Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 17/19 Archiv

In der vorliegenden experimentellen Studie wurden verschiedene Referenzachsen und bildgebende Verfahren zur Bestimmung der tibialen Reklination (Tibial Slope) verglichen. Zudem wurde eine neue, computernavigierte Methode zur Bestimmung des Tibial Slope entwickelt und anhand eines Prototyps validiert. Tibial-Slope-Werte, die unter Verwendung von lediglich einer einzigen anatomischen Referenz (PTC bzw. ATC, posteriore bzw. anteriore tibiale Corticalis) ermittelt wurden, wiesen eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber Einflussfaktoren wie anatomischen Varianten oder Messfehlern auf. Für die geometrisch aus PTC und ATC gemittelte Referenzachse (TPAA) konnten eine hohe Validität und Reliabilität bestätigt werden. Der neu eingeführte, arithmetisch gemittelte Wert (MPA, Mittelwert aus posteriorer und anteriorer Corticalis) wies eine exzellente Korrelation zum etablierten TPAA-Wert auf. Im Gegensatz zu diesem konnte der neue MPA-Wert jedoch einfacher bestimmt sowie in zusätzlichen Szenarien angewandt werden. Computer- und Kernspintomografie zeigten sich bei der exakten Bestimmung des Tibal Slope als ebenbürtig und wiesen identische Werte auf, z. B. bei der Vermessung der Knochen mittels digitalem Goniometer. In der MRT lassen sich zwar verlässliche Werte erheben, jedoch ist nach Anfertigung der Aufnahmen keine Korrektur der Aufnahmeebenen möglich. Um den exakten Tibial Slope anhand konventioneller Röntgenaufnahmen verlässlich ermitteln zu können, zeigte sich eine streng laterale Aufnahme als notwendig, die jedoch eine Diskriminierung von medialem und lateralem Tibial Slope erschwert. Unter der Voraussetzung der korrekten Ausrichtung wiesen selbst kurze Röntgenaufnahmen, wie diese von der Größe her im Klinikalltag Verwendung finden, eine exzellente Korrelation zu mittels Computertomografie erhobenen Tibial-Slope-Werten auf. Trotz vergleichbarer Reliabilität der gegenübergestellten konventionellen Methoden scheint die Computertomografie für den klinischen Alltag aufgrund der hohen Verfügbarkeit, einfachen Anwendbarkeit sowie der Möglichkeit des Einsatzes bei einem breiten Patientenspektrum als am geeignetsten. Um der erschwerten exakten Ausrichtung im Klinikalltag Rechnung zu tragen, wurden im konventionellen Röntgen die Auswirkungen einer Fehlrotation des Präparats im Strahlengang auf den gemessenen Tibial Slope näher untersucht. Der nicht direkt proportionale Zusammenhang zwischen Fehlrotation und gemessenem Tibial Slope konnte erstmalig mit einer mathematischen Formel dargestellt werden. Im Wissen um den Grad der Fehlrotation gelang es anhand der Formel, den wahren Tibial-Slope-Wert zu errechnen. Ein neu entwickelter Prototyp ermöglichte es, die dreidimensionale Lage und Position des Knies in Echtzeit im Strahlengang zu verfolgen und so die Fehlrotationen bei der Anfertigung von Röntgenaufnahmen zu ermitteln. Über eine grafische Benutzeroberfläche des Prototyps konnten alle Bewegungen der Tibia verfolgt und der am Röntgenbild gemessene, durch Fehlrotation verfälschte Wert korrigiert werden. Im Rahmen der Versuchsreihe ließen sich Funktionsfähigkeit, Genauigkeit und Verlässlichkeit von entwickelter Software und Prototyp validieren. Die neue Methode ermöglichte unter praxisnahen Bedingungen eine Bestimmung des Tibial Slope im konventionellen Röntgen, deren Validität und Reliabilität bisher dreidimensionalen bildgebenden Verfahren vorbehalten waren.

Major advances in understanding and treating breast cancer have been made in the last two decades, yet it remains a significant problem with breast cancer being the most commonly identified cancer and the leading cause of cancer death among women worldwide. For many years breast cancer research has mainly focused on genetically changed cancer cells. However, recently the importance of the stromal compartment surrounding cancer cells in facilitating tumor growth, invasion and metastasis has been widely recognized. Cumulating evidence suggests that in particular carcinoma-associated myofibroblasts play a key role within the tumor stroma and influence many aspects of carcinogenesis. Nevertheless, the cell type of origin as well as the precise mechanisms by which these cells develop has not been conclusively established and remains controversial. The role of human adipose tissue derived stem cells (hASCs) in this context has not been studied so far. hASCs are locally adjacent to epithelial breast cancer cells and might represent early response cells within the tumor stroma. Hence, the aim of this study was to investigate whether carcinoma-associated myofibroblasts may originate from hASCs. The present study revealed that a significant percentage of hASCs differentiate into myofibroblast-like cells expressing alpha smooth muscle actin (α-SMA) and tenascin-C when exposed to conditioned medium from the human epithelial breast cancer cell lines MDMAB231 and MCF7. This process is induced by transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) secreted from breast cancer cells. It was shown that conditioned medium from MDMAB231 and MCF7 contains significant amounts of TGFβ1. It could further be demonstrated that the differentiation of hASCs towards myofibroblasts is dependent on TGFβ1 signaling via phosphorylation of Smad2 and Smad3 in hASCs. The induction of myofibroblasts can be abolished using a neutralizing antibody to TGFβ1 as well as by pretreatment of hASCs with SB431542, a selective inhibitor of the TGFβ1 activin receptor-like kinases 4, 5 and 7. Additionally, hASC-derived myofibroblasts exhibit functional properties of carcinoma-associated myofibroblasts such as the increased secretion of the tumor-promoting soluble factors SDF-1α and CCL5. Furthermore hASC-derived myofibroblasts as well as conditioned medium from these cells promote the in vitro invasion of MDAMB231 breast cancer cells. Moreover inhibition of the TGFβ1 signaling pathway in hASCs reduces the potential of these cells to enhance the invasion of breast cancer cells. Overall, the data of the present study suggest that human adipose tissue derived stem cells can differentiate into carcinoma-associated myofibroblast under the influence of TGFβ1 secreted from breast cancer cells in vitro. The differentiation of hASCs towards these tumor-promoting cells can be abolished by targeting the TGFβ1 signaling pathway. Hence, inhibition of the TGFβ1 signaling pathway may prove to be an interesting target for breast cancer therapies. In vivo studies on the cancer microenvironment under special consideration of the interactions between hASCs and cancer cells should be of interest for breast cancer research in the future.

