Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06 Archiv

In dieser Arbeit wurde das Koordinationsverhalten von Sauerstoffdonor-Liganden gegenüber der fac-ReI(CO)3-Einheit untersucht. Als Liganden wurden Diole und Polyole eingesetzt, sowie die Steroidhormone β-Östradiol, Testosteron und Cholesterin. Weiterhin wurden die Koordinationseigenschaften von Oxacalix[3]arenen gegenüber der fac-ReI(CO)3-Einheit untersucht. Dabei bilden die Diole (1S,2S)-trans-Cyclopentandiol (1S,2S)-Cptd und (1R,2R)-trans-Cyclohexandiol (1R,2R)-Chxd die zweikernige Komplexe [Re2(CO)6{µ-(1S,2S)-CptdH-1}3]- und [Re2(CO)6{µ-(1R,2R)-ChxdH-1}3]- mit der fac-ReI(CO)3-Einheit aus, in denen der Ligand jeweils einfach deprotoniert vorliegt und das Sauerstoffatom jeweils zwei Rheniumatome verbrückt. Dieses Strukturmotiv wird auch mit den Steroidhormonen gebildet. Es bilden sich zwei flächenverknüpfte Oktaeder aus, in welchen die drei Brückenpositionen jeweils von einem Sauerstoff-Atom eines Liganden eingenommen werden, so dass drei Liganden die drei Brückenpositionen besetzen. Mit 1,2,3-Triolen wie Glycerin (Glyc) oder Methyl-β-D-Ribopyranosid (Me-β-D-Ribp) bilden sich die dreikernige Komplexe [Re3(CO)9(µ3-O)(µ3-GlycH-3)]- und [Re3(CO)9(µ3-OMe)(µ3-1C4-Me-β-D-Ribp2,3,4H-3)]-, in denen der Ligand dreifach deprotoniert vorliegt und die drei Sauerstoff-Atome jeweils zwei Rhenium-Atome verbrücken. Die µ3-Koordinationsstelle kann von einem Oxido-, Hydroxido-, Alkoxido-, oder einem Thiolato-Liganden eingenommen werden. Das Pentitol D-Arabitol (D-Arab) und die Hexitole D-Sorbitol (D-Sorb) und Dulcitol (Dulc) können sechskernige Komplexe mit der fac-ReI(CO)3-Einheit aufbauen, indem zwei Polyolmoleküle jeweils fünffach deprotoniert vorliegen [Re6(CO)18(D-ArabH-5)2]4-, [Re6(CO)18(D-SorbH-5)2]4- und [Re6(CO)18(DulcH-5)2]4-. An ihnen können sich die sechs fac-ReI(CO)3-Einheiten so anordnen, dass jede von ihnen oktaedrisch koordiniert wird. Das Tetrol L-Threitol ist auf Grund seines speziellen Hydroxygruppenmusters in der Lage, den zweikernigen Komplex [Re2(CO)6(L-ThreH-3)]- auszubilden, in welchem jedes Sauerstoffatom des Liganden koordiniert ist. Dieser Komplex erweist sich als so stabil, dass er sogar in Wasser herstellbar ist. In der Kristallstruktur liegt die bisher kürzeste Wasserstoffbrückenbindung in Alkoxido-Komplexen vor (O•••O-Abstand: 2.36 Å). Die Oxacalix[3]arene bilden mit der fac-ReI(CO)3-Einheit einkernige Komplexe aus, in denen nur zwei der drei Phenoxidosauerstoff-Atome an das Rhenium-Atom koordinieren. Die dritte freie Koordinationsstelle wird von einem etherischen Sauerstoffatom eingenommen. Diese Komplexe fragmentieren wenn die Base DBU (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en) vorhanden ist, wobei eine Etherspaltung einsetzt und die DBU-Einheit in der resultierenden Verbindung an der Position eines früheren etherischen Sauerstoff-Atoms gebunden ist.

