Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/07 Archiv

Detection of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) in powdered infant formulae using a molecular biological method. The aim of the studies presented here was the development of a screening test based on PCR technique for the detection of Enterobacter (E.) sakazakii (Cronobacter spp., IVERSEN et al., 2008a) in powdered infant formulae. Variable regions of the 16S RNA gene of E. sakazakii were chosen for amplification by primers designed with the help of the computer programme Primer3 (ROZEN und SKALETSKY, 2000). Chimeric primer were used as internal amplification control. To check whether the amplicon was generated agarose gel electrophoresis was employed. To test the sensitivity and specificity of the PCR method 57 E. sakazakii strains as well as 169 isolates belonging to 16 species or genera of other bacteria than E. sakazakii were used. Before testing, the E. sakazakii strains were examined by RAPD-PCR to ensure individuality. The PCR method gave positive results for all 57 E. sakazakii strains, three Hafnia alvei isolates, however, were also positive. It could be shown by DNA sequence analysis that H. alvei has a16S rRNA gene sequence identical with the target DNA used for the detection of E. sakazakii. Therefore, the amplicons of the E. sakazakii strains and the H. alvei isolates were analysed by restriction digest using MvaI as restriction enzyme. Both species could be differentiated clearly by their electrophoretic band patterns. To test the performance of the PCR method if food has to be examined 52 samples of powdered infant formulae were artificially contaminated with ten different strains of E. sakazakii (5 to 24 bacteria per 100 g). The samples were from four producers and they included different types of infant formulae, follow-up formulae and powdered formulae for special medical purposes. 100 g in each case of the artifically contaminated as well as 100 g in each case of non contaminated (negative control) sample material was preenriched in buffered peptone water for 24 h at 37 °C. After preenrichment DNA was extracted using a commercial test kit (PrepMan Ultra) and tested by the PCR method. A culture technique for the detection of E. sakazakii (FDA/SCAN, 2002) was carried along as reference method. E. sakazakii was detected in all samples with both methods.

Im Jahr 2010 kann das Staatsgut Schleißheim auf sein 200jähriges Bestehen zurückblicken. Neben der militärischen Nutzung diente das Staatsgut in herausragender Weise vor allem der Lehre und Forschung in Landwirtschaft und Tiermedizin. Schon kurz nach der Gründung im Oktober 1810 erhielten junge Landwirte praktische Ausbildung auf der königlichen Musterlandwirtschaft, bevor das Staatsgut dann ab 1822 die Königlich Baierische Landwirtschaftliche Lehranstalt beherbergte. Mit der Verlegung der Lehranstalt nach Weihenstephan und der Kreisackerbauschule nach Landsberg endete die erste Ära von Lehre und Forschung. Das Staatsgut wurde zum Remontedepot. Erst nach Beendigung des Kriegsgeschehens beider Weltkriege begann 1956 mit der Gründung des heutigen Lehr- und Versuchsguts Oberschleißheim der tiermedizinischen Fakultät der Ludwig-Maximilian-Universität München die zweite Ära landwirtschaftlicher und tiermedizinischer Forschung. Durch die Neuansiedlung des gesamten Gutskomplexes in der Grünfläche westlich der Bahnlinie und außerhalb des alten Schlossangers kann das Staatsgut Schleißheim heute den Anforderungen eines modernen landwirtschaftlichen Betriebs, der zudem Ausbildungs- und Forschungsgrundlage bildet, gerecht werden. Auch in Zukunft wird das Staatsgut Schleißheim einen unverzichtbaren Grundstein der landwirtschaftlichen und tiermedizinischen Lehre und Forschung darstellen. Wie in seiner 200jährigen Geschichte wird es sich dabei stetig verändern, erneuern und weiterentwickeln.