Summary: Allergic diseases have exponentially increased during the last decades. The complexity of its aetiology is due to multifaceted interactions between genetic and environmental factors on the development of the immune system. While advances of technology have identified allergy susceptibility genes, functional assays are needed to better understand the underlying mechanisms. Epidemiological studies have consistently shown that rural/farm environments are protective for the development of allergic diseases, including asthma and atopic sensitization. Importantly, prenatal and early life exposures have been shown to confer the strongest protection effects. The mechanisms of how farming modulates the immune system are still not disentangled in detail but include regulation of innate receptors and Regulatory T cells. In the herewith presented thesis, the following main findings were achieved in the context of genetic and immunological influences on development of allergic disease in two different birth cohort studies: First, 200 neonates were assessed for genetic influence of polymorphisms on neonatal immune responses and development of allergic diseases in childhood. The present study suggested a role for polymorphisms in the Th2-pathway, particularly for STAT6 rs324011, on immune regulation at an early stage of immune maturation, namely significantly lower Treg-associated gene expression and Th1-polarization. Polymorphisms in the Th1-pathway, namely the transcription factors TBX21 and HLX1, were shown to be relevant in shaping early immune responses and mainly Th2 cytokines at birth. Th1 and Th2 genotype-related immune responses at birth were partially associated with development of allergic diseases and/or protection during early life. These children are currently followed until the age of 6 years to further investigate allergic and respiratory disease during age-related immune maturation. Secondly, almost 150 children were investigated at the age of 6 years to assess the role of regulatory T cells in relation to farm exposures and clinical outcomes of allergic diseases. Our data indicated an inverse association of farm exposures and the prevalence of asthma during childhood. Children exposed to hay, stable and farm milk had a lower prevalence of asthma. Regarding underlying immune mechanisms, we have detected that children with contact to hay have increased levels of Treg cells and that farm milk intake earlier during childhood can still be partially reflected on Treg cells levels at age 6 years. Assessing Treg functional mechanisms, changes in cytokine secretion were observed depending on the farming and asthmatic status of the children, however confirmation in a larger number of children is required In summary the present work indicated that Th1 and Th2 polymorphisms were associated with modulated immune responses already at birth and influenced allergic disease development during the first three years of life. Furthermore, farm exposures were associated with a lower prevalence of asthma and associated with modulation of regulatory T cell frequency in German children at age 6 years.

In der Arbeit "Langzeitergebnisse nach Fundoplikatio bei Kindern" wurden die Daten aller Kinder, die im Zeitraum von Januar 2001 bis Februar 2005 in der Dr. von Haunerschen Kinderklinik operiert wurden, ausgewertet. Dabei handelte es sich um 39 Patienten, davon 17 Mädchen und 22 Jungen, die eine Fundoplikatio nach Thal, Nissen oder Boix-Ochoa erhielten. Für die Arbeit wurden einerseits im Rahmen einer retrospektiven Fall-Kontroll-Studie die präoperativen Befunde der Kinder, die Operationsberichte und Akten des stationären Aufenthaltes sowie die postoperativen Nachsorgekontrollen ausgewertet. Andererseits gab es zur langfristigen Verlaufskontrolle ein Telefoninterview mit den Eltern der Kinder mit einem Fragebogen zur Symptomentwicklung und Lebensqualitätsverbesserung nach Fundoplikatio. Ziel unserer Arbeit war es, herauszufinden, ob mit der Fundoplikatio in unserer Patientenkohorte ein gutes Nutzen-Risiko-Verhältnis erzielt werden konnte. Durch Vergleiche unterschiedlicher Patientengruppen versuchten wir, Tendenzen zu erkennen, welche Patienten in Bezug auf Vorerkrankung, Manschettenart und Operationstechnik in der Gegenüberstellung den größten Vorteil aus der Antirefluxchirurgie erzielen konnte. Auch wollten wir feststellen, welche Art von Symptomen einem operativen Behandlungserfolg am besten zugänglich war. Im Langzeitvergleich der Manschettenart zