Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19 Archiv

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung, Validierung und Anwendung einer HPLC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Tryptophan und seinen Metaboliten. Der Stoffwechsel der proteinogenen, essentiellen Aminosäure Tryptophan umfasst nicht nur den Neurotransmitter Serotonin und das in der Epiphyse gebildete Hormon Melatonin, sondern er schließt auch den Kynurenin Pathway mit ein. Die neurobiochemische Bedeutung dieses Stoffwechselweges wird bereits durch die Tatsache offensichtlich, dass im zentralen Nervensystem mehr als 95% des Tryptophans über diesen Weg metabolisiert werden. Die Intermediate des Kynurenin Pathways spielen eine bedeutende Rolle als Mediatoren zwischen Immun- und Nervensystem. Dabei nehmen sie potenziell Einfluss auf höhere zentralnervöse Funktionen, wie Kognition, Verhalten und Affekt, weshalb sie von herausragender Bedeutung für das Forschungsgebiet der Psychoneuroimmunologie sind. Auf molekularer Ebene wird Tryptophan im ersten Schritt durch die beiden Schlüsselenzyme Tryptophan-2,3-dioxygenase und Indoleamin-2,3-dioxygenase zu N-Formylkynurenin oxidiert. Durch Kynureninformidase erfolgt eine Metabolisierung von N-Formylkynurenin zu Kynurenin - der Ausgangssubstanz des gleichnamigen Stoffwechselweges. Während die Tryptophan-2,3-dioxygenase ausschließlich Tryptophan oxidiert, ist die Indolamin-2,3-dioxygenase nicht nur für den Abbau von Tryptophan spezifisch, sondern für alle Indolamine, inklusive Serotonin und Melatonin. Die Aktivität der Tryptophan-2,3-dioxygenase wird dabei durch Glucocorticoide, die der Indolamine-2,3-dioxygenase durch bestimmte Zytokine reguliert. Die Indolamin-2,3-dioxygenase spielt ebenfalls eine wichtige Rolle in der Modulation der T-Zell-Toleranz. Des Weiteren werden die Aktivitätszustände diverser Zellen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems durch Metabolite des Kynurenins gesteuert. Einige Bestandteile des Kynurenin Pathways besitzen neuroprotektive oder neurotoxische Eigenschaften. So ist beispielsweise die neuroprotektive Kynureninsäure der bisher einzige bekannte endogene Antagonist des NMDA-Rezeptors und zusätzlich ein nichtkompetitiver Antagonist des α7-nikotinischen Acetylcholinrezeptors. Dieser Substanz steht der alternative Kynurenin-Metabolit, das exzitotoxische Neurotoxin Chinolinsäure gegenüber, welcher ein Agonist des NMDA-Rezeptors ist. Bei Untersuchungen zum Tryptophanstoffwechsel ist es daher von entscheidender Bedeutung nicht nur einzelne Substanzen sondern die Gesamtheit der Metabolite zu quantifizieren. Nur so kann die Balance zwischen neuroprotektiven und neurodegenerativen Substanzen, aber auch die Balance zwischen inhibierenden und aktivierenden Mediatoren des Immun- und Nervensystems dargestellt werden. In klinischen Studien können so Dysbalancen mit der Pathogenese einzelner Erkrankungen assoziiert werden, wodurch die Möglichkeit besteht, dass Biomarker zur frühzeitigen Diagnose identifiziert und neue Therapieansätze postuliert werden können. In dieser Arbeit wird eine