Bacillus cereus ist als Sporenbildner mit ubiquitärem Vorkommen sowie ausgeprägten lipo- und proteolytischen Eigenschaften ein Problemkeim in der Lebensmitteltechnologie und -hygiene und verursacht Lebensmittelintoxikationen und -infektionen, die zu den wichtigsten lebensmittelassoziierten Krankheiten gezählt werden. Derzeit besteht in der Routinediagnostik ein Mangel an schnellen und zuverlässigen Methoden zur simultanen Detektion der für diese Erkrankungen kausalen B. cereus Toxine bzw. der zugrunde liegenden Toxin-Gene hbl, nhe, ces und cytK1. Im Rahmen dieser Studie wurden deshalb konventionelle und real-time multiplex PCRs zum simultanen Nachweis der B. cereus Toxin-Gene (hbl, nhe, ces und cytK1) entwickelt und an zuvor bereits immunologisch, zell- und molekularbiologisch charakterisierten B. cereus Stämmen (n = 146) der Stammsammlung des Instituts etabliert: Zur Anwendung in konventionellen Systemen konnten vier multiplex PCRs (PCR 1 – 4) realisiert werden, wobei PCR 1 und 2 dem gleichzeitigen Nachweis der Gene hblC, nheA, ces (PCR1) bzw. hblC, nheA, ces und cytK1 (PCR 2) dienen und mit PCR 3 und 4 die spezifische Detektion der Gene hblC, hblD und hblA bzw. nheA, nheB und nheC ermöglicht wird. Sowohl in den beiden Screening PCRs als auch in den PCRs zur Feindifferenzierung wurde eine Interne Amplifikationskontrolle (IAC) eingesetzt. Für die Applikation in real-time Systemen wurde eine auf SYBR Green I basierende multiplex PCR zur Detektion der B. cereus Toxin-Gene hblD, nheA, ces und cytK1 entwickelt und erfolgreich in den Cyclern LC 2.0 und LC 480 eingesetzt. Die Schwellenwert-Zyklen der multiplex Reaktionen stimmten gut mit denen der singleplex Assays überein und es konnte kein relevanter Sensitivitätsverlust festgestellt werden. In beiden Cyclern wurden für die vier Amplifikate signifikante Unterschiede der Schmelztemperaturen berechnet (p < 0,001). Anschließend wurden die multiplex PCRs zur Charakterisierung von Bacillus cereus Isolaten (n = 208) aus Lebensmittel- und Hygienestatuskontrollen der Bundeswehr eingesetzt. Anhand der detektierten Toxin-Gene konnten die B. cereus Isolate in drei Profile eingeteilt werden (nhe + hbl; nhe + ces; nhe) mit Prävalenzen von 99,5 % für nhe, 62,9 % für hbl sowie 4,3 % für ces. In einem zweiten Schritt wurden die B. cereus Isolate mit validierten, auf monoklonalen Antikörpern basierenden Enzymimmuntests und Zytotoxizitätstests untersucht, wobei eine hohe Übereinstimmung der mit den drei unabhängigen Methoden (PCR, EIA, Zelltest) erhaltenen Ergebnisse verzeichnet wurde. Im Vergleich zu früheren Studien konnte somit eine deutliche Verbesserung der Zuverlässigkeit der molekularbiologischen Ergebnisse erreicht werden.

Die hier vorliegende Studie soll den Einfluss der perioperativen Gabe von Moxifloxazin (MXF) auf das neurokognitive Outcome und den histologischen Schaden 14 Tage nach extrakorporaler Zirkulation (EKZ) mit 45 min tief- hypothermem Kreislaufstillstand (DHCA) bei der Ratte untersuchen. 50 männliche Sprague- Dawley Ratten (330-400 g) wurden randomisiert drei Gruppen zugeteilt: Kontrolle (n=10), Sham und DHCA (je n=20). Die Sham- und DHCA- Tiere wurden weiter unterteilt in MXF und Plazebo behandelte Gruppen (n=10). Die Tiere erhielten intraperitoneal mit Beginn der Anästhesie alle zwei Stunden 6 x 100 mg/kg MXF bzw. dasselbe Volumen physiologische Kochsalzlösung. Tiere der DHCA- Gruppen wurden intubiert, mit Isofluran (2,0-2,5 Vol % in 40 % Sauerstoff) anästhesiert, katheterisiert, an die EKZ angeschlossen und über 30 min auf 15-18 °C rektale Körpertemperatur abgekühlt. Nach 45 min DHCA wurden die Tiere innerhalb von 40 min an der EKZ auf 35,5 °C rektale Körpertemperatur wiedererwärmt. Tiere der Sham- Gruppen wurden analog anästhesiert, kanüliert, jedoch weder an die EKZ angeschlossen noch einem DHCA unterzogen. Die Tiere der Kontroll- Gruppen wurden weder anästhesiert noch katheterisiert. Alle Tiere wurden präoperativ an den Tagen -2 und -1, sowie postoperativ an den Tagen 1, 2, 3 und 14 neurologisch- motorisch getestet. Die Untersuchung der neurokognitiven Funktion mit dem modifizierten Zylinder- Hole- Board- Test (ZHBT) fand täglich vom vierten bis einschließlich 13. postoperativen Tag statt. Am 14. postoperativen Tag wurden die Ratten dann in tiefer Isoflurannarkose entblutet, die Gehirne in toto entnommen, tiefgefroren (-80 °C) und histologisch untersucht. Dazu wurde eine Hämatoxylin- Eosin- Färbung, sowie eine immunhistochemische Markierung Nukleärer Faktor kappa B (NFkB) positiver Neurone angefertigt, um anhand der Menge eosinophiler Zellen sowie NFkB- positiver Neurone und der Anzahl sowie Ausdehnung der Hirninfarkte das Ausmaß des histologischen Schadens zu ermitteln. Die Ergebnisse zeigen im Vergleich zu den präoperativen Ausgangswerten und den Sham- Gruppen postoperativ neurologisch- motorische Beeinträchtigungen der Tiere der beiden DHCA- Gruppen. Zudem zeigen beide DHCA- Gruppen deutliche postoperative neurokognitive Defizite im Vergleich zu den Sham- Tieren und der Kontroll- Gruppe. Der histologische Schaden ist ebenfalls in den DHCA- Gruppen am deutlichsten ausgeprägt. Dabei gibt es jedoch keinen Unterschied zwischen den mit Moxifloxazin- oder Plazebo- behandelten Tieren. Die perioperative Applikation von Moxifloxazin zeigt demnach keine positive Wirkung auf das neurokognitive Ergebnis 14 Tage nach EKZ mit 45 min DHCA an der Ratte. Um die Frage zu beantworten, ob eine Verlängerung der Applikationsdauer oder ein anderer Applikationszeitpunkt das postoperative Ergebnis verändern könnte, bedarf es weiterführender Untersuchungen.

Vaccination against Bovine Viral Diarrhea Virus plays a major role in the obligatory German control program decided in 2008. Both kinds of vaccines licensed today for the use in cattle have disadvantages: MLV vaccines concerning their safety and killed vaccines concerning efficacy. In the presented work, virus generated by transfection of conventional bovine cell lines with RNA derived from a new BVDV-2 full-length clone (Mischkale et al., 2009) was used to infect cattle. Its effects compared to the wild type strain were investigated. Further, two mutants derived from this BVDV-2 full-length cDNA clone were tested in a vaccination-challenge trial in cattle following two approaches of attenuation (pseudovirions and deletion of the Npro protein). Their safety and efficacy as vaccine candidates were investigated.

Theileria lestoquardi is a tick-borne protozoan parasite and highly pathogenic for sheep. The disease caused by the pathogen is known as malignant ovine theileriosis (MOT) and is transmitted by Hyalomma ticks. Control of the disease can be achieved by immunization of sheep with attenuated T. lestoquardi schizont-infected ovine cells that provides the animal with solid immunity. The approach of using the attenuated vaccine against malignant ovine theileriosis has been carried out successfully in Iraq and Iran. Better characterization of attenuated cell lines could result in the identification of markers that would allow more rapid selection of attenuated vaccine and reduce the cost of vaccine production. Since no work has been reported regarding attenuation mechanisms in T. lestoquardi, the following study investigated potential attenuation markers of T. annulata infected cells in a T. lestoquardi cell line at different passages. Two markers associated with attenuation in T. annulata vaccine strains were analyzed, matrix metalloproteinase activity and TNF-alpha mRNA expression. Furthermore, differentially expressed genes in higher passage and lower passage were analyzed using suppression subtractive hybridization in order to identify genes whose expression correlates with subculturing and thus potentially with attenuation. The expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP9) and matrix metalloproteinase-2 (MMP2) in the investigated cell line was confirmed by using specific inhibitors. The results showed gradual reduction in the activity of matrix metalloproteinase-9 (MMP9) with increasing passage number. Following the mRNA expression of TNF-alpha in different passages revealed down regulation of this cytokine from the low passage compared with high passage. Analysis of randomly selected clones in the suppression subtractive hybridization libraries identified nine differentially expressed genes, one from the parasite and eight from the host. Transcripts of retinoblastoma binding protein 7, Enolase-a (ENO 1), Ki-67 antigen and H2A histone from the host and vacuolar H+ATPase from the parasite were more plentiful in low passage culture. RAB14, a member of the RAS oncogene family, glucose transporter type 3, creatine kinase B, and cytochrome C oxidase transcripts from the host were more abundant in high passage culture. Quantitative real time-PCR confirmed mRNA expression of the parasite vacuolar H+ATPase to be downregulated at higher passages. The expression of the Ki-67 protein was clearly decreased with increasing passage number in western blot using specific antibody. Moreover, assessment of thymidine incorporation as a measure for the proliferation rate clearly showed that with increasing passage number, the proliferation rate of the T. lestoquardi infected cells decreases. This study revealed that the matrix metalloproteinase enzymes (9 and 2) and TNF-alpha could be potential molecular markers for identification of attenuation in the Theileria lestoquardi (Atbara) cell line. Also the down regulated parasite gene, vacuolar H+- ATPase could be considered as a molecular marker for attenuation. Immunization trials in sheep with different passages are required to provide in vivo evidence to support these findings.