Zur Bekämpfung von genetisch bedingten Krankheiten werden oft Medikamente eingesetzt, die nur die Symptome bekämpfen, ohne aber die Ursache des Leidens zu eliminieren. Mit Hilfe der Gentherapie, so die Hoffnung, soll der Krankheits-verursachende Gendefekt durch therapeutische Fremdgene geheilt werden. In dieser Arbeit wurde eine auf EBV basierte Verpackungszellinie zur Herstellung von Genvektoren etabliert, welche unter Berücksichtigung aller derzeit bekannten Sicherheitsrisiken für eine Gentherapie optimiert wurde. Eine mögliche Anwendung für dieses EBV-basierte Gentransfersystem ist die Stimulierung von B-CLL-Zellen durch Expression des humanen CD40-Liganden. Dadurch sollen die Leukämiezellen einer Erkennung durch spezifische T-Zellen zugänglich gemacht werden. Für die Verwendung eines EBV-Genvektorsystems spricht unter anderem die hohe Effizienz der spezifischen Transduktion humaner B-Zellen, die große Fremdgen-Kapazität und die Fähigkeit zur latenten Infektion und daher langandauernden Genexpression. Zudem repliziert EBV episomal, modifiziert also nicht das Zellgenom. Allerdings ist EBV ein potentielles Tumorvirus. Daher wurden alle fünf bekannten Onkogene sowie der Transaktivator BZLF1 aus dem Helfergenom entfernt. Durch Deletion der Verpackungssignale wurde das Helfergenom so modifiziert, daß es nicht selbst in Virionen verpackt und freigesetzt werden kann. Die Verpackungseffizienz der Helferzellinie konnte durch FACS-Sortierung verbessert werden. Das EBV-Helfergenom wurde aus dieser Zellinie 293-VII+ reisoliert und seine Integrität durch PCR und Restriktionslängenvergleich bestätigt. Selbst bei provozierter Rekombination wurden von der Verpackungszelllinie 293-VII+ keine Virionen freigesetzt, die B-Zellen transformieren können. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung des therapeutischen hCD40L-tragenden Genvektors p2924 mit möglichst geringer Homologie zum Helfervirusgenom (TR und oriLyt als einzigen EBV-Sequenzen) und Verzicht auf Antibiotika-Selektionsmarker (stattdessen das nonsense suppressor-Transfer-RNA-Gen supF). Der bereits etablierte eGFP-tragende Genvektor p1933, welcher um etwa 6kb größer war und zusätzlich oriP trug, zeigte aber bessere Transfektionseigenschaften als p2924. Aus diesem Grund wurde unter anderem ein weiteres Genvektorplasmid konstruiert, bei welchem eGFP von p1933 durch hCD40L ersetzt wurde. Die Infektion bzw. Detektion von hCD40L auf B-CLL-Zellen war nur mit aufkonzentrierten Virusüberständen reproduzierbar, die mit diesem Plasmid hergestellt wurden. Allerdings trägt dieser Genvektor Amp als Selektionsmarker. Daher wurde zuletzt exemplarisch in dem eGFP-tragenden „großen“ Plasmid Amp durch supF ersetzt. Bislang wurden zur Propagierung von supF-Plasmiden Bakterienstämme verwendet, die die amber-Mutationen auf einem extrachromosomalen Plasmid enthielten. Um die einfache Gewinnung reiner Plasmidpräparationen zu ermöglichen, wurde auf der Basis von DH10B ein neuer Bakterienstamm mit chromosomaler amber-Mutation etabliert. Es wurde gezeigt, daß dieser Stamm sich zur antibiotikafreien Selektion und Produktion von supF-tragenden Plasmiden eignet. Somit stellt 293-VII+ eine optimierte Verpackungszelllinie dar, mit der EBV-basierte Genvektoren effizient hergestellt werden können, die sowohl etablierte B-Zelllinien als auch primäre B-Zellen transduzieren. Die erreichbaren Titer waren mit denen vergleichbar, die von der Verpackungszelllinie der ersten Generation (TR-2/293) produziert wurden. Die Produktion von Interferon- durch T-Zellen war erhöht, wenn sie mit B-CLL-Zellen stimuliert wurden, die zuvor mit Überständen aus verpackbaren, hCD40L-tragenden Vektoren nach Induktion des lytischen Zyklus transduziert wurden. Dieses Ergebnis lässt auf Aktivierung des Immunsystems in vivo hoffen. Ein völlig neuer Aspekt, der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig beobachtet werden konnte, war der Übertrag von eGFP-Protein aus der Verpackungszelllinie in Rezipientenzellen. Alle Beobachtungen lassen auf einen spezifischen Transfer des fluoreszierenden Proteins aus dem Zytoplasma der Verpackungszelle auf die Oberfläche der B-Zellen durch Exosomen schließen. Experimente mit dem Modellantigen pp65 zeigten, dass auch dieses Protein direkt übertragen werden konnte und dadurch die Aktivierung von antigenspezifischen T-Zellen induzierte. In ähnlicher Weise konnten auch in einem reduzierten System die parentalen 293HEK-Zellen nach Transfektion mit Plasmiden für das EBV-Glykoprotein gp350/220 und das Antigen pp65 Überstände produzieren, die zu einer spezifischen Stimulation von T-Zellen führten. Diese Ergebnisse legen die zukünftige Entwicklung eines an EBV angelehnten Antigentransfersystems nahe, durch das mit Hilfe von B-Zellen als Stimulatoren eine spezifische T-Zellaktivierung erreicht werden kann.