neue HPLC-MS/MS-Methode vorgestellt, mit der eine bisher unerreichte Vielfalt an Tryptophan-Metaboliten quantifiziert werden kann. Die Probenvorbereitung ist eine einfache und kosteneffiziente Proteinfällung in zwei Stufen, wobei unterschiedliche Matrices, wie beispielsweise Serum oder Liquor cerebrospinalis, als Probenmaterial verwendet werden können. Um Analyte mit sehr niedrigen physiologischen Konzentrationen zu detektieren, wurde für diese eine Derivatisierung entwickelt. Die Methode benötigt ein sehr geringes Probenvolumen, ist durch die Verwendung der HPLC-MS/MS-Technologie äußerst sensitiv und spezifisch und umfasst alle bedeutenden Metabolite des Tryptophanstoffwechsels mit nur einer Probenvorbereitung. Die Robustheit wurde in einer ausführlichen Validierung bestätigt. Dabei wurden auch die analytischen Grenzwerte und Kennzahlen ermittelt, sowie die Stabilität der Proben untersucht. In Versuchen zu präanalytischen Einflüssen wurde festgestellt, dass unterschiedliche Zeitpunkte der Blutentnahme, unterschiedliche Blutentnahmesysteme und die Nahrungsaufnahme zu gravierenden Änderungen der Konzentrationen der Analyte führen. So führt die Verwendung unterschiedlicher Blutentnahmesystem beispielsweise bei der Quantifizierung des Metaboliten Picolinsäure zu Ergebnissen, die sich um bis zu 60% unterscheiden. Es wurde nachgewiesen, dass es postprandial zu starken interindividuell unterschiedlichen Änderungen der Konzentrationen einzelner Intermediate kommt. Dabei verhalten sich die freien und proteingebundenen Metabolite ebenfalls unterschiedlich. Deshalb muss für Studien eine normierte Probengewinnung mit möglichst exakten Bedingungen eingeführt werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Metabolisierung des Tryptophans in vivo einer circadianen Rhythmik unterliegt. Aufbauend auf diesen Erkenntnisse wurden in einem in vitro Experiment tageszeitabhängige Schwankungen nachgewiesen und der Einfluss einer LPS-Stimulation auf den Kynurenin Pathway untersucht. Durch den Einsatz dieser neuen HPLC-MS/MS-Methode besteht die Möglichkeit, die funktionellen Zusammenhänge zwischen Intermediaten des Kynurenin Pathways und diversen immunologischen, neurochemischen und anderen pathophysiologischen Vorgängen zu untersuchen. In der Literatur gibt es eine Vielzahl an Hinweisen darauf, dass der Tryptophanstoffwechsel an der Pathogenese unterschiedlichster Erkrankungen beteiligt ist. Jedoch bedarf es der genauen Klärung der Zusammenhänge und der Möglichkeit, die Gesamtheit einer potentiellen Störung des Tryptophanstoffwechsels zu erfassen. So sind im Bereich psychiatrischer und neurologischer Erkrankungen beispielsweise Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington und Epilepsie zu nennen. Hier wurden in publizierten Studien häufig nur einzelne Metabolite quantifiziert und isoliert betrachtet. Darüber hinaus konnten unterschiedliche Arbeitsgruppen zeigen, dass eine Aktivierung des Kynurenin Pathways auch bei der Pathogenese von Tumoren beteiligt ist, weshalb auch hier die von uns entwickelte Methode für weitere Studien von großem Nutzen ist.