The major aim of this thesis was to identify novel genes of T. uilenbergi through establishment and screening of a merozoite cDNA library with the eventual goal to develop diagnostic tools using identified genes for detection of Theileria infections. The experiments were initiated by infection of sheep using T. uilenbergi stock. When parasiteamia rose, blood was collected and the merozoites were purified. Messenger RNA was isolated from purified merozoites was then utilized to establish a cDNA library. The library was titrated to be 6 x 108 pfu/ml and the recombinant clones were estimated to be 70%. Random PCR identification of the library indicated all of the inserts were of parasite origin, indicating the usefulness of the library for the identification of new genes. Random PCR amplification of inserts of the cDNA library led to the discovery of 12 single clones, among which Clone 2, 9 and 26 exhibited a high degree of identity, especially at the 3' terminus and 3' untranslated region, indicating that they belong to the same gene family. Furthermore, PCR designed to target Clone 2 amplified again four variant genes from genomic DNA of T. uilenbergi and one from genomic DNA of T. luwenshuni, suggesting this gene family is likely isolate-specific since the DNA samples for PCR were not derived from the same parasite isolate used for library construction. Sequence analysis of another genomic fragment generated with primers targeting the 3' untranslated region of the Clone 26 sequence showed that both 5' and 3' termini were highly identical to the Clone 2 gene family and these homologous termini were separated by a 136 bp sequence fragment highly identical to the 3' untranslated region of the Clone 2 gene family, indicating Clone 2 gene family members are tandemly arranged. Bioinformatic analysis of cDNA sequences of the Clone 2 gene family indicated these genes contain signal peptides and encode potential immunogenic proteins. Analysis of recombinantly expressed Clone 2 revealed immunoreactivity with sera from Theileria-infected animals from China. No cross reaction with sera of T. lestoquardi-, Babesia motasi- or Anaplasma ovis- infected animals was observed, indicating a potential specificity of this gene family. The features of the Clone 2 gene family are similar to the Tpr gene family of T. parva, which is believed to play a role in concerted evolution. Based on the highly conserved region of the Clone 2 gene family, a set of six primers were designed for the development of a loop mediated isothermal amplification (LAMP). The established assay allowed the detection of T. uilenbergi and T. luwenshuni infections simultaneously and the reaction could be simply accomplished by incubation at 63ºC for 15 min. The specificity of the reaction was confirmed through EcoRI restriction enzyme digestion analysis and sequencing. The assay was sensitive as it detected 0.1 pg DNA of T. luwenshuni or T. uilenbergi. Moreover, the assay was evaluated by testing 86 field samples in comparison to the reverse line blot method, showing a calculated sensitivity and specificity of 66.0% and 97.4%, respectively. These results indicate that the LAMP assay has a potential usefulness for application in diagnostic and pidemiological studies on T. luwenshuni and T. uilenbergi infection of small ruminants. In addition, serological screening of the library led to discovery of a positive clone called TuIP, which has been deposited in Genbank under accession number FJ467922. Partially recombinantly cloned and expressed TuIP showed strong reactivity with serum from T. uilenbergi infected animals, indicating its potential usefulness for development of novel serological diagnostic tests or serving as a candidate for vaccine development in the future.