Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06 Archiv

T cells recognizing myelin auto-antigens penetrate into the CNS to induce inflammatory autoimmune disease following complex sequential interactions with individual components of the vascular blood-brain barrier (BBB), particularly endothelial cells, and perivascular phagocytes. To determine the functional consequences of these processes, two-photon intravital imaging was performed to compare the behavior of three myelin-specific GFP-expressing T cell lines with different potentials for transferring Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Imaging documented that, irrespective of their pathogenic potential, all T cell lines reached the CNS and interacted with vascular endothelial cells indistinguishably, crawling on the luminal surface, preferably against blood flow, before crossing the vessel wall. In striking contrast, after extravasation the T cell motility and their interactions with perivascular antigen presenting cells (APCs) varied dramatically. While highly encephalitogenic T cells showed a low motility, made stable contacts with local APCs and became activated, the corresponding contacts of weakly encephalitogenic T cells remained short, their motility high and their activation marginal. Supplying auto-antigen, via either local injection or by transfer of antigen-pulsed meningeal APCs, lowered their motility and prolonged the contact duration of weakly encephalitogenic T cells to values characteristic for highly pathogenic ones. Only after exogenous antigen supply, the weakly encephalitogenic T cells became activated, infiltrated the CNS parenchyma, and triggered clinical EAE, suggesting that the strength of the antigen-dependent signals received by immigrating effector T cells from leptomeningeal APCs is crucial for their pathogenic effect within the target tissue. To directly correlate the activation of encephalitogenic T cells with their dynamic behavior in the CNS, a truncated fluorescent derivative of nuclear factor of activated T cells (NFAT) was introduced as a real-time activation indicator. Two-photon imaging documented the activation of the auto-reactive T cells extravasated into the perivascular space, but not within the vascular lumen. Activation correlated with reduced T cell motility, and it was related to contacts with the local APCs. However, it did not necessarily lead to a long-lasting arrest, as individual, activated T cells SUMMARY 2 were able to sequentially contact other APCs. A spontaneous cytosol-nuclear translocation of the marker was noted only in T cells with a high pathogenic potential. The translocation implied the presentation of an auto-antigen, as the weakly pathogenic T cells, which remained silent in the untreated hosts, were activated upon the instillation of exogenous auto-antigen. It is proposed here that the presentation of local auto-antigen by BBB-associated APCs provides stimuli that guide autoimmune T cells to the CNS destination and enable them to attack the target tissue. In addition, a theoretical, physicist approach was used for modeling T cell activation in the leptomeningeal space. Assuming that T cells have evolved to gain their activation signal in a way that is energetically optimal for them, two possible scenarios for T cell activation were compared. The first one assumes that, after finding an APC presenting the epitope of interest, the T cell will stop and interact with the APC until it becomes fully activated. The second model considers the possibility that a T cell can accumulate activation signals from different APCs while scanning them without stopping, until a certain threshold is exceeded and the T cell becomes activated. Using this approach, it is proposed that the T cells in EAE are more likely to become activated following the first scenario. However, in a more natural environment such as a lymph node, the second scenario could give them some advantages

