppen zu einer signifikanten Besserung der mittleren Lebensqualität (p
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Die extrazelluläre Matrix umgibt Zellen, stabilisiert Gewebe und reguliert Zellfunktionen. Bestandteile der ECM transduzieren Signale durch Zellmembranrezeptoren, sog. Integrine. Integrine vermitteln Änderungen der Zellmorphologie, Proliferation, Differenzierung und Apoptose in Zellen. Die Frage ob die ECM eine wichtige Rolle in der Physiologie und Tumorgenese der Hypophyse spielt, ist immer noch offen. In der vorliegenden Arbeit wurden zum ersten Mal die regulatorischen Möglichkeiten der ECM in der Hypophyse dargestellt. Es wurde der Einfluß der extrazellulären Matrix auf das Wachstum und die Zytokinsekretion von follikulostellaren Zellen, sowie Hormonsekretion, Proliferation und Signaltransduktion in kortikotropen Zellen untersucht. Desweiteren werden in dieser Arbeit Änderungen der Expression von Laminin, als auch deren mögliche funktionale Konsequenzen innerhalb der Prolaktinomgenese demonstriert. In der follikulostellaren Zellinie TtT-GF konnte gezeigt werden, daß Fibronektin und Kollagen I die Zellproliferation stimulieren. Simultan führte nur Kollagen I zu einer Erhöhung der Interleukin-6 Sekretion, welches ein bekannter Wachstumsfaktor für follikulostellare Zellen ist. Die signifikante Hemmung der Proliferation von FS-Zellen bei Kombination von Kollagen I mit einem anti-IL6-Antikörper läßt darauf schließen, daß Kollagen I die Proliferation und Zytokinsekretion von follikulostellaren Zellen reguliert. Die Fibronektin vermittelte Proliferationsteigerung scheint dagegen einem anderen Mechanismus zugrunde zu liegen. In der kortikotropen Tumorzellinie AtT-20 konnte nachgewiesen werden, daß die ACTH Sekretion durch Fibronektin, Laminin und Kollagen I inhibiert wird. Ein Reporterkonstrukt bestehend aus dem POMC Promoter und Luciferasegen zeigte ähnliche Ergebnisse, was auf eine Hemmung der ACTH Sekretion bereits auf Ebene der POMC-Transkription schließen läßt. Im Gegensatz dazu konnte keine signifikante Veränderung der ACTH Sekretion in normalen Hypophysenzellen festgestellt werden. AtT-20 Zellproliferation wurde durch Kollagen IV und Fibronektin stimuliert, wogegen Kollagen I und Laminin zu einer Inhibition führten. Parallel dazu fand eine Veränderung der Zellform statt. Ein möglicher integrinvermittelter Signalweg umfasst die Aktivierung von Rac, einer kleinen GTPase, mit der konsekutiven Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen (ROS) und einer runden Zellform. Es konnte gezeigt werden, daß eine Inhibition der AtT-20 Proliferation durch Laminin mit einer signifikanten Erhöhung der reaktiven Sauerstoffradikalen und einer runden Zellform einhergeht. Dieser Effekt war mit NAcetylcystein (NAC), einem ROS-Antagonisten, umkehrbar und am ehesten Rac vermittelt. Unter Kollagen IV fand ebenfalls eine Inhibition des Zellwachstums statt. AtT-20 Zellen nahmen auch hier eine runde Zellform an und produzierten, wenn auch weniger stark als Laminin und Kollagen I, ROS. Dieser Effekt war jedoch nicht durch NAC umkehrbar. Kollagen I führte dagegen zu einer Steigerung der Proliferation und ROS-Produktion, sowie zu ausgebreiteten als auch runden Zellen. Diese z.T. gegensätzlichen durch Kollagen I+IV vermittelten Effekte könnten durch simultane Aktivierung alternativer Mechanismen, wie z.B. eine integrinbedingte Aktivierung als auch Hemmung von Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, verursacht sein. Ein weiterer, oft mit Fibronektin assoziierter Signalweg, beinhaltet die integrinvermittelte Aktivierung von Rho, einer weiteren kleinen GTPase. Die fehlende ROS Erhöhung, der Einsatz eines β1-integrin stimulierenden Antikörpers, sowie die integrinunabhängige Stimulation von Rho durch Lysophosphatidatsäure läßt auf eine Rho assoziierte Proliferationserhöhung in AtT-20 Zellen durch Fibronektin schließen. In GH3 Zellen führte Laminin zu einer Abnahme der Prolaktinsekretion und zur Inhibition der Proliferation. Im Gegensatz dazu konnten keine Veränderungen der Prolaktinsekretion in normalen Rattenhypophysenzellen beobachtet werden. Übereinstimmend zeigte sich im Dopamin2 Rezeptor defizienten Mausprolaktinom, einem Knock-Out in vivo Modell für spontane Prolaktinomentwicklung, und humanen Prolaktinom eine bereits sehr frühe Abnahme der Lamininexpression. Diese Hemmung der Lamininexpression während der Prolaktinomgenese könnte einen weiteren Faktor für erhöhte Hormonproduktion und Zellproliferation in Prolaktinomen darstellen. Die hier erstmalig beschriebenen Auswirkungen der extrazellulären Matrix auf Hypophysenzellproliferation und -hormonsekretion verdeutlichen die wichtige, aber wenig erforschte Rolle der ECM in der Hypophyse. Diese Resultate sind nicht nur neue Ansatzpunkte der Hypophysenphysiologie und -pathophysiologie, sondern lassen auch die Weitläufigkeit der unterschiedlichen regulativen Systeme innerhalb der Hypophyse erkennen.
