Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06 Archiv

Morbus Alzheimer ist die häufigste Form einer Demenzerkrankung und stellt aufgrund der steigenden Lebenserwartung eine sehr große ökonomische und emotionale Belastung für Patienten, deren Familien und die gesamte Gesellschaft dar. Eine Verringerung dieser Belastung erfordert dringend krankheitsmodifizierende Therapien, die bisher nicht zur Verfügung stehen. Als wahrscheinlichste Erklärung für die molekularen Ursachen der Krankheit wurde in der Amyloid-Kaskaden-Hypothese postuliert, dass die Akkumulation und Aggregation des Abeta-Peptids das zentrale Ereignis darstellt. Infolgedessen kommt es zu synaptischen Beeinträchtigungen durch Abeta-Oligomere, Entzündungsreaktionen durch unlösliche Abeta-Aggregate in Form von amyloiden Plaques, progressiven Schädigungen von Synapsen und Neuronen, oxidativem Stress, der Hyperphosphorylierung des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau und einem Neuronenverlust. Das Abeta-Peptid wird durch sequentielle Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch die beta- und gamma-Sekretase konstitutiv im Gehirn produziert. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen der Überexpression eines humanen APP mit der schwedischen Mutation auf Synapsen und die Akkumulationskinetik des Abeta-Peptids zu amyloiden Plaques in einem Alzheimer-Mausmodell (Tg2576) untersucht. Die detaillierte Charakterisierung des Mausmodells wurde in einer Therapiestudie umgesetzt, in der eine passive Immunisierung gegen das Abeta-Peptid oder Abeta-Oligomere getestet wurde. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der Überexpression des APP auf dendritische Spines untersucht, die das postsynaptische Kompartiment glutamaterger Synapsen entlang von Dendriten bilden. Als Reporter-Tiere wurden Mäuse verwendet, die das gelbfluoreszierende Protein YFP in einem Teil der pyramidalen Neuronen des Cortex exprimieren. Mithilfe der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie wurden die denritischen Spines an den apikalen Dendriten der Schicht II/III und V Neurone im somatosensorischen Cortex analysiert. Die Überexpression des APP führte zu einem differentiellen Effekt, wobei in Schicht II/III Neuronen keine Änderung und in Schicht V Neuronen eine Erhöhung der Dichte dendritischer Spines gemessen wurde. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte eine Mehrzahl an stabilen Spines als ursächlich für die erhöhte Spinedichte, während keine zeitliche Änderung der Spinedichte über sechs Wochen detektiert wurde. Auch die Morphologie der dendritischen Spines war unverändert. Diese Ergebnisse deuten auf eine mögliche physiologische Rolle von APP und/oder dessen proteolytische Fragmente an Synapsen. Ein wichtiges neuropathologisches Merkmal von Morbus Alzheimer sind amyloide Plaques, die durch Aggregation des Abeta-Peptids zu Amyloidfibrillen mit einer gekreuzten beta-Faltblattstruktur entstehen. Demzufolge wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit mithilfe der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie, unter der wiederholten Anwendung des spezifischen fluoreszenten Markers Methoxy-X04, die Entstehungs- und Aggregationskinetik amyloider Plaques untersucht. Eine quantitative Auswertung von Plaquegrößen, -wachstumsraten und -dichten in zwei Altersgruppen der frühen und späten amyloiden Pathologie führte zur bisher detailliertesten in vivo Charakterisierung in einem Alzheimer-Mausmodell. Für eine präzise Messung der Plaquedichten wurde ein sehr großes Gehirnvolumen von 3 Kubikmillimeter pro Gruppe untersucht. In einem Langzeitversuch über 15,5 Monate mit einer zeitlichen Auflösung von einer Woche wurde erstmals eine komplette Kinetik des Plaquewachstums in einem Mausmodell beschrieben, die den gleichen Verlauf einer Sigmoid-Funktion aufwies, wie er bereits in vitro und in Alzheimer-Patienten gezeigt wurde. Die Plaquedichte stieg asymptotisch mit dem Alter an und folgte einer exponentiellen, einphasigen Assoziationsfunktion. Neu entstandene Plaques wiesen mit Abstand die kleinste Plaquegröße auf, die mit zunehmendem Alter anstieg. Die lineare Plaquewachstumsrate, gemessen als Zuwachs des Plaqueradius pro Woche, sank mit ansteigendem Alter der Mäuse, was sich in einer negativen Korrelation der Plaquewachstumsrate mit der Plaquedichte widerspiegelte. Sehr große Plaques wurden früh in der Entstehungsphase gebildet und die Größe am Ende der Untersuchung korrelierte mit ihrer Wachstumsrate. In der frühen Phase der Plaqueentwicklung nahmen die Plaques mit einer maximalen Wachstumsrate zu, die nicht durch die Abeta-Konzentration limitiert war. Die Wachstumsraten individueller Plaques waren sehr breit verteilt, was auf einen Einfluss lokaler Faktoren schließen ließ. Dieser Befund wurde gestützt durch den Langzeitversuch, da kein Zusammenhang zwischen den Wachstumsraten benachbarter Plaques detektiert wurde. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen ein physiologisches Wachstumsmodell, in dem Plaques sehr langsam über große Zeiträume wachsen bis zum Erreichen eines Äquilibriums. Durch die nachgewiesenen Parallelen zu den Befunden von in vitro Studien und in vivo Ergebnissen von Alzheimer-Patienten stellen die beschriebenen Zusammenhänge eine wertvolle Grundlage für die Translation von Ergebnissen zwischen präklinischer und klinischer Forschung zur Entwicklung von Abeta-senkenden Therapien dar. Im dritten Teil der Arbeit wurden die Effekte einer passiven Immunisierung gegen das Abeta-Peptid oder Abeta-Oligomere untersucht. Nach einer zweimonatigen Antikörper-Behandlung wurden keine Unterschiede in der Plaqueentstehungs- und Plaquewachstumskinetik gemessen. Eine in der Literatur beschriebene Akkumulation von Abeta-Oligomeren konnte durch eine in vivo Visualisierung mit einem hochspezifischen Antikörper gegen diese Molekülspezies nicht bestätigt werden. Lösliche Abeta-Peptide oder Abeta-Aggregate akkumulierten erwartungsgemäß um den amyloiden Kern von Plaques. Am Ende der Immunisierungsstudie wurde die synaptische Pathologie mittels immunhistochemischer Färbung der Prä- und Postsynapsen mit den Markern Synapsin und PSD-95 untersucht. Innerhalb amyloider Plaques wurden sehr niedrige Synapsendichten gemessen, die mit zunehmender Entfernung zum Plaque asymptotisch zu einem Plateau anstiegen. Diese Analyse zeigte erstmals, dass der Einflussbereich der toxischen Wirkung amyloider Plaques für Präsynapsen wesentlich größer ist als für Postsynapsen, was auf eine höhere Sensibilität von Präsynapsen schließen lässt. Abseits von Plaques im Cortex waren die Synapsendichten niedriger im Vergleich zu Wildtyptieren, wie durch den Vergleich der Plateaus gemessen wurde. Beide therapeutischen Antikörper zeigten eine partielle Normalisierung der Synapsendichte. Daraus folgt, dass die Abeta-Oligomere ursächlich für die Synapsenpathologie waren, da eine spezifische Neutralisierung dieser Abeta-Aggregate für einen Therapieeffekt ausreichte. Diese Ergebnisse bestätigen in vivo die toxische Wirkung von Abeta-Oligomeren auf Synapsen und beweisen eine mögliche Neutralisierung dieser löslichen Abeta-Aggregate durch eine passive Immunisierung.