Die Diagnose einer Unterernährung bei Kindern und Erwachsenen ist in der Pädiatrie und Geriatrie ein wichtiges Thema. Aber auch in der Forensik spielt sie eine große Rolle, gerade im Falle von Vernachlässigung und Missbrauch schutzbefohlener Personen. Derzeit existieren kaum Methoden, um zuverlässig den Zeitrahmen einer Unterernährung rückwirkend zu bestimmen. Die Analyse der stabilen Stickstoff- und Kohlenstoffisotope (δ15N-, δ13C-Wert) im Haarkeratin ist in der Anthropologie ein etabliertes Verfahren zur Untersuchung der menschlichen Ernährung und des individuellen Ernährungszustandes. Bei einem mangelhaften Ernährungszustand müssen die körpereigenen Protein- und Energiereserven angegriffen und wiederverwertet werden. Dieser sogenannte Hungerstoffwechsel zeigt sich auch in der biochemischen Zusammensetzung des Haarkeratins. Mithilfe von seriellen Analysen an Haarproben wird nach spezifischen Signaturen der N- und C-Isotope gesucht, welche sich während einer Unterernährung ausbilden. So soll ein verlässlicher Indikator entwickelt werden, welcher es ermöglicht, den Beginn und die Dauer einer Unterernährung zu rekonstruieren. Bei dieser Arbeit liegt der Schwerpunkt auf der Analyse von Haarproben aus der Rechtsmedizin. Jeder dieser 17 Fälle weist eine ausgeprägte Unterernährung auf. Daneben wurden in einer kleinen Vorstudie vier Haarprobe von Magersuchtpatienten untersucht. Trotz unbekannter Ernährungsgewohnheiten kann mit Hilfe der Isotopendaten in den meisten Fällen ein mangelhafter Ernährungszustand diagnostiziert werden. In einigen Fällen ist es sogar möglich, einzelne Unterernährungsphasen voneinander abzugrenzen. Zudem lassen sich mitunter auch Erholungsphasen erkennen, in denen sich der Ernährungszustand scheinbar kurzfristig gebessert hat. Jedoch ist es bisher noch nicht gelungen, allgemein gültige Erkennungsmerkmale aufzustellen, welche bei allen Fällen ausnahmslos zur Bestimmung einer Unterernährung angewendet werden können. Folglich muss weiterhin jeder einzelne Unterernährungsfall individuell analysiert und ausgewertet werden. Des Weiteren wurde an acht Haarproben aus der Rechtsmedizin die spezifische Aminosäurezusammensetzung des Haarkeratins während eines schlechten Ernährungszustandes analysiert. Dabei wurde versucht, der Unterernährungssignatur der δ-Werte weiter auf die Spur zu kommen. Die Daten zeigen, dass vor allem die Aminosäure Prolin während der Unterernährungsphasen vermehrt im Haarkeratin zu finden ist. Zwar lässt sich zwischen dem Verlauf der δ-Werte und der erhöhten Prolinmenge noch kein direkter Zusammenhang erkennen, jedoch wird deutlich, dass sich die Ergebnisse der Isotopendaten und der Aminosäureanalyse gegenseitig stützen und so zu einer besseren Aufklärung von Unterernährungsfällen beitragen können. Da die Entwicklung und der spezifische Verlauf der δ13C-Werte während einer Unterernährung noch nicht vollständig geklärt sind, wurde ein weiteres Probandenkollektiv in dieser Arbeit untersucht. Hierfür wurden Haarproben von sechs Probanden gesammelt, welche an einer medizinisch betreuten Fastentherapie teilnahmen. Durch Haaranalysen und weitere Untersuchungen sollte geklärt werden, ob 12C-Isotope aus den abgebauten, körpereigenen Fettreserven auch als Bausteine für das Haarkeratin Verwendung finden und so für das Absinken des δ13C-Wertes bei einigen Unterernährungsfällen verantwortlich sind. Es konnte mithilfe dieser Fastenstudie allerdings nicht bewiesen werden, dass leichte Kohlenstoffisotope aus den abgebauten Fettreserven ins Keratin eingebaut werden. Die Ergebnisse aus den drei Probandenkollektiven bestätigen jedoch eindeutig, dass mit Hilfe der seriellen Isotopenanalytik an Haaren sowohl eine Umstellung der Ernährung erkannt, als auch die Qualität des individuellen Ernährungszustandes beurteilt werden kann. Aufgrund dessen könnte gerade diese Methode bei der Aufklärung von Vernachlässigungsfällen, aber auch bei der Prävention gute Dienste leisten. Dennoch gilt es in zukünftigen Forschungsansätzen noch einige Problemstellungen zu überwinden, um dieses Ziel vollständig zu erreichen.

Hintergrund Zu den grundlegendsten Fragestellungen in der Biologie gehört die Frage nach der Natur und Entstehung biologischer Arten. Dieses Problem der Artdefinition (Engl. "Species Problem") war der Ursprung weitläufiger und kontroverser Diskussionen seit der Formulierung der Darwin'schen Evolutionstheorie. Bis heute wurden etwa 30 verschiedene und zum Teil gegensätzliche Konzepte zur Definition und wissenschaftlichen Abgrenzung der Art veröffentlicht. Eine Einigung ist nicht in Sicht. Gleichzeitig ist die Taxonomie mit der Herausforderung konfrontiert, dass ein immenser Teil der weltweiten Artenvielfalt wissenschaftlich noch nicht erfasst und beschrieben ist. Dies erfordert Methoden, die die Beschreibung neuer Arten beschleunigen und gleichzeitig deren Zuverlässigkeit und Nachvollziehbarkeit wahren. DNA-Barcoding, d.h. Artbestimmung an Hand eines kurzen standardisierten Fragments der DNA, soll die Erfassung der Artenvielfalt und das Erkennen unbekannter Arten beschleunigen. Die so genannte "Cybertaxonomie" erlaubt leichteren und schnelleren Zugriff auf vorhandene taxonomische Informationen, indem Daten online und kostenfrei zur Verfügung gestellt werden. Dies trägt zur Steigerung der Effizienz taxonomischer Prozesse bei. Integrative Taxonomie kombiniert verschiedene Beweislinien, wie zum Beispiel morphologische, molekulare und ökologische Daten, um die Zuverlässigkeit und Nachvollziehbarkeit bei der Abgrenzung und Beschreibung von Arten zu erhöhen. In dieser Dissertation untersuche ich zwei verschiedene Studiensysteme, um derzeit als gültig angesehene Modelle der Artbildung und Methoden der Artabgrenzung zu testen. Bei diesen Systemen handelt es sich um die Reptilien der Komoren, einer Gruppe ozeanischer Inseln im westlichen Indischen Ozean, und australische Wasserkäfer. Die Biogeographie dieser beiden Gruppen ist durch höchst unterschiedliche Faktoren geprägt: Die Komoren sind vergleichsweise junge vulkanische Inseln, deren einheimische, landbewohnende und flugunfähige Faunenelemente ausschließlich auf Besiedelung durch Drift über das offene Meer zurückgehen. Dagegen stellt Australien eine alte und isolierte Landmasse dar, deren Lebensgemeinschaften durch Klimaveränderungen in der Erdgeschichte geprägt sind. Ozeanische Inseln wurden schon von frühen Forschern als wichtige Systeme zum Studium der Biogeographie erkannt, und meine Untersuchung dieser beiden so unterschiedlichen Systeme stellt sowohl die Gemeinsamkeiten als auch die Unterschiede der Biogeographie von Inseln und Kontinenten heraus. Methoden und wesentliche Ergebnisse Als Fallbeispiele zur Untersuchung im Rahmen dieser Dissertation wählte ich zwei Teilgruppen der komorischen Reptilien (Geckos der Gattung Paroedura und Schlangen der Gattung Lycodryas) sowie drei Teilgruppen der australischen Wasserkäfer (die Familie Hygrobiidae und die Gattungen Antiporus und Sternopriscus aus der Familie Dytiscidae) aus. In beiden Fällen wurde der Grundstein für weitere Untersuchungen durch DNA-Barcoding gelegt, wie für die Reptilien als Teil dieser Dissertation beschrieben. Als nächsten Schritt führte ich Untersuchungen an mehreren mitochondrialen und nukleären Genmarkern durch, um die Phylogenien der jeweiligen Gruppen zu rekonstruieren und, im Fall der Hygrobiidae, das Alter der Phylogenie durch eine molekulare Uhr abzuschätzen. Ich versuchte, die Phylogenien komorischer Reptilien mit geologischen Daten über die erdgeschichtliche Entstehung der Inseln sowie die Ausbreitungsmöglichkeiten zu und zwischen den Inseln in Verbindung zu bringen. Bei Phylogenien australischer Käfer der Gattungen Antiporus und Sternopriscus suchte ich nach Korrelationen zu Klimaveränderungen in der Erdgeschichte, der Entstehung der australischen Trockengebiete und den Eiszeiten im Pleistozän. Diese Hypothesen konnte ich durch Belege für die ökologische Diversifikation australischer Käfer aus meinen Ökologischen Nischenmodellierungen untermauern. Auf der Grundlage der