The highly conserved protein actin is the building block in the cytoskeleton of eukaryotic cells and provides a structural framework known as the microfilament system.The molecular principle of actin-based amoeboid movement was so successful in evolution that it was kept nearly identically from lower (e.g. amoebae) to higher (e.g. neutrophils) eukaryotes.To understand this type of cellular movement one has first to identify and to characterize the proteins which play a major role during the dynamic rearrangement of actin. The collection of actin isoforms, of actin-variants and actin related proteins (Arps) in a given cell is known as the 'actinome' whose number of proteins can be quite different from one organism to the next. Therefore, the present work describes studies on the actinome of thesocial amoeba Dictyostelium discoideum, compares the findings with actinomes from other organisms, and discusses similarities and alterations that might have happened during evolution. D. discoideum is among the oldest organisms which exhibit actin-based amoeboid movement, the genome is completely sequenced and the system can be easily studied by molecular and biochemical approaches. The study was started using bioinformatics and the computational methods provided a global view on the D. discoideum actinome. It turned out that the D. discoideum genome conprises a total of 33 actin and 8 Arp genes, seven actin genes are putative pseudogenes. Interestingly, there are 17 distinguishable actin genes which code for identical proteins. Phylogenetic analyses helped to understand the putative duplication events during evolution. Modelling of the three-dimensional structures showed that the typical actin-fold, the ATP-binding pocket, and other functional domains are highly conserved. Homologues of the members of the D. discoideum actinome across various model organisms clearly demonstrated which amino acids in conserved domains are of special importance. All Arp subfamilies that are found in mammals are also present in D. discoideum. Two of the actin related proteins, Arp5 and Arp6, were selected for molecular and cellular studies. Using fluorescently labeled fusion proteins first data indicated that both Arps are present also in the nucleus, suggesting an involvement in chromatin reorganization.

Systemische Immunsuppression nach Herztransplantation wurde in den letzten zwanzig Jahren fast ausschließlich unter Zuhilfenahme von Calcineurininhibitoren (CNI) wie Tacrolimus oder Ciclosporin A durchgeführt. Diese Medikamente besitzen jedoch ein erhebliches Nebenwirkungsprofil, und reduzieren insbesondere aufgrund ihrer Nephrotoxizität die Lebensqualität und Lebenserwartung der Patienten. Mit Proliferations-Signal-Inhibitoren wie Sirolimus und Mycophenolat Mofetil (MMF) stehen jedoch auch Immunsuppressiva zu Verfügung die ein anderes Nebenwirkungsprofil besitzen. Frühere Studien, mit dem Versuch Therapieregime zu ändern, auf Calcineurininhibitoren zu verzichten und ausschließlich auf Sirolimus und MMF zu wechseln, brachten vielversprechende Ergebnisse in Bezug auf Abstoßungsfreiheit und Transplantatvaskulopathie. Die Nierenfunktion konnte durch den Therapiewechsel erhalten werden und eine fortschreitende Nierenschädigung sogar verhindert werden (Fenandez-Valls M.2005). Alle diese bisherigen Untersuchungen basierten jedoch auf Studienprotokollen, die ein spätes Absetzen der Calcineurininhibitoren vorsahen. In dieser Studie wurden fünfzehn Patienten unmittelbar ab dem Zeitpunkt der orthotopen Herztransplanatation mit einer Calcineurininhibitor freie Immunsuppression behandelt. Als Basis- immunsuppression erhielten die Patienten Sirolimus (Rapamune, Wyeth Pharma, Münster) mit angestrebtem Plasmaspiegel zwischen 10 und 15ng/ml, MMF (Cellcept, Roche Pharmaceuticals AG, Basel, Schweiz) mit angestrebtem Talspiegel zwischen 1,5 und 4 µg/ml, sowie Corticosteroide (Prednisolut, Mibe GmbH, Sandersdorf-Brehna) mit einer Dosis von initial 1mg/kg/Tag auf 0,1mg/kg/Tag ausgeschlichen. Die Patienten wurden über einen Zeitraum von fünf Jahren nachuntersucht. Dabei wurde neben dem Überleben der Patienten unter anderem die Häufigkeit von Abstoßungsreaktionen, Transplantatvaskulopathie, Pumpfunktion des Grafts, Nierenfunktion sowie Lipid und Glucosestoffwechsel beobachtet. Unsere Studie zeigte, dass de novo Calcineurininhibitor-freie Immunsuppression nach Herztransplantation mit guten klinischen Ergebnissen möglich ist, 14 der 15 in die Studie eingeschlossenen Patienten waren nach fünf Jahren am Leben. Die Anzahl der Abstoßungsreaktionen war jedoch höher als unter konventioneller Immunsupression. In unserer Studie, mit komplett CNI freiem Therapieprotokoll, war nach fünf Jahren lediglich bei 40% der Patienten keine Abstoßungsreaktion aufgetreten. Im Rahmen der Transplantatvaskulopathie kommt es nach Herztransplantation häufig zu einer Intimaproliferation und so zu einer Einengung der Gefäßdurchmesser. Die TVP stellt langfristig die primäre Ursache für ein Transplantatversagen dar und führt so entweder zum Tode oder zu einer erneuten Transplantation. In unserer Kohorte wurde über einen Beobachtungszeitraum von 5 Jahren keine Transplantatvaskulopathie beobachtet. Die Serumtriglyceridspiegel waren trotz Therapie mittels Statinen erhöht. Die chronische Nierenschädigung durch Calcineurininhibitoren ist irreversibel und die Nierenfunktion kann sich nur in geringem Maße erholen, wenn diese abgesetzt werden (Ojo AO, 2003). Sowohl MMF als auch Sirolimus haben keine nephrotoxischen Effekte und die Kombination beider verspricht einen Erhalt der Nierenfunktion über lange Zeit. Die Nierenfunktion in unserer Kohorte blieb nicht nur stabil, sondern verbesserte sich sogar leicht in dem Zeitraum der 5-Jahres Untersuchung. In keinem Fall wurde eine Nierenersatztherapie erforderlich. Die Kombination von MMF und Sirolimus mit kompletter Vermeidung von Calcineurininhibitoren scheint die Nierenfunktion zu erhalten und verbessert daher auch das Langzeit - Überleben. Während die Nephrotoxizität vermieden werden konnte, traten aber häufig andere nachteilige Ereignisse auf. Chirurgische Interventionen aufgrund von Perikardergüssen wurden in 5 Fällen erforderlich. Auch Pleuraergüsse, periphere Ödeme und venöse Thrombosen wurden beobachtet. Zwei Patienten mussten zwischenzeitlich aus der Studie genommen werden, da schwere gastrointestinale Nebenwirkungen auftraten. In drei Fällen wurde eine Konversion zu Calcineurininhibitoren nötig, da verzögerte Wundheilung auftrat, die eventuell auf den antiproliferativen Effekten von Sirolimus auf Fibroblasten beruht. Beim Vergleich mit Calcineurininhibitor basierter Immunsuppression, sollten uns mehrere Ergebnisse davor warnen, diese Therapie als Standard nach Herztransplantation zu verwenden. Allen voran die Anzahl der Abstoßungsreaktionen. Diese können schwerwiegende Folgen haben und schlimmstenfalls zu irreversiblem Transplantatversagen führen. Für Patienten, die beispielsweise ein beginnendes Nierenversagen haben, ist diese Immunsuppression jedoch ins Auge zu fassen. Unsere Daten zeigen einen außergewöhnlichen Effekt in Bezug auf das Auftreten der Transplantatvaskulopathie, dem Verlauf der Nierenfunktion und dem Auftreten von Transplantatvaskulopathie, verglichen mit Patienten, die mit Calcineurininhibitoren behandelt wurden. Die Verbesserung der Nierenfunktion für Patienten, mit beginnendem Nierenversagen ist ermutigend, hinsichtlich Erhaltung von Nierenfunktion und damit Lebensqualität nach Herztransplantation

During development of the mammalian telencephalon stem cells and more lineage restricted progenitor cells give rise to all cell types which later are contributing to this fascinatingly orchestrated organ. Initially, at the stage of neuroepithelial cells, these stem cells increase their pool by symmetric proliferative divisions and later, when matured to radial glia (RG) cells they give rise to neurons either directly, or indirectly via intermediate progenitors. At later stages of development, radial glia generate glial progenitor cells or differentiate to glial cells directly. How stem cells orchestrate this sequel of tissue genesis has been unraveled by pioneer studies focusing on stem cells of the murine cerebral neocortex. However, the ways how one of the biggest brain regions of the murine brain, the ventral telencephalon which later forms the basal ganglia, facilitates this process, have been largely unknown. Over the past years, increasing interest has been put forward in understanding how the human cortex and its dramatically expanded surface with gyri and sulci is build up on a cellular level during embryonic development. Studies both on embryonic human and primate brains revealed that an expanded germinal zone, the outer subventricular zone (OSVZ), seeded