Diese Arbeit befasst sich mit der Quantendynamik und Kontrolle von photochemischen Reaktionen, die unter Beteiligung von konischen Durchschneidungen im Femtosekundenbereich ablaufen. Durch ultrakurze Laserpulse wird ein Wellenpaket in einem elektronisch angeregten Zustand erzeugt. Der Reaktionspfad des Wellenpaketes lässt sich durch verschieden geformte Laserpulse kontrollieren, die mit Hilfe der Optimal Control Theorie (OCT) ermittelt werden können. Spezielle Beachtung findet die Kontrolle von Fulgiden, die als molekulare Schalter fungieren können. Die Ringöffnung ihres isolierten photochromen Zentrums Cyclohexadien wird auf ab initio-Potentialflächen untersucht. Für die Behandlung der größeren Schaltermoleküle wurde ein flexibles Modell entwickelt, in dem sich der Einfluss verschiedener Parameter auf die Dynamik untersuchen lässt. Dabei werden sowohl die kohärente Laser-Materie-Wechselwirkung als auch die nicht-adiabatischen Kopplungen in den Grundzustand mit einbezogen. Um die Beschreibung der Dynamik zu vervollständigen, wurde eine neue Methode entwickelt, mit der die Relaxation eines Moleküls erstmals auch normerhaltend im Wellenpaketformalismus simuliert werden kann. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt in der Entwicklung und Anwendung von Kontrollstrategien für reaktive Systeme, die zwei typische Herausforderungen beinhalten: Ein großer Teil der Dynamik spielt sich in einem optisch dunklen Bereich der Potentialflächen ab und zudem sind die Produkte nach der Relaxation durch die konischen Durchschneidungen hoch schwingungsangeregt. Durch das Erarbeiten zweier allgemein anwendbarer Varianten des OCT-Algorithmus konnten diese Schwierigkeiten gelöst und die Reaktionen kontrolliert werden. Durch Anwendung beider Varianten ist es gelungen, den Schaltprozess sowohl durch die konischen Durchschneidungen als auch mittels eines Pump-Dump-Schemas zu kontrollieren und die Ausbeuten zu erhöhen.

The use of carbohydrates as ligands in coordination chemistry is an important area of research with many potential applications. Few studies have been done on the complexation behaviour of main group metals under aqueous conditions. In this thesis the complexation of carbohydrates in the presence of tin(IV) and lead(IV) central metals in aqueous solution was studied. Tin(IV) was investigated using 119Sn NMR techniques. It could be shown that a mixture of hexahydroxidostannate and the threefold amount of ethanediol forms a mixture of heteroleptic mono- and bis- (ethanediolato)hydroxidostannates and homoleptic tris(ethandiolato)stannate. In contrast to these observations, the threefold amount of beta-cyclodextrin with hexahydroxidostannate(IV) showed a single signal, whose chemical shift indicates a new, hexacoordinate, tin-containing species. When using lithium as a counterion, crystals suitable for X-ray diffraction grew over the course of one week. The results from the structural analysis were consistent with the spectroscopic results and show a supramolecular assembly with threefold rotational symmetry that consists of three components: three beta-cyclodextrin dianions, three tetrahedral tetraaqualithium cations and the tetravalent metal center. Attempts to prepare chelates using lead(IV) as the central metal by adding potential chelators such as oxalate, catecholate, or glycosides to hexahydroxidoplumbat(IV) solutions result in the formation of decomposition products. Surprisingly, beta-cyclodextrin could avoid decomposition and formed single crystals. X-ray analysis of the product showed lead(IV) complexed by three cyclodextrin dianions isotypic to the tin(IV)-cyclodextrin complex. It is the first described carbohydrate-lead(IV) complex. It could be shown, that the functional groups of the oligosaccharide cyclodextrin are able to assemble into a nanoscaled trimer that provides a mononuclear binding site for high valent metal centers. These findings may be helpful to develop other cyclodextrin-metal complexes with metals which show catalytic activity. One possible use for the developed system could be the treatment of heavy-metal-contaminated water.

Mit dieser Doktorarbeit wurde das Konzept von gemischt bimetallischen Reagenzien erfolgreich eingeführt. Hierbei wurden magnesierte Borester selektiv dargestellt und mit Elektrophilen umgesetzt. Dabei wurde der erste Halogen-Metall-Austausch in Gegenwart einer Borgruppe verwirklicht. Desweiteren wurden Reaktionen zur Funktionaliserung von Bororganylen etabliert, bei denen dem Produkt die wertvolle Kohlenstoff-Bor-Bindung erhalten bleibt und so weiteren Elaborierungen zur Verfügung steht. Ausserdem wurden magnesierte Acyl-substituierte Indolderivate durch eine Halogen-Magnesium-Austauschreaktion dargestellt. Im letzten Projekt wurden erfolgreich direkte mono- und multipel-magnesierte carbocyclische Arene mit TMPMgClLiCl dargestellt und mit Elektrophilen umgesetzt.

Flavins are physiologically relevant cofactors that catalyze various redox and light-induced reactions. Due to a high intrinsic reactivity, these compounds are found tightly bound to proteins with the chemistry of the flavin either narrowed to a defined reaction channel (flavoenzymes) or reduced to (almost) non-reactivity (flavin binding and carrier proteins). Lumichrome is a product of flavin photodegradation. In spite of the structural similarity to flavins, lumichrome has electronic properties which differ from flavins, preventing this compound from any physiological relevance as a cofactor. The interest in lumichrome is basically focussed on its role as a photosensitizing compound. Lumichrome is excited by the absorption of visible light and relaxes by transferring electrons or electronic energy to surrounding substrates and oxygen, exerting an unspecific toxic effect on the cellular environment. Dodecin is a dodecameric flavin binding protein comprising a novel ligand binding fold. It incorporates dimers of ligands arranged in antiparallel manner within each of the six identical binding pockets. In this thesis, structure and function of dodecin from the archaeal organism Halobacterium salinarum are reported. X-ray structural investigations supplemented with functional data revealed that this protein is an unspecific binder of flavins and binder of the flavin-like compound lumichrome. Dissociation constants were obtained in the nanomolar to micromolar range and found to correlate positively with the ligand size. The preference of dodecin for the small ligands lumichrome and lumiflavin is described as a gated ligand binding mode, based on the low plasticity of the dodecin binding pocket which sterically restricts the bulkier ligands from arranging the flavin aromatic subunit in a high affinity position. Site directed mutagenesis of the halophilic dodecin allowed to spread the idea of dodecin as a small ligand binding particle among homologous proteins. These mutational studies could moreover show that the halophilic type of dodecins is outstanding in additionally exhibiting a high affinity for riboflavin. The stabilization of the ribityl chain by an H-bond network to a single residue was found to suspend restrictions of the gated ligand binding mode and to enable H. salinarum dodecin to exhibit multiple (high) affinity. In Western-Blot and RT-PCR analysis of the dodecin expression level, it could be demonstrated that after a short lag period dodecin is constitutively expressed in light and in dark. In the late stationary phase, a clear influence of dodecin on the riboflavin cellular concentrations could be observed. While high levels of riboflavin were found in H. salinarum wild type cells, in cells of the dodecin deficient strain riboflavin cellular concentrations were depressed. Lumichrome concentrations on the other hand were unaffected from dodecin; however; increased concentrations of lumichrome were found in light, according to a photolytic degradation of riboflavin. In vivo data fully agreed with the deductions from the dodecin structural and functional investigations. Dodecin is a riboflavin binding and carrier protein (RfBP). Its function is to store riboflavin under non-favorable environmental conditions while preventing this flavin from photodegradation. The lumichrome-collecting property represents an extra-feature which allows binding of lumichrome if degradation of riboflavin occurs in order to protect the cellular environment from high amounts of this photo-toxic compound.