Ergebnisse von DNA-Barcoding und molekularen Phylogenien unternahm ich taxonomische Revisionen der betreffenden Gruppen nach Methoden der integrativen Taxonomie. Als Beweislinien verwendete ich Daten aus morphologischen Untersuchungen, mitochondrialen und nukleären Genen, sowie kategorische und quantitative ökologische Daten. Dieser Ansatz führte zur Beschreibung einer neuen Art von Käfern (Antiporus occidentalis HAWLITSCHEK, HENDRICH, PORCH, & BALKE, 2011), zweier neuer Arten (Paroedura stellata HAWLITSCHEK & GLAW, 2012 and Lycodryas cococola HAWLITSCHEK, NAGY & GLAW, 2012) und einer Unterart von Reptilien (Lycodryas cococola innocens HAWLITSCHEK, NAGY & GLAW, 2012), sowie zur Bestätigung oder Wiederherstellung der Gültigkeit der zuvor beschriebene Taxa Lycodryas maculatus (GÜNTHER, 1858) und Lycodryas maculatus comorensis (PETERS, 1874). Alle taxonomischen Handlungen wurden gemäß dem Konzept der Cybertaxonomie ausgeführt: es wurden LSID-Nummern vergeben, Einträge in Online-Datenbanken vorgenommen, und nach Möglichkeit Publikationsmodi mit freiem Zugang für Leser gewählt. Zudem verwendete ich die im Rahmen meiner Dissertation gesammelten Daten zur Abschätzung des artenschutzfachlichen Status der Reptilien der Komoren. Außerdem dienten sie als Basis für die Entwicklung von SmartHerper Comoros, einem Naturführer zur Herpetofauna der Komoren als Applikation für Smartphone. Schlussfolgerungen Die Ergebnisse meiner Untersuchungen weisen auf komplexe biogeographische Muster sowohl im insulären als auch im kontinentalen Untersuchungsgebiet hin. Demzufolge haben die Stammformen der dort heimischen Reptilien die Komoren in einem sehr komplizierten Muster besiedelt, das z.B. im Fall der Gecko-Gattung Paroedura mehrere Aussterbe- und Wiederbesiedlungsereignisse beinhaltet und kaum mit der geographischen Lage und dem geologischen Alter der Inseln korreliert. Viele endemische Arten zeigen mögliche morphologische Anpassungen an den Insellebensraum. Molekulare Daten komorischer Reptilien legen nahe, dass Grand Comoro, zuvor als geologisch jüngste Insel angesehen, möglicherweise weit älter ist als bislang angenommen. Über australische Wasserkäfer erhobene Daten zeigten, dass Artbildungsereignisse innerhalb dieser Gruppe von höchst unterschiedlichem erdgeschichtlichem Alter sind und vom Mesozoikum (Hygrobiidae) über das Pleistozän (Antiporus) bis in die jüngste erdgeschichtliche Vergangenheit (Sternopriscus) reichen. Molekulare Unterschiede weisen darauf hin, dass die "Sternopriscus tarsalis radiation" einen der am schnellsten verlaufenen bislang beschriebenen Artbildungsprozesse innerhalb der Insekten darstellt. Der integrativ-taxonomische Ansatz erwies sich in meinen Augen bei der Abgrenzung aller neu beschriebenen Taxa wie auch bei der Bestätigung bestehender Taxa als höchst erfolgreich. Durch diesen Ansatz standen Belege für die Artabgrenzung auch bei unzureichender morphologischer oder genetischer Differenzierung in ausreichendem Maße zur Verfügung. Ökologische Daten, insbesondere solche, die bei Ökologischer Nischenmodellierung gewonnen wurden, haben sich in diesen Fällen als höchst aussagekräftig bei der Artabgrenzung erwiesen. Bei der Anwendung des integrativ-taxonomischen Ansatzes auf Schlangen der Gattung Lycodryas argumentierte ich, den Rang der Unterart auf infraspezifische Einheiten mit einem gewissen Grad der Differenzierung anzuwenden. Schlussendlich liefern die Ergebnisse der Untersuchungen in meiner Dissertation nur einen kleinen, aber meiner Meinung nach dennoch nützlichen Beitrag zu unserem Verständnis darüber, wie biologische Arten entstehen und wie sie wissenschaftlich erfasst werden können. Meine Dissertation präsentiert diese Ergebnisse im Kontext der Debatte über die Artdefinition und stellt auch meine Meinung und Position darin dar. Meiner Ansicht nach ist diese äußerst fruchtbare Debatte von hoher Bedeutung für die zeitgenössische Entwicklung der Evolutionsbiologie und Biodiversitätsforschung.