Drosophila melanogaster is a model organism to study innate immunity in invertebrates. Temperate and tropical D. melanogaster populations, being exposed to different environments, potentially face distinct parasites and parasite pressure. Indeed, there is experimental evidence suggesting that tropical D. melanogaster populations survive longer than temperate ones to infection by the fungal parasite Beauveria bassiana. In the present work we test the generality of this conclusion and investigate if host populations differ in their molecular response to infection. We first exposed to B. bassiana infection two tropical (from Africa and South-East Asia) and two temperate (from Europe and North America) D. melanogaster out-crossed populations. We consistently found a significant effect of B. bassiana on Drosophila mortality, but we were not able to identify a significant difference in survival to infection among populations. These results indicate that tropical populations may not always survive better than temperate ones, and suggest that other environmental factors, such as humidity or local species richness may be more accurate predictors of immune competence. Subsequently, we recorded transcriptional response to B. bassiana in all D. melanogaster populations, both by microarray and RNA sequencing. To our knowledge this is the first time that transcriptional response to fungal infection has been determined in multiple D. melanogaster out-crossed populations. We found few or no genes significantly induced 8 hours after infection. On the other hand, we identified between 200 and 1,300 genes induced 24 hours after infection depending on the population. This means that transcriptional response to B. bassiana begins between 8 and 24 hours after infection. We reveal here that host populations respond differently at the molecular level, as shown by the large variation in the number of induced genes. We report that gene ontology categories related to translation, biosynthesis and reproduction are enriched in genes down-regulated upon infection, suggesting a metabolic cost of mounting the defence response. Next, we wanted to assess the selective pressures acting on induced candidate genes. We compared the genes induced in all populations to the ones induced specifically in each population and computed population genetic statistics for a subset of genes in each category. We noticed higher conservation at non-synonymous sites for commonly induced genes compared to population specific ones. This hints that common genes are under stronger selective constraints. Another topic we addressed in the present work is the effect of endosymbionts and trans-generational immune priming on D. melanogaster survival to B. bassiana. We tested for a protective effect of the endosymbiont Wolbachia pipientis in two D. melanogaster inbred lines. We did not find an effect of Wolbachia on survival to infection in two independent experimental replicates. In absence of infection, flies bearing Wolbachia had a lower fitness than cured ones. Therefore W. pipientis appears to have a negative effect on Drosophila general vigour, but no effect on mortality upon infection. Finally, we tested if flies whose parents were exposed to B. bassiana were less susceptible when infected by the same parasite. This would imply a transfer of immune memory from parents to offspring, which is called trans-generational immune priming. However, no evidence of immune transfer for two D. melanogaster out-crossed populations could be found. Yet, as trans-generational immune priming depends on host and parasite genotype, more experiments are needed to determine its generality in the D. melanogaster – B. bassiana system.

In dieser Arbeit wurden Mikrovesikel, die von Tumor-Zelllinien in hohen Konzentrationen sekretiert wurden, zur Immunisierung von Ratten verwendet, um auf diese Weise monoklonale Anti-körper gegen membranständige Proteine zu generieren, die auf Tumorzellen vorhanden sind. Der Grund für diesen Ansatz ist, dass Mikrovesikel verschiedenste Membranproteine enthalten, die in Tumorzellen in hohem Maße exprimiert werden. Diese Mikrovesikel sind etwa hundertfach kleiner als die Zellen, denen sie entstammen und daher deutlich weniger komplex. Gleich-zeitig enthalten sie aber überproportional viele Membran-proteine. Viele, aber nicht alle dieser Proteine sind in der Onko-logie und Tumorimmunologie bereits als Tumor-assoziierte Antigene bekannt, weshalb diese Mikrovesikel hier als Onko-somen bezeichnet werden. Es hat sich herausgestellt, dass sich Onkosomen hervorragend zur Immunisierung verwenden lassen und durch ihre Immunogenität die Möglichkeit bieten, mono-klonale Antikörper gegen zunächst unbekannte, aber onko-logisch relevante Membranproteine zu generieren. Aus solchen Immunisierungen war in der Arbeitsgruppe der Antikörper 6A10 hervorgegangen, der mit hoher Spezifität und Effizienz die Tumor-assoziierte Carboanhydrase XII (CA XII) er-kennt und inhibiert. CA XII ist ein membranständiges Enzym, das auf einer Vielzahl hypoxischer Tumoren exprimiert ist und für die Homöostase des leicht alkalischen intrazellulären pH-Wertes vieler Tumorzellen entscheidend ist. Mit dem inhibitorischen Antikörper 6A10 konnte ich in dieser Arbeit zeigen, dass eine spezifische Hemmung der CA XII-Enzymaktivität zu einem ver-zögerten Wachstum dreidimensionaler Tumorzellverbände in vitro und in vivo führt. Bei den in-vivo-Versuchen konnte ich dabei das Wachstum von Luziferase-exprimierenden Tumoren in immundefekten NSG-Mäusen durch Biolumineszenz-basierte Bildgebung (BLI) über lange Zeiträume exakt verfolgen und quantifizieren. Mittels Fluoreszenz-basierter Bildgebung konnte ich zudem die spezifische Bindung eines 6A10-Infrarotfarbstoff-Konjugates an Tumorzellen in vivo visualisieren. Da es zuvor keinen spezifischen Inhibitor gegen die CA XII gab, waren dies die