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5.1 Zielsetzung und Hintergrund Geringer sozialer Rückhalt, ein hohes Maß exprimierten Ärgers und zynischer Feindseligkeit sind mit gesteigerter kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität assoziiert. Der isolierte oder kombinierte Einfluss dieser Faktoren auf die Progression der menschlichen koronaren Atherosklerose ist nicht bekannt. Die vorliegende prospektive Studie untersuchte an Patienten mit koronarer Herzerkrankung (KHE) den Einfluss von sozialem Rückhalt, der Art der Ärgerexpression und zynischer Feindseligkeit auf die angiographisch fassbare Progression der koronaren Atherosklerose. 5.2 Methodik Von 223 Patienten mit einer zu Studienbeginn angiographisch dokumentierten KHE schlossen 162 Patienten die Studie nach zwei Jahren mit erneuter Koronarangiographie ab. Eine hinsichtlich aller Patientendaten verblindete Expertenkommission betrachtete die Angiographiefilme paarweise und beurteilte die Krankheitsprogression. Zu Studienbeginn erhielten alle Patienten drei Selbsteinschätzungsfragebögen zur Erfassung psychosozialer Variablen: Fragen zum emotionalen sozialen Rückhalt, das State Trait Anger Expression Inventory (STAXI) und den Cook-Medley Test. Weitere klinische Daten und Routinelaborparameter der Patienten wurden im Studienzeitraum dokumentiert. 5.3 Ergebnisse Für 150 Patienten lagen bei Studienabschluss komplette Fragebögen und angiographische Daten vor. In der bivariaten Analyse der psychosozialen Variablen zeigten nur die Patienten mit hohen STAXI anger out Werten oder geringem sozialen Rückhalt ein erhöhtes Progressionsrisiko. Die multivariate Analyse adjustierte für Störgrößen und etablierte kardiovaskuläre Risikofaktoren und untersuchte die Interaktion psychosozialer Variablen. Nur die Patienten mit der Kombination „starke Ärgerexpression (anger out)“ und „geringer sozialer Rückhalt“ zeigten ein stark erhöhtes Progressionsrisiko (Odds ratio = 30; 95% KI = 5,5-165,1; RR = 3,19). 5.4 Schlussfolgerung Patienten mit KHE, die geringen sozialen Rückhalt erfahren und starke Ärgerexpression aufweisen, haben ein mehrfach gesteigertes Risiko für die Krankheitsprogression, unabhängig von medikamentöser Therapie oder weiteren Standardrisikofaktoren der KHE.