The present thesis deals with the development of nanoparticles based on the proteinaceous macromolecule gelatin as delivery system for various nucleotide-based drugs. Since a method to produce homogenous nanoparticles was already described in principle (Coester et al. 2000), it was the first approach to characterize, optimize, and standardize this manufacturing process. The next goal was to advance these plain gelatin nanoparticles via modification of the surface towards a delivery system for nucleotide-based drugs. Subsequent to this, the newly established carrier system should be evaluated in preclinical trials. In addition to these main projects, it was also an aim of this study to investigate and influence the biodistribution of gelatin nanoparticles. Due to the multitude of independent projects, the present work is divided into five self-contained chapters. In Chapter I, fundamental research data concerning the preparation of gelatin nanoparticles is described. Thereby, the work was focused on process optimization of the existing preparation procedure. Moreover, new analytical tools to characterize gelatin and the gelatin nanoparticles are introduced. Chapter II features the data that were produced in cooperation with the Department of Pharmaceutical Biotechnology at Ludwig-Maximilians-University Munich. In this cooperation, plasmid DNA was bound onto the surface of previously modified gelatin nanoparticles by electrostatic interactions. Subsequent preparation optimization, this simple non-viral gene delivery system was investigated in vitro on murine melanoma cells. The major project of this work, the development and evaluation of gelatin nanoparticles as carrier system for immunogenic so called CpG oligonucleotides is presented in Chapter III and Chapter IV. The data has been generated in cooperation with the Department of Internal Medicine at the Ludwig-Maximilians-University Munich and initially during a 3-month research stay at the Faculty of Pharmacy at the University of Alberta in Edmonton, Canada. Chapter III features extensive in vitro investigations on the respective primary murine and human target cells such as dendritic cells and B cells, whereas in Chapter IV, the results of in vivo experiments are presented. Here, the immunogenic effects of CpG oligonucleotide-loaded nanoparticles alone and their adjuvant activity in combination with the model protein antigen ovalbumin (OVA) were explored. In the final chapter, Chapter V, first PEGylation experiments of gelatin nanoparticles are described, with special emphasis on the establishment of new analytical tools for the quality control of the PEGylation process. In the second part of this chapter, radiolabeling strategies were developed in cooperation with the Department of Nuclear Medicine (TU Munich) to enable real-time in vivo tracking of the gelatin nanoparticles via positron emission tomography (PET).

Das Amyloid Precursor Protein (APP) spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung. Seine physiologische Funktion in Neuronen, in denen es sich hauptsächlich in den Synapsen befindet, ist immer noch weitestgehend ungeklärt. Mit Hilfe autaptischer, hippocampaler Neurone von APP-Knockout-Mäusen, konnte gezeigt werden, dass Knockout-Neurone signifikant erhöhte Amplituden stimulierter AMPA- und NMDA-Rezeptor vermittelter exzitatorischer postsynaptischer Ströme (EPSC) aufweisen. Des Weiteren ergab die Analyse spontaner exzitatorischer postsynaptischer Ströme (mEPSC) eine erhöhte Frequenz in APP-Knockout-Neuronen, bei gleich bleibender Amplitude der spontanen synaptischen Ströme. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der Verlust des APP-Gens zu einer Erhöhung der Anzahl funktioneller Synapsen führt. Diese Hypothese konnte durch immunhistochemische Untersuchungen weiter bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass APP-Knockout-Neurone tatsächlich mehr Synapsen pro kultivierten Neuron ausbilden als Wildtyp-Neurone. Demzufolge beeinflusst der Verlust des APP-Gens die Synapsenausbildung und dementsprechend auch die synaptische Übertragung in kultivierten hippocampalen Neuronen. Zusätzlich wurden autaptische Neurone von Mäusen mit Mutationen im APP und/oder Präsenilin1 (PS1), welche bei der vererbbaren Form der Alzheimer-Erkrankung auftreten, untersucht. Dabei zeigte sich, dass Mäuse, die entweder humanes PS1 mit der A246E Mutation allein, oder humanes PS1 mit der L166P Mutation zusätzlich zur K670N/M671L Doppelmutation im humanen APP exprimieren, eine verringerte AMPA-und NMDA-EPSC Amplitude gegenüber den jeweiligen Kontrollen aufweisen. Ebenso war der Pool freisetzungsbereiter synaptischer Vesikel bei beiden transgenen Linien gegenüber den Kontrollen verringert. Die Analyse spontaner synaptischer Ströme ergab bei der Linie mit der PS1(A246E) Mutation eine signifikant verringerte Frequenz bei gleich bleibender Amplitude der spontanen Ereignisse. Die immunhistochemische Auswertung zeigte eine Reduktion der Synapsenanzahl pro 10 µm Dendritenlänge, was die elektrophysiologischen Untersuchungen bestätigte. Die Daten deuten somit an, dass Mutationen im PS1 die synaptische Übertragung durch eine Reduktion funktioneller Synapsen beeinträchtigen. Damit verhalten sich die Ergebnisse aus der Untersuchung von Neuronen mit der PS1-Mutation genau entgegengesetzt zu den Daten der APP-Knockout-Neurone, was die wichtige Rolle von Aβ bei der Modulation der Synapsendichte verdeutlicht. Weiterführende Versuche, die der Identifizierung der verantwortlichen Aβ-Spezies (Mono-, Oligomere, Fibrillen) dienten, zeigten keine akute Beeinflussung der synaptischen Übertragung. Somit scheint die an PS1mut- und APPPS1-Neuronen beobachtete reduzierte synaptische Übertragung und Synapsenanzahl nicht sofort, sondern erst nach einiger Zeit in Kultur aufzutreten. Die vorliegende Untersuchung stellt die klassische Ansicht, der zufolge Aβ nur eine pathologische Funktion besitzt, in Frage. Die angenommene physiologische Funktion von Aβ könnte Therapieansätze, die auf einer kompletten Blockade der Aβ-Bildung beruhen, entscheidend beeinflussen.

Zu Beginn dieser Arbeit wurde DJ-1 erstmals mit der PK in Zusammenhang gebracht. Die ersten Studien zeigten, dass L166P, eine Punktmutation im C-Terminus des DJ-1-Proteins, und eine Deletion von Exon 1-5 zu den Mutationen gehören, die zu den motorischen Fehlfunktionen, den Kardinalsymptomen, im Parkinsonpatienten führen. Diese Arbeit konnte dazu beitragen die Funktion von DJ-1 besser zu verstehen bzw. die Auswirkungen des Fehlens von DJ-1 aufzudecken. Es stellte sich heraus, dass die Expression von L166P im Vergleich zu [wt]DJ-1 sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten stark reduziert war. Die stark verminderte Proteinexpression kann entweder durch eine erhöhte Instabilität der RNA, durch eine Störung in der Proteinsynthese oder einen beschleunigten Abbau hervorgerufen werden. Durch semiquantitative RT-PCR- und quantitative RT-PCR-Experimente konnten Instabilitäten der RNA ausgeschlossen werden. Eine ineffektive Translation konnte durch „Pulse-Chase“-Experimente und CHX-Inhibitorstudien ebenso entkräftet werden. Allerdings scheint ein gesteigerter Abbau von [L166P]DJ-1 verantwortlich für dessen reduzierte Expression zu sein. Die Art des beschleunigten Abbaus konnte zwar nicht zweifelsfrei geklärt werden, aber es zeigte sich, dass ein Zusammenhang zwischen der Stabilität und der Struktur von DJ-1 besteht. Dabei spielt die C-terminale Domäne eine große Rolle, die nur im DJ-1-Protein als signifikante Helix-Knick-Helix Struktur vorhanden ist, nicht aber unter seinen Strukturhomologen. In einer Mutagenesestudie konnte