with a heterogeneous population of progenitor cells which are rare in lissencepahlic brains, is responsible to form this enormously elevated brain region. However, both human and primate material is rare and genetically modified models are not available. To investigate the cellular mechanisms taking place in an expanded mammalian brain region in the mouse would be of great interest technically and from an evolutionary perspective. Therefore, live-imaging studies of individual progenitor cells in embryonic brainslices which have been labeled in the lateral ganglionic eminence (LGE) by in-utero electroporation were carried out to reveal lineages emanating from single RG cells. The development of the ventral telencephalon precedes that of the dorsal telencephalon, the cerebral neocortex, and already at early stages prominent bulges begin t form into the ventricular lumen. One characteristic of ventral forebrain development is the early appearance of a non-apically dividing cell population away from the ventricle, which outnumbers from stages of midneurogenesis on apically dividing cells. Amongst these non-apically dividing cells a proportion divides in the ventricular zone, a region that in the neocortex is largely devoid of mitotic cells. These subapically dividing cells were termed according to their location subapical progenitors (SAP). The characterization of these SAPs both by immunohistochemistry and live imaging revealed a morphologically heterogeneous population, with cells bearing processes towards apical, basal or both directions in addition to cells without processes resembling the morphology of basal progenitors, during mitosis. Indeed, bipolar cells amongst these SAPs were characterized as a new type of radial glia, which does not reach the ventricular surface for mitosis but divides in the VZ and generates a basally migrating bRG. By this SAPs contribute to the seeding of the LGE SVZ with a cell type that is characteristic for enlarged SVZ, like the OSVZ in gyrified brains and fundamental for the formation of gyri and sulci. The longterm observation of RG lineages in the LGE uncovered the potential to generate large progeny at midneurogenesis. RG give rise to daughter cells which divide once more in the ventricular zone and generate cells with further proliferative potential, thereby amplifying the cellular output. This amplification of progenitor cells goes along with a shortening in cell cycle length, a feature observed also in the expanded germinal zones of gyrified cortices. In conclusion the developing murine LGE turns out to be a suitable model to study the cellular mechanisms of an expanded brain region.

The nature of moral judgments has received considerable attention not only in philosophy and psychology but lately in neuroscience as well. There are two major paradigms that consider moral judgments either mainly rational, or as emotional-/ intuition-based processes. Relatively recent neuroimaging studies revealed however that both rational and emotional processes may support moral judgments. In line with these results, this doctoral thesis focused on ways that could better elucidate the supporting cognitive and/ or emotional processes of moral judgments. In a first study, moral judgments were compared to esthetic judgments by employing a whole-brain analysis. This idea was based on the philosophical and the psychological frameworks of moral sense theory and social intuitionist model respectively. Both models view moral judgments akin to esthetic judgments, as decision-making processes based on emotions/ subjective feelings. The fMRI data suggest a common denominator between the judgment modalities - a network involved in both cognitive and emotion processing. However, moral judgments seem to rely on an additional social component. In a second fMRI study, the two main paradigms of moral research were investigated. A main difference between the paradigms is the perspective the participants have towards the moral stimuli (i.e. first- or third-perspective). The fMRI data revealed that neural differences may emerge, and that they may be related to the so-called “actor-observer bias”, a tendency to attribute one’s own behavior to the situation, and the behaviors of others to their inner characteristics. Several hypotheses are put forth, which try to explain the complex neural mechanisms of moral decision-making.