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Da die Prognose für Patienten mit Kopf-Hals-Karzinomen trotz Verbesserung der chirurgischen und strahlen- bzw. chemotherapeutischen Strategien unverändert schlecht ist, werden vermehrt immunologische Therapieansätze erforscht, die eine systemisch wirksame und gleichzeitig tumorspezifische Behandlung ermöglichen sollen. Dadurch soll die Häufigkeit von Lokalrezidiven und Metastasen gesenkt werden. Bispezifische Antikörper werden in diesem Zusammenhang als vielversprechende Therapieoption angesehen. Sie erkennen einerseits Tumorzellen und redirigieren andererseits Immunzellen an den Ort des Tumors. So soll eine immunologische Auseinandersetzung mit dem Tumor angestoßen werden. Komplette bispezifische Antikörper können darüber hinaus akzessorische Zellen binden. Diese Zellen besitzen die Fähigkeit zur Phagozytose und Präsentation phagozytierter Proteine. Hiervon verspricht man sich die Induktion eines langfristigen humoralen Gedächtnisses gegen den Tumor. In der vorliegenden Arbeit wurde der komplette bispezifische Antikörper BiUII (aEpCAM/aCD3) untersucht. Es wurde postuliert, dass dieses Molekül in der Lage sei, sogenannte Tri-Zell-Komplexe aus Tumorzellen, T-Zellen und akzessorischen Zellen zu vermitteln. Die Eingangsexperimente sollten daher die grundlegende Frage klären, welche Zellkontakte durch BiUII herbeigeführt werden können, und ob in vitro Tri-Zell-Komplexe darstellbar sind. Anschließend wurde die antitumorale Wirksamkeit des Antikörpers an Einzelzellen und an dreidimensionalen Tumorzell-Sphäroiden getestet. Mit immunzytochemischen Färbungen an Einzelzell-Präparaten konnte erstmals die Bildung von Tri-Zell-Komplexen nachgewiesen werden. Die durch BiUII angestoßene Immunreaktion führte innerhalb von wenigen Stunden zu einer effizienten Tumorzellelimination. Neben unspezifischen Mechanismen konnte die Phagozytose von Tumorzellen als ein Weg der BiUII-vermittelten Tumorzellzerstörung beobachtet werden. Wir konnten darüber hinaus zeigen, dass BiUII auch in Tumorzell-Sphäroiden, einem dreidimensionalen Modell für Mikrometastasen, zu einer vollständigen Elimination vitaler Tumorzellen führte, ohne dass hierfür die exogene Zufuhr immunstimulatorischer Substanzen erforderlich war. Die beschriebenen in vitro-Ergebnisse zeigen also zum einen, dass der bispezifische Antikörper BiUII diejenigen Anforderungen erfüllt, die aufgrund seiner Konstruktion gefordert wurden und zum anderen, dass das Molekül in vitro ein sehr hohes antitumorales Potential aufweist. Weiterführende Experimente werden unternommen, die die Mechanismen der Tumorzellzerstörung detaillierter beschreiben sollen. Darüber hinaus ist es Ziel der kommenden Untersuchungen, mögliche Komedikationen sowie andere Applikationsformen (z.B. intratumoral) zu testen, um die bei systemischer Gabe beobachteten Nebenwirkungen einzuschränken.
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81 Es wurden in dieser Studie bei 210 gynäkologischen tageschirurgischen Patientinnen intraoperative Wachheit und postoperative Erholung nach Kurznarkosen mit Etomdidate (n=50), Ketamin (n=10), Methohexital (n=50), Midazolam (n=49) und Propofol (n=51) untersucht. Um mögliche intraoperative Wachepisoden der Patientinnen erfassen zu können, wurden die Patientinnen entgegen dem klinischen Alltag während der Narkose aufgefordert, die Augen zu öffnen oder die Hand des Untersuchers zu drücken. Es wurde notiert, ob die Patientinnen daraufhin mit unspezifischen Aufwachreaktionen reagierten oder die Aufforderungen adäquat befolgten. Auch spontan aufgetretene Aufwachreaktionen wurden festgehalten. In dieser Studie wurden in allen fünf Hypnotikagruppen die gleichen Untersuchungstechniken angewendet. Die Pharmakodynamik und Pharmakokinetik der jeweiligen Hypnotika differierten allerdings teilweise erheblich und sind nicht immer ausreichend berücksichtigt worden, so dass die nachfolgend aufgeführten Ergebnisse kritisch zu bewerten sind und auf den klinischen Alltag zu übertragen sind. Bei dem hier angewandten Narkoseverfahren, d.h. Nachinjektionen der Anästhetika bolusweise anstatt als