gezeigt werden, dass im Helix-Knick-Helix Motiv nicht nur die PK-assoziierte Mutante L166P, sondern auch die Helix-brechende Mutante V169P in derselben Helix (G-Helix) und eine Deletion am Knick des Motivs (deltaN173/G174) eine Destabilisierung von DJ-1 bewirken konnte. Helix-brechende Mutationen in der H-Helix zeigten keine verminderte Proteinexpression im Vergleich zu [wt]DJ-1. Die G-Helix-brechenden Mutanten scheinen das Protein konformationell so zu verändern, dass keine Dimerisierung mehr möglich ist, was aus Co-IP Studien hervorging. Das Helix-Knick-Helix Motiv, welches einen Großteil der Dimerberührungsfläche ausmacht, scheint bei der Dimerisierung eine entscheidende Rolle einzunehmen. Weiterhin konnte ein direkter Zusammenhang der Stabilität und Integrität von DJ-1 und seiner Funktion herausgearbeitet werden. Dabei sind die G-Helix-brechenden Mutanten unter oxidativem Stress weniger zytoprotektiv und können in (anti)-apoptotischen Signalwegen eine Expression von apoptotischen Genen nicht verhindern. Diese Prozesse sind abhängig vom oxidativen Stress und von der Fähigkeit von redox-sensitivem DJ-1 als Intermediator in apoptotischen Signalwegen antioxidative Gene zu aktivieren. Diese Erkenntnis ist vor allen Dingen in reaktiven Astrozyten von Wichtigkeit, die Neurone, in Parkinsonpatienten besonders die dopaminergen Neurone, vor oxidativem Stress schützen können. In reaktiven Astrozyten ist DJ-1 in großen Mengen lokalisiert und scheint die Aktivierung von Verteidigungssystemen wie GSH zu beeinflussen. Somit ist DJ-1 ein wichtiger Marker für erhöhten oxidativen Stress, nicht nur in der PK, sondern auch bei Schlaganfallpatienten. Eine erhöhte Produktion von DJ-1 würde einen größeren Schutz vor neuronalem Sterben bewirken, so dass dies auch therapeutische Möglichkeiten eröffnen könnte.

Maligne Erkrankungen sind in den Industrieländern, nach Herz-Kreislauferkrankungen, die zweithäufigste Todesursache. Aufgrund der Erfolge bei der Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen wird Schätzungen zufolge Krebs in den nächsten Jahren die häufigste Todesursache in den entwickelten Ländern sein. Trotz des klinischen und wissenschaftlichen Fortschritts ist die Prognose der meisten Tumorentitäten unverändert schlecht. Eine der Hauptursachen ist der Mangel an spezifischen Markern, um eine geeignete Frühdiagnostik, Vorsorge und Therapie zu ermöglichen. Biomarker, wie tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene, werden als potente Strukturen diskutiert, Karzinome bereits im Frühstadium zu diagnostizieren und im Rahmen von Therapien als Zielstrukturen eingesetzt zu werden. Seit einigen Jahren werden daher systematische Techniken zur Identifizierung neuer Tumorantigene entwickelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine bestehende Technologie zur Identifizierung von Tumorantigenen weiterentwickelt und optimiert werden. Die in der Arbeitsgruppe etablierte Technik namens AMIDA (Autoantibody-mediated Identification of Antigens) basiert auf der spezifischen Autoantikörper-vermittelten Selektion und Aufreinigung potenzieller Tumorantigene und deren anschließender zweidimensionaler Auftrennung und Isolierung. AMIDA ermöglicht prinzipiell die Identifizierung von Tumorantigenen, die durch posttranslationale Modifikationen immunogen wurden, wobei für die Isolierung das komplette Proteom zur Verfügung steht. Es wurde eine allogene Variante etabliert, welche die Technik unabhängig von autologen Tumorbiopsien macht (allo-AMIDA). Neben der Einführung geeigneter Kontrollen kann allo-AMIDA nun im präparativen Maßstab durchgeführt werden. Der Vorteil von allo-AMIDA gegenüber AMIDA und anderen Strategien ist, neben der schnellen und reproduzierbaren Durchführung, die nunmehr universelle Einsetzbarkeit der Methode. Zur Identifizierung von Tumorantigenen werden