Enterobacteria have evolved several strategies to survive the acidic environment of the gastrointestinal tract. One of the acid stress resistance systems is the Cad system in Escherichia coli, which is induced by low pH and in the presence of external lysine. It consists of CadA, which catalyzes the decarboxylation of lysine to cadaverine, the lysine/cadaverine antiporter CadB and the pH sensing transcriptional regulator CadC. Moreover, the lysine permease LysP inhibits the induction of cadBA expression when lysine is absent, and the small histon-like molecule H-NS acts as repressor for both cadBA and cadC transcription. Additionally, a random mutagenesis approach revealed that a deletion in yjeK leads to highly reduced cadaverine production. YjeK acts as 2,3-lysine aminomutase (LAM) while catalyzing the isomerization of (S)-α-lysine to (R)-β-lysine. The truncated lysyl-tRNA synthetase YjeA uses (R)-β-lysine as substrate to post-translationally modify and to activate the translation elongation factor EF-P at a conserved lysine residue (K34). EF-P and its ortholog eukaryotic initiation factor 5A (eIF5A) have been investigated for more than thirty years, but their roles in translation remained enigmatic. In this work the role of active EF-P in the Cad system was investigated in more detail. Reduced cadBA expression in ΔyjeA, ΔyjeK642-1029 and Δefp mutants was linked to impaired CadC translation. As the translation of cadA and cadB was EF-P independent, a general role of EF-P in translation could be excluded. The identification of CadC as first direct target for EF-P in E. coli allowed further investigations on the role of EF-P in translation. Determining the β-galactosidase activities of CadC´-LacZ translational fusions of increasing CadC length in efp- and efp+ cells revealed that EF-P is required for translation of the sequence found between codon 108 and 158 in cadC. This region comprises a cluster of three consecutive prolines (Pro120-Pro121-Pro122). Substitution of these prolines by alanines diminished EF-P dependency. Remarkably, cells harboring the CadC-PPPIP/AAAIS variant revealed cadBA expression even under non-inducing conditions. Thus, EF-P tightly controls the CadC copy number, which is crucial for stress dependent regulation of the Cad system. In order to investigate the work mechanism of EF-P in more detail, EF-P independent CadC´-LacZ hybrids were employed to artificially introduce prolines. Three consecutive prolines were sufficient for EF-P dependency, regardless of the codon or the context. The proline-rich proteins AmiB, FlhC, Flk, NlpD, RzoR, TonB and UvrB also showed EF-P dependent expression. Thus, the recognition of three consecutive prolines by EF-P is a general mechanism and not limited to CadC. Dr. Agata Starosta of the group of Dr. Daniel Wilson (Gene Center, LMU Munich) confirmed ribosomal stalling at polyproline-stretches in samples lacking EF-P with in vitro translation assays. Finally it was investigated, if EF-P expression and modification could be stress-dependently regulated. In this work first hints are given that the efp promoter contains a repressor site, and that expression of yjeA and yjeK is dependent on the pH of the medium and the presence of the small RNA binding protein Hfq. This leads to the suggestion that small regulatory RNAs are also involved in regulation of the EF-P modification enzymes. In conclusion, the results obtained in this work reveal a new regulatory mechanism by EF-P dependent translation. 100-1000´s of polyproline rich proteins exist in bacteria, archaea and eukaryotes. Therefore, EF-P and its orthologs aIF5A and eIF5A most likely play an important role in the adjustment of copy numbers of proteins with different functions in all kingdoms of life.

With the advances in genome wide screening arrays and sequencing techniques scientists were enabled to examine genetic variations and their effects on behavioral phenotypes. While single nucleotide polymorphisms (SNPs) are the most widely studied form of genomic variations to date, another type of variants has become increasingly important in recent research, the copy number variants (CNVs). These large segments of DNA that can comprise up to several megabasepairs and differ in copy number with respect to a reference genome have been associated with several disorders and behavioral phenotypes before. This study investigated the influence of CNVs on anxiety related behavior. The detection of these variants turned out to be a major challenge since all methods available are biased by limitations of the design of the approach and the subsequent computational analyses. Therefore, three different techniques (next generation sequencing and two distinct whole genome genotyping arrays) were employed to identify CNVs in a CD 1 derived mouse model consisting of two mouse strains showing high (HAB) and low (LAB) anxiety related behavior, respectively. By comparing CNVs in HAB vs. LAB mice with expression data of four distinct brain regions of high relevance to the limbic system (central and basolateral amygdala, cingulate cortex and the hypothalamic paraventricular nucleus), it was shown that CNVs can influence the expression of protein coding genes by the alteration of the genes’ copy number per se. Therefore, the genes mapping into regions where CNVs were detected in HAB vs. LAB mice (by all three detection methods) were suggested to be possible effectors of anxiety related behavior. Amongst these candidate genes those were considered to be the most interesting ones that were additionally found to map into regions of CNVs associated with anxiety related behavior in CD 1 mice. CNVs in these mice were detected by means of a whole genome genotyping array and subsequent processing of the raw data with a novel computational approach that was adapted from existing analysis methods. Furthermore, to test the effect of a specific CNV on anxiety related behavior in vivo, a breeding approach was used to generate animals with a full genetic background of HAB mice except for one LAB derived locus harboring a CNV that included the Glo1 gene. No direct effect on the phenotype could be observed, however, the respective CNV might be involved in the manipulation of anxiety related behavior taken into account the interaction with other factors. Taken together, this study provides not only a comprehensive catalogue of CNVs in HAB/LAB mice but also the evidence that these variants can influence anxiety related behavior. Furthermore, it gives a first insight into the functionality of CNVs with respect to anxiety related behavior. Therefore, this thesis provides a profound basis for multiple advanced studies.

Antibodies and antibody fragments are essential tools in basic research, diagnostics and therapy. Conventional antibodies consist of two heavy and two light chains with both chains contributing to the antigen-binding site. In addition to these conventional antibodies, camelids (llamas, alpacas, dromedaries and camels) possess so-called heavy chain antibodies (hcAbs) that lack the light chains. The antigen binding site of these unusual antibodies is formed by one single domain only, the so called VHH domain. The VHH domain represents the smallest intact antigen binding fragment (~ 15 kDa) and is characterized by very high stability, solubility and specificity. These unique features render VHHs a promising alternative to conventional antibodies and antibody fragments with a multitude of possible applications. In the course of this thesis, we aimed to generate and characterize VHHs suitable for different applications ranging from biochemical studies to immunofluorescence assays and live cell imaging. In order to meet the diverse requirements of the intended downstream applications, a new selection method differing from traditional phage display, called native panning, was developed and established. In combination with the protein-protein interaction fluorescent two-hybrid (F2H) assay, a new process to identify antigen specific VHHs functional inside living cells was developed. We used the immune system of alpacas to generate VHH libraries against various antigens, ranging from small peptides to large proteins. The libraries were screened by phage display and antigen specific VHHs were identified by phage ELISA. We were able to identify antigen specific VHHs against different antigens which were characterized and their functionality was tested in various applications. Furthermore, we could demonstrate that the selection method influences which VHHs are identified and therefore needs to be chosen very carefully with regard to the intended biochemical and cell biological application. In summary, we developed and established an efficient and versatile process to screen and identify antigen specific VHHs suitable for different downstream applications.