Dauerinfusion und nicht EEG-kontrolliert, fand sich, dass intraoperative Wachheit relativ häufig und unabhängig von der Art des Eingriffs bei Kurznarkosen mit Etomidate, Ketamin, Methohexital, Midazolam und Propofol auftrat: Von 210 untersuchten Patientinnen reagierten insgesamt 72% (152 von 210 Patientinnen) unspezifisch mit Aufwachreaktionen, spontan oder nach Ansprechen, oder befolgten gezielt Aufforderungen. Das Ausmaß der intraoperativen Wachheit hing bis zu einem gewissen Grad auch von dem verwendeten Hypnotikum ab: Die Zahl der intraoperativen Aufwachreaktionen und befolgten Aufforderungen lag in den untersuchten Patientinnengruppen zwischen 13,5% (Propofol) und 86% (Ketamin). Das Risiko, dass bei einer Patientin intraoperative Wachheit auftrat, erwies sich aufgrund der fehlenden EEG-Kontrolle als schwer einschätzbar: Bei einigen Patientinnen fehlten Anzeichen einer intraoperativen Wachepisode wie z.B. Unruhe oder spontane Aufwachreaktionen. Diese Patientinnen wirkten bewusstlos, befolgten aber auf Ansprache Aufforderungen. In allen Untersuchungsgruppen hätte das Auftreten intraoperativer Wachepisoden verringert werden können, wenn die Anästhetika per infusionem konstant verabreicht und sogar vermieden werden können, wenn die Narkosetiefe mittels EEG kontrolliert worden wäre. In dieser Studie wurden unterschiedliche Stufen intraoperativer Wachheit eingeteilt: a) Intraoperative Wachheit mit bewusster Erinnerung des Patienten daran 1. Erinnerbare bewusste Wachheit mit Schmerz
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Oxidiertes “Low density Lipoprotein“ (LDL) trägt durch Aktivierung von vaskulären End othelzellen und Thrombozyten zum Fortschreiten der Atherosklerose bei. Da die durch milde oxidiertes LDL (mox-LDL) aktivierten Signalwege in Endothelzellen und Thrombozyten bisher nur unzureichend charakterisiert waren, wurden sie in dieser Arbeit näher untersucht. Weiterhin wurde ausgehend von der Beobachtung, daß es bei milder Oxidation von LDL zur Bildung von Lysophosphatidsäure (LPA) kommt, und daß LPA die spezifische Thrombozyten- aktivierende Substanz im milde oxidierten LDL ist, in dieser Arbeit in in vitro Modellen untersucht, ob LPA und das strukturell und funktionell verwandte Lysophospholipid Sphingosin- 1-Phosphat (S1P) Signalwege regulieren, die zur pathologischen Aktivierung von Thrombozyten und Endothelzellen beitragen. Als Modellsysteme wurden unter anderem die endotheliale Permeabilität und der Plättchen-“shape change“ herangezogen. Es konnte gezeigt werden, daß milde oxidiertes LDL und LPA sowohl in Endothelzellen als auch in Thrombozyten - über Membran-gebundene LPA-Rezeptoren - die GTPase Rho und deren Effektor- Molekül Rho-Kinase aktivieren. Rho-Kinase hemmt die Myosin Leichtketten Phosphatase, wodurch es zum Anstieg der Myosin Leichtketten Phosphorylierung kommt. Myosin Leichtketten Phosphorylierung führt (i) zur Kontraktion von Endothelzellen, die wiederum einen Anstieg der endothelialen Permeabilität auslöst, und (ii) zur Formveränderung (shape change) von Thrombozyten, dem ersten Anzeichen der Plättchen-Aktivierung. Das Lysophospholipid S1P dagegen induziert in Endothelzellen sequentiell (1) Rho/Rho-Kinase abhängige Myosin Leichtketten Phosphatase-Inaktivierung, Myosin Leichtketten Phosphorylierung und Endothelzellkontraktion, (2) Rac abhängige Myosin Leichtketten Phosphatase-Aktivierung, Ausbildung von “membrane ruffles“ und Endothelzellausbreitung und (3) erneute Rho/Rho- Kinase abhängige Myosin Leichtketten Phosphatase-Inaktivierung und Endothelzellkontraktion. Das durch S1P regulierte Wechselspiel zwischen Rho- und Rac-Aktivität und die dadurch regulierten Sequenzen von Zellkontraktion und -ausbreitung sind wahrscheinlich für die Endothelzellmigration im Rahmen von Angiogenese und Wundreparatur von Bedeutung. Den Lysophospholipiden könnte also eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Atherosklerose und in der Regulation von Angiogenese und Wundreparatur zukommen. Die pharmakologische Hemmung des Rho/Rho-Kinase Signalweges könnte möglicherweise einen neuen Ansatzpunkt zur Behandlung der Atherosklerose darstellen.
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In der vorliegenden Studie wurden Stoffwechsel und Transfer der DHA aus der Nahrung bei stillenden Müttern untersucht. Insgesamt nahmen 10 Mütter, die wir nach Entbindung in der I. Universitäts-Frauenklinik München rekrutierten, an der Auswertung der Studie teil. Die Teilnehmer erhielten 4 Wochen post partum entweder ein DHA- Nahrungssupplement (DHASCOä; DHA: 40+2 Gew.%; 200 mg DHA/Tag) oder ein Placebo. Die Zuteilung in die Gruppen geschah randomisiert und doppelblind. Die Supplementierung erfolgte über einen Zeitraum von zwei Wochen. In dieser Zeit wurden die Mütter angehalten, keinen Fisch oder Fischprodukte zu sich zu nehmen und für 7 Tage ein Nahrungsprotokoll zu führen. Im Anschluß daran wurde den Müttern beider Gruppen ein stabiles Isotop (13C- DHASCOä) in einer Dosierung von 2 mg/kg Körpergewicht oral gegeben. Diese Dosierung liegt in einem relativ niedrigen Bereich und konnte den Müttern in der Stillzeit ohne Bedenken gegeben werden. Der Tracer bestand zu einem hohen Anteil aus 13C-markierter DHA. Die Oxidation der im Tracer enthaltenen Fettsäuren wurde nach vorheriger indirekter Kalorimetrie mit Hilfe des 13C-Atemtestes gemessen. Anreicherung und Konzentration von DHA und anderen Fettsäuren wurden in Muttermilch und Plasma bestimmt. Die Proben wurden bis 48 Stunden nach Tracergabe gesammelt. In der vorliegenden Studie wurde erstmalig der Stoffwechsel von 13C- markierter DHA bei stillenden Müttern untersucht. Bezüglich der Oxidation von 13C-DHASCOä konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden. Die maximale Anreicherung war in der DHA-supplementierten Gruppe etwas früher als in der Kontrollgruppe. Im Vergleich zu 13C- markierter Linolsäure wurde 13C- DHASCOä schneller oxidiert, was möglicherweise an den kurzkettigen, gesättigten Fettsäuren liegen könnte, die in unserem Tracer enthalten waren. In der kumulativen Wiederfindung lagen die Werte für die Oxidation von Linolsäure und DHASCOä in einem vergleichbaren Bereich und erreichten etwa 15 % des verabreichten Tracers nach 48 Stunden. Die Fettsäurezusammensetzung der Muttermilch zeigte zu Studienbeginn keine signifikanten Unterschiede zwischen supplementierter und Placebo-Gruppe. Die gemessenen Werte lagen in einem Bereich, der mit dem in anderen Studien vergleichbar ist. Nach der zweiwöchigen Supplementierung beobachteten wir einen statistisch signifikant höheren DHA-Gehalt in der supplementierten Gruppe. Während der DHA-Gehalt der Muttermilch in dieser Gruppe um 28 % zugenommen hatte, wurde in der Placebogruppe ein Abfall von 25 % beobachtet. Etwa 20 % der supplementierten DHA wurden in die Muttermilch sezerniert. Eine maximale Anreicherung von 13C-markierter DHA, Myristin-, Palmitin- und Ölsäure zeigte sich 12 Stunden nach Tracergabe in beiden Gruppen. DHA, Palmitin- und Ölsäure zeigten eine ähnliche Kinetik über 24 Stunden und waren auch in ihrer kumulativen Wiederfindung vergleichbar. Dieses weist darauf hin, daß es keinen selektiven Transfer der DHA in die Muttermilch gibt. Auffällig war ein deutlich geringerer Transfer der Myristinsäure in die Muttermilch, was an einer höheren Oxidation dieser mittelkettigen Fettsäure liegen könnte. In den Plasma-Phospholipiden und -Triglyceriden konnte nach zweiwöchiger Supplementierung ein deutlich höherer DHA-Gehalt in der supplementierten Gruppe gemessen werden. Die Cholesterolester blieben unbeeinflußt. Die DHA zeigte eine bevorzugte Verteilung in die Fraktion der Phospholipide mit durchschnittlich 87,5 %. 13C-markierte DHA reicherte sich zunächst in den Plasma-Triglyceriden an. Die maximale Anreicherung lag 6 bzw. 3 Stunden (bei einer Probandin mit zusätzlichen Messungen) nach Tracergabe. In den Plasmaphospholipiden waren 24 Stunden nach Tracergabe ca. 86 % der 13C-markierten DHA nachweisbar. Die Cholesterolester zeigten nur eine leichte Anreicherung. Wir konnten keine Anreicherung von 13C-EPA, und nur eine geringe Anreicherung von 13CDPA messen. Die Beurteilung, ob ein Teil davon durch Retrokonversion aus DHA entstanden ist, war leider nicht möglich, da DPA auch zu einem kleinen Anteil im Tracer enthalten war. Dennoch scheint die Hypothese, daß die Retrokonversion von DHA in andere n-3-Fettsäuren von nur geringer Bedeutung ist, bestätigt. Schlußfolgernd läßt sich sagen, daß die mütterliche DHA-Aufnahme mit der Nahrung einen wesentlichen Faktor für ihren Gehalt in den mütterlichen Plasmalipiden und der Muttermilch darstellt. Der größte Teil der DHA scheint jedoch aus mütterlichen Fettdepots zu stammen, welche natürlich ihrerseits über entsprechende Langzeitfolgen der Ernährung zu beeinflussen sind. Empfehlungen zur Ernährung von schwangeren und stillenden Frauen sollten auf jeden Fall eine adäquate DHA-Zufuhr berücksichtigen.
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Die Produktion heterologer, medizinisch verwertbarer Proteine in Tieren ist heute ein Standardverfahren und viele Spezies haben sich als hierfür geeignet erwiesen. Das Huhn sollte sich besonders als Bioreaktor eignen, es verfügt zum einen über kurze Generationszeiten, und in seinem Eileiter werden täglich grosse Mengen Protein gebildet und im Ei ausgeschieden. Dennoch war es bis heute, trotz zahlreicher Anstrengungen von verschiedenen Arbeitsgruppen nicht gelungen, den Organismus eines Huhnes genetisch derart zu verändern, dass ein heterologes Protein im Eileiter gebildet, und im Ei nachweisbar ausgeschieden wird. Im Rahmen der Experimente, die in dieser Dissertation vorgestellt werden, ist es erstmals gelungen im Eileiter des Huhnes ein heterologes Protein, EPO, zu exprimieren. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Protein aus den Zellen des Eileiters ausgeschleust wird und schliesslich im gelegten Ei in grosser Menge zu finden ist. Hierzu wurden geeignete Genkonstrukte kloniert, in vitro in primären Eileiterzellen getestet, und schliesslich per Gengun-Verfahren in vivo in den Eileiter eingebracht. Die Expression erfolgte unter der Kontrolle des viralen CMV-Promotors, das EPO-Protein war in den Eiern der positiv getesteten Tieren über Wochen nachweisbar. Aufgrund dieses Erfolges wurde versucht eine gewebespezifische Expression unter der Kontrolle des Ovalbuminpromotors zu erreichen. Es gelang ein geeignetes Promotorkonstrukt zu identifizieren und zu klonieren, sowie in vitro eine gewebespezifische Expression von ß-Galactosidase zu erreichen, eine Expression von EGFP und EPO konnte jedoch nicht sicher nachgewiesen werden. Ursächlich hierfür ist das komplexe Regulierungssystem des Ovalbuminpromotors, das durch Transfektionsverfahren empfindlich gestört wird und in vitro-Versuche beinahe unmöglich macht. Unter zu Hilfenahme eines alternativen Transfektionsverfahrens, der Virofektion gelang es jedoch unter der Kontrolle des Ovalbuminpromotors in vivo einmalig EPO-Expression in das Hühnerei nachzuweisen. Experimente, die nach Abschluss der Arbeiten an dieser Dissertation durchgeführt wurden, haben die Funktionsfähigkeit der retroviralen Konstrukte bestätigt. Insbesondere konnte unter der Kontrolle des Ovalbuminpromotors eine zellspezifische Expression von ErythropoietinErythropoietin wird aktuell auf seine biologische Aktivität untersucht, die Veröffentlichung der Ergebnisse befindet sich in Vorbereitung. erreicht werden, die Transfektion hat sich als stabil erwiesen. Das so gewonnene
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In der von der Wilhelm Sander-Stiftung geförderten Studie „Pathogenetische Bedeutung von Störungen des Oxidantien/ Antioxidantien-Gleichgewichtes bei Lungengerüsterkrankungen“, sollten die pathogenetisch relevanten oxidativen Faktoren für die Entstehung fibrotischer Lungenveränderungen identifiziert und ihr Zusammenspiel näher untersucht werden. In diesem Rahmen entstand auch diese Arbeit, die zum Ziel hatte, eine Methode zu etablieren, die extrazelluläre biologische Wirksamkeit der Sauerstoffradikale von ex vivo kultivierten Alveolarmakrophagen zu erfassen. Zudem sollte das Ausmaß der Radikalbildung von Alveolarmakrophagen bei interstitiellen Lungenerkrankungen als möglicher funktioneller Beitrag zur Fibroseentstehung gemessen werden sowie eine neue, spezifischere Methode zur Aktivitätsbeurteilung bei interstitiellen Lungenerkrankungen evaluiert werden. Es wurden insgesamt 16 Kontrollpersonen, fünf gesunde Raucher, 24 Patienten mit fibrosierender und vier Patienten mit subklinischer Alveolitis sowie sieben Patienten mit Sarkoidose, sieben Patienten mit EAA und acht Patienten nach LTx/HLTx untersucht. Lavagezellen wurden auf Plastikplatten ausgesät, AM konnten so adhärieren, die übrigen Zellen wurden abgespült und die Platten mit einer 50 µM Glutathionlösung inkubiert. Der Abfall des reduzierten Glutathions in der Testlösung wurde durch Zugabe von Ellmanns Reagenz gemessen. Zusätzlich wurden andere Parameter des Oxidantien/ Antioxidantienhaushaltes, die Zellzahl und Zelldifferenzierung in der BALF und der zelluläre Glutathionstoffwechsel, untersucht. Anhand der gewonnenen Ergebnisse werden die aufgeworfenen Fragen wie folgt beantwortet: • Es wurde eine Methode entwickelt, die den biologisch tatsächlich wirksamen Effekt der Oxidantienproduktion von Alveolarmakrophagen anhand der Oxidation des biologisch relevanten Antioxidans Glutathion mißt und somit ex vivo die extrazelluläreWirksamkeit der Oxidantienproduktion erfaßt. • Das Ausmaß der Oxidantienproduktion der Alveolarmakrophagen weist in der Zusammenschau mit den übrigen Parametern, dem Methioninsulfoxidgehalt der BALF-Proteine und der Konzentration an Glutathion in der BALF sowie der BALF-Zytologie, auf eine relevante Rolle der oxidativen Aktivität der Alveolarmakrophagen zumindest für oxidative Läsionen im Kompartiment der ELF hin. • Die oxidative Aktivität von Alveolarmakrophagen bei der ILD, der EAA und nach LTx/HLTx sind sowohl vor, als auch nach Stimulation im Vergleich zum Kontrollkollektiv signifikant erhöht. Bei gesunden Rauchern liegt eine erhöhte Stimulierbarkeit der oxidativen Aktivität der AM vor. • Die Gesamtzellzahl in der BALF, die Verminderung des AMAnteiles und die Erhöhung des PMN-Anteiles in der BALFZelldifferenzierung, die bisher zur Verlaufsbeurteilung fibrosierender Lungenerkrankungen herangezogen wurden, sind hinsichtlich oxidativer Phänomene vergleichsweise unspezifische Parameter. Mit Hilfe der Messung der oxidativen Aktivität pulmonaler Entzündungszellen kann ein Aspekt des tatsächlich wirksamen zellvermittelten Beitrags zum aktuellen Entzündungsgeschehen quantifiziert werden. • Die Befundkombination einer erhöhten spontanen und stimulierten oxidativen Aktivität kultivierter AM mit einer verminderten GSHred-Konzentration in der BALF war mit einer erhöhten Met(O)-Bildung als Ausdruck oxidativer Proteinläsionen assoziiert und fand sich bei Krankheitsbildern, die gewöhnlich mit einer progressiven Fibrose und Destruktion peripherer bronchopulmonaler Strukturen einhergehen. Dies könnte als wichtiger Hinweis auf einen Zusammenhang zwischen oxidativer Belastung und Fibrose gedeutet werden. Um die tatsächliche klinische Bedeutung oxidativer Lungenparenchymschäden zu analysieren, könnten antioxidative Therapiestrategien bei Patienten mit fibrosierenden Lungenerkrankungen eingesetzt werden. Eine entsprechende Pilotstudie mit N-acetylcytein als Glutathion-Precursor wurde bereits erfolgreich abgeschlossen (Behr et al., 1997; Behr et al., zur Publikation angenommen Oktober 2001). Seit März 2000 läuft eine entsprechende europäische Multicenterstudie (IFIGENIA).e
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Der Einsatz von allogenen Blutkonserven bei hämorrhagischem Schock ist durch den hohen logistischen Aufwand der Kreuzproben und die Knappheit von Spenderblut limitiert. Deshalb ist die Erforschung eines künstlichen Blutersatzstoffs ein internationales Ziel der chirurgischen und intensivmedizinischen Forschung. Ziel dieser experimentellen Studie war die Analyse der Mikrozirkulation des Pankreas der Ratte nach intravenöser Applikation der modifizierten Hämoglobinlösung Diaspirin cross-linked hemoglobin (DCLHb, HemAssist). Durch die Anwendung der intravitalen Videofluoreszenzmikroskopie konnte der Perfusionsparameter funktionelle Kapillardichte nach Injektion des Fluoreszeinmarkierten Plasmamarkers HAES als Länge der mit Erythrozyten perfundierten Kapillaren pro Beobachtungsfeld im exokrinen Pankreas quantitativ erfaßt werden. Zur Darstellung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion nach einem Entzündungsreiz erfolgte die Messung der Adhärenz von in vivo mit Rhodamin 6G gefärbten Leukozyten am Endothel postkapillärer Pankreasvenolen. Diese Parameter wurden unter folgenden Versuchsbedingungen erhoben: 1) Unter Kontrollbedingungen erfolgte eine intravenöse topload-Infusion von DCLHb in zwei Versuchsgruppen (je n=7) in einer Dosierung von 400 und 1400 mg/kg Körpergewicht. 2) Durch temporäre Okklusion aller vier das Pankreas versorgenden Arterien über 1h wurde eine postischämische Pankreatitis induziert; zu Beginn der Reperfusion erfolgte eine topload-Infusion von DCLHb (400 mg/kgKG). 3) Zur Auslösung eines hämorrhagischen Schocks wurde Tieren arterielles Blut bis zum Erreichen eines mittleren arteriellen Blutdrucks von 40 mmHg entnommen; dieser Blutdruckwert wurde durch weitere Entnahme von Blut über 60 Minuten konstant gehalten. In zwei Therapiegruppen wurde den Tieren Vollblut bzw. DCLHb appliziert, wobei das gegebene dem entnommenen Blutvolumen entsprach. In allen drei Untersuchungen erhielten Tiere in identisch behandelten Kontrollgruppen isovolämische Infusionen einer kolloidalen Hydroxiäthylstärkelösung (HAES). Die Analyse der Mikrozirkualtion am ausgelagerten Pankreas erfolgte an drei unterschiedlichen Meßzeitpunkten über einen Beobachtungszeitraum von 120 Minuten nach Injektion der Lösungen. Zur zusätzlichen Charakterisierung des inflammatorischen Schadens des Pankreas wurde in den beiden topload Studien die Messung der Amylaseaktivität und der Konzentration von Interleukin-6 im Serum durchgeführt. In der Schockstudie wurde die Lipidperoxidation im Pankreasgewebe mittels TBARM-Assay quantifiziert. Unter Zuhilfenahme dieser Methodik konnten die eingangs gestellten Fragen wie folgt beantwortet werden: 1) Unter Kontrollbedingungen beobachteten wir nach Infusion von 1400 mg/kg KG DCLHb eine Zunahme der funktionellen Kapillardichte um 18% im Vergleich zu der mit HAES beziehungsweise mit 400 mg/kg KG DCLHb behandelten Versuchsgruppe. Die Adhärenz von Leukozyten in postkapillären Venolen und die gemessenen Plasmaparameter blieben unverändert. Somit ergab sich unter Kontrollbedingungen kein Hinweis auf die Auslösung einer Mikrozirkulationsstörung durch DCLHb. 2) Normotherme Ischämie und Reperfusion des Pankreas führten in der mit HAES behandelten Versuchsgruppe im Vergleich zu nichtischämischen Kontrolltieren zum signifikanten Abfall der funktionellen Kapillardichte, zur Zunahme der Leukozyten- Endothel-Interaktion und zu einer Reduktion des mittleren arteriellen Blutdrucks um etwa 31%. Hingegen beobachteten wir nach der topload-Infusion mit DCLHb (400 mg/kg Kg) zu Beginn der Reperfusion eine signifikante Verbesserung der funktionellen Kapillardichte, eine signifikante Reduktion der Leukozyten-Endothel- Interaktion und einer Wiederherstellung des mittleren arteriellen Blutdrucks auf Kontrollwerte. Eine Aggravierung der postischämischen Pankreatitis durch die Infusion von DCLHb konnte in diesem Modell nicht bestätigt werden. 3) Die Primärtherapie mit DCLHb war nach Induktion eines hämorrhagischen Schocks durch die signifikant bessere Wiederherstellung der funktionellen Kapillarperfusion und des mittleren arteriellen Blutdrucks dem Kolloid Hydroxiäthylstärke überlegen und erzielte vergleichbare Werte wie in der Vollblut-behandelten Gruppe. Es kam zu keiner Erhöhung der Adhärenz von Leukozyten in postkapillären Pankreasvenolen bei den mit DCLHb therapierten Tieren. Eine signifikant erhöhte Lipidperoxidation im Pankreasgewebe nach Infusion der beiden Sauerstoff-transportierenden Lösungen im Vergleich zur HAES-Behandlung kann durch die verbesserte Reperfusion erklärt werden. Hinsichtlich der Effektivität als Blutersatztherapie ist die Infusion von DCLHb nach Hämorrhagie mit konserviertem Vollblut vergleichbar. Im Rahmen von klinischen Studien mit DCLHb wurde bei einigen Patienten ein Anstieg der Amylaseaktivität im Serum und in wenigen Fällen eine akute Pankreatitis beobachtet, deren Ursache nicht vollständig geklärt werden konnte. Die aus diesen Veränderungen abgeleitete These, daß DCLHb durch NO-Scavenging, Endothelin-Freisetzung und vermehrte Sauerstoffradikalbildung in der Mikrozirkulation des exokrinen Pankreas eine Pankreatitis-induzierende Wirkung besitzt, konnte durch unsere Versuche widerlegt werden.