lediglich Seren von Tumorpatienten und eine geeignete Tumorzelllinie benötigt. Allo-AMIDA wurde am Beispiel von Karzinomen des Kopf-Hals-Bereiches eingesetzt und führte zur Identifizierung von insgesamt 12 potenziellen Tumorantigenen. Neun der 12 Tumorantigene wiesen zum Zeitpunkt der Identifizierung eine Assoziation mit Tumoren auf, fünf davon sind etablierte Tumorantigene, was die Eignung von allo-AMIDA zur Identifizierung von TAs beweist. Für die allo-AMIDA-Antigene Grb-2 und Hsp-27 konnte eine starke Expression in Tumorzellen der Kopf-Hals-Entität gezeigt werden. Drei der allo-AMIDA Antigene waren bis zum Zeitpunkt ihrer Identifizierung nicht mit malignen Erkrankungen assoziiert. Eines dieser Proteine – hnRNP H (heterogeneous ribonucleoprotein H) – stellte sich als geeigneter Marker für Tumorzellen des Kopf-Hals-Bereiches heraus. Es konnte auf Transkript- und Proteinebene gezeigt werden, dass hnRNP H bereits in hyperplastischem Epithelien vermehrt gebildet wird und mit zunehmender Karzinogenese in den meisten primären Tumoren bzw. Metastasen dieser Tumorentität stark überexprimiert ist. Interessanterweise war diese starke Expression auf Tumorzellen beschränkt. In anderen Tumorentitäten (Kolon-, Pankreas-, Mamma-Karzinom) war hnRNP H ebenfalls stark über-exprimiert, die Expression in humanen nicht-malignen Geweben war sehr heterogen. Da bis dato wenige Informationen über die Funktion dieses nukleären Proteins bekannt sind, wurde hnRNP H detaillierter analysiert. In der Literatur wird diskutiert, dass hnRNP H am alternativen Spleißen von prä-mRNAs bzw. an der Regulation dieses Prozesses beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Repression von hnRNP H durch RNAi zur Apoptose von Tumorzelllinien führt. Mittels Genexpressionanalyse konnten potenzielle Zielgene im Bereich Apoptose identifiziert werden, die von hnRNP H durch alternatives Spleißen reguliert werden. hnRNP H ist an der Regulation des Bcl-X-Gens beteiligt, was von Garneau und Kollegen (2005) kürzlich ebenfalls gezeigt werden konnte. Die Regulation von ARAF1 durch hnRNP H wurde erstmals gezeigt; ein potenzieller Weg, wie die Deregulation von ARAF1 Apoptose induzieren kann, wird vorgeschlagen. Die Validierung der Zielgene von hnRNP H im Kontext von Tumorzellen ist Gegenstand laufender Projekte und weiterer Analysen.

Die Dissertation umfasst im 1. Teil die Synthese von 23 akzeptorsubstituierten Benzhydryl-Derivaten. Im 2. Teil werden die Solvolysen der synthetisierten Benzhydryl-Derivate in unterschiedlichen Lösungsmitteln kinetisch untersucht. Die bestimmten kinetischen Daten und die Daten der im Arbeitskreis vorangegangenen Arbeiten sowie ausgewählte Systeme aus der Literatur werden einer Korrelationsanalyse unter Verwendung der von Prof. Dr. Herbert Mayr 2004 erstmals aufgestellte Linearen-Freien-Enthalpie-Beziehung log k (25 °C) = sf (Nf + Ef) unterzogen. Dadurch konnten die bestehenden Datensätze über einen Bereich von 6 Größenordnungen hin zu schwächeren Elektrofugen und von über 5 Größenordnungen hin zu besseren Nukleofugen ausgebaut werden. Im 3. Teil der Arbeit wurden die Reaktionen der akzeptorsubstituierten Benzhydrylium-Ionen mit Arenen und elektronenarmen Alkenen kinetisch Untersucht. Durch eine eingeschränkte Korrelationsanalyse der bestimmten Daten und bestehenden Referenzdaten nach der von Prof. Dr. Herbert Mayr und Dr. Matthias Patz 1994 erstmals aufgestellte Linearen-Freien-Enthalpie-Beziehung log k (20 °C) = s (N + E) konnten die Elektrophilie-Skala um 4 Größenordnungen hin zu reaktiveren Kationen und die Nukleophilie-Skala um 3 Größenordnungen hin zu weniger reaktiven Nukleophilen ausgebaut werden. Es konnte gezeigt werden, das es zwischen den Elektrophilie-Parameter E und dem Elektrofugie-Parameter Ef einen umgekehrt proportionalen Zusammenhang gibt (E = -0.91 Ef + 0.08).