ersten Untersuchungen, die speziell die CA XII als Ziel-struktur behandelten und für die klinische Onkologie als relevantes Tumor-assoziiertes Antigen validieren konnten. In einem zweiten Teil meiner Arbeit ermittelte ich die Spezifität weiterer Tumor-reaktiver Antikörper, die aus Immunisierungen mit Onkosomen hervorgegangen sind. Diese Antikörper erkann-ten nativ gefaltete Antigene auf der Oberfläche von Tumorzellen und könnten zur Beantwortung verschiedener onkologischer Fragestellungen Verwendung finden. Neben dieser unspezi-fischen „reversen“ Immunisierungsmethode, verwendete ich Onkosomen erfolgreich auch zur gezielten Generierung von Antikörpern gegen ein definiertes membranständiges Protein, die humane Carboanhydrase IX. Die CA IX ist ein weiteres be-kanntes membranständiges Tumor-assoziiertes Antigen, das oft mit der Carboanhydrase XII auf invasiven soliden Tumoren ko-exprimiert ist. Damit konnte ich belegen, dass sich Mikrovesikel nicht nur für die Generierung neuartiger Tumor-reaktiver Anti-körper, sondern auch für die Entwicklung von Antikörpern gegen ein Molekül der Wahl eignen. Die Immunisierung mit nativ ge-falteten Proteinen im Kontext immunogener Mikrovesikel könnte sich zukünftig als Möglichkeit zur Generierung von Antikörpern erweisen, die mit klassischen Immunisierungsmethode nicht oder nur schwer zu erhalten sind.

Here, I studied the role of two candidate genes i.e. neuropeptide S receptor 1 (Npsr1) and transmembrane protein 132D (Tmem132d), in two psychopathological animal models of anxiety-related behavior because of recent studies showing importance of these candidates in limbic areas and the frontal cortex of panic disorder patients, respectively. The two animal models are rat (r) and mouse (m), high anxiety-related behavior (rHAB/mHAB) and low anxiety-related behavior(rLAB/mLAB). To understand the anxiolytic role of neuropeptide S (NPS), basal Npsr1 mRNA expression was studied in limbic brain regions of HAB vs. LAB rodents, i.e. the paraventricular nucleus of hypothalamus (PVN) and amygdala, because these regions have been implicated in anxiety and fear attenuating responses of NPS and also due to differences in long-term activity based on cytochrome c oxidase activity in mHAB vs. mLAB. There was significantly lower basal Npsr1 mRNA expression in the basolateral amygdala of mHAB and also in the PVN of rHAB compared to corresponding LABs. To study the genetic underpinnings underlying this differential expression, Npsr1 DNA sequencing was carried out, which revealed several polymorphisms including single-nucleotide polymorphisms (SNP), insertions and deletions. By using dual reporter (luciferase) assays, I could show that the SNPs in the whole HAB promoter construct cause a significant decrease in promoter activity, thus confirming our in vivo findings in both rats and mice. Interestingly, however, when the promoter constructs were shortened to 500 bp relative to translational (ATG) start site, there was a two-fold higher HAB promoter activity, which could be attributed to the introduction of a polymorphism with putative binding site for the glucocorticoid receptor (GR) transcription factor. The higher HAB promoter activity was suppressed by dexamethasone (a GR activator), thus suggesting the presence of a polymorphism that favors GR binding. These findings are analogous to the higher HAB specific allele expression in cross-mated F1 offspring, which allows us to study the HAB vs. LAB alleles in the same cellular environment, irrespective of any epigenetic or other environmentally mediated factors that might modulate or interact with cis-acting factors. In addition, there was no difference in Npsr1 mRNA expression in the basolateral amygdala of mHAB and mLAB subjected to environmental enrichment (EE) and unpredictable chronic mild stress (UCMS), respectively. Thus it is a non-plastic gene as it does not respond to environmental challenges faced by the susceptible animal models. Similarly, for Tmem132d, using dual luciferase assays, two SNPs in the mHAB promoter region were shown to cause an increase in its corresponding promoter activity, and there was no difference in DNA methylation in the mHAB vs. mLAB Tmem132d promoter region, which explains the observed higher Tmem132d mRNA expression in the anterior cingulate cortex of mHAB. However, mHABs subjected to EE had higher Tmem132d mRNA expression, while mLAB undergoing UCMS had corresponding lower gene expression. To study the cis-trans interaction, we also subjected cross-mated F1 offspring to EE or UCMS and found that both groups have higher mLAB allelic expression, which could be attributed to differences in DNA methylation. Finally, I could show that there was no difference in DNA methylation in the basal mHAB vs. mLAB Tmem132d promoter and that two SNPs in the mHAB promoter were sufficient to cause a higher corresponding promoter activity, which explains the in vivo findings observed in the anterior cingulate cortex. Furthermore, F1 offspring subjected to EE or UCMS had a significantly lower mHAB-specific allele expression which was negatively correlated with DNA methylation, in the Tmem132d promoter region, thus this suggests cross-talk between genetic and environmentally mediated epigenetic factors. In summary, the data suggests a strong evolutionary conserved role of the NPS system considering the similar findings in rats and mice. However, Npsr1 is a nonplastic gene as it is not amenable to the different environmental manipulations applied to the animals. On the other hand, the plastic gene Tmem132d, is differentially expressed, thus making the animals more susceptible to environmental influences. Here, it could be revealed, that SNPs in the mHAB Tmem132d promoter cause higher promoter activity and that environmental manipulation can modulate the gene’s corresponding expression through DNA methylation.

Actin is one of the most abundant proteins in eukaryotic cells and regulation of the microfilament system is crucial for a wide range of cellular functions including cell shape, cell motility, cell division and membrane dynamics. The aim of this thesis was (1) to gain a better understanding of the function of distinct actin binding domains in the regulation of the actin cytoskeleton and (2) to elucidate the role of actin variants. WH2 domains (WH2, Wiskott-Aldrich syndrome protein homology 2) are ubiquitous multifunctional regulators of actin dynamics. The protein Spire contains four central WH2 domains A-B-C-D with about 20 amino acids each and the cyclase-associated protein CAP2 contains only one WH2 domain. Under certain conditions, they can (1) nucleate actin polymerization, (2) disintegrate actin filaments and (3) sequester actin monomers. Here, the influence of selected Drosophila melanogaster Spire-WH2 and Mus musculus CAP2-WH2 domain constructs on actin dynamics was tested in vitro. To act as a filament nucleator, at least two WH2 domains are required, and nucleation of actin polymerization was only observed at substoichiometric concentrations of WH2 domains over actin. At higher concentrations, the sequestering activity of WH2 domains takes over. Preformed and purified SpireWH2-actin complexes act as extremely efficient nuclei for actin polymerization, even at superstoichiometric WH2 concentrations, under which free WH2 domains would sequester actin. All analyzed constructs, including these with only a single WH2 domain, sequester actin as well as they can disrupt filaments. This latter and most peculiar behavior of WH2 domains was observed in fluorometric, viscometric and TIRF assays. The WH2 domains seem to have such a high affinity for actin that they can forcefully sequester monomers even from filaments and filament bundles, thus breaking the whole structures. Taken together, the data clearly show that SpireWH2-actin complexes are the intermediates that account for the observed nucleating activity, whereas free WH2 domains can disrupt filaments and filament bundles within seconds, again underlining the intrinsic versatility of this regulator of actin dynamics. These data have been confirmed by crystallography in collaboration with the groups of Prof. Dr. Tad Holak and Prof. Dr. Robert Huber (Martinsried, Germany). Besides the well-studied conventional actins many organisms harbor actin variants with unknown function. The model organism Dictyostelium discoideum comprises an actinome of a total of 41 actins, actin isoforms and actin-related proteins. Among them is filactin, a highly conserved actin with an elongated N-terminus. The 105 kDa protein has a distinct domain organization and homologs of this protein are present in other Dictyosteliidae and in some pathogenic Entamoebae. Here, the functions of filactin were studied in vivo and in vitro. Immunofluorescence studies in D. discoideum localize endogenous and GFP-filactin in the cytoplasm at vesicle-like structures and in cortical regions of the cell. A most peculiar behavior is the stress-induced appearance of full length filactin in nuclear actin rods. To perform in vitro analyses recombinant filactin was expressed in Sf9 cells. Fluorescence studies with the filactin actin domain suggest that it interferes with actin polymerization by sequestering G-actin or even capping filaments. Gel filtration assays propose a tetrameric structure of full length filactin. Protein interaction studies suggest that filactin is involved in the ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport) pathway which is responsible for multivesicular body formation. The data on filactin suggest that only the conventional actins are the backbone for the microfilamentous system whereas less related actin isoforms have highly specific and perhaps cytoskeleton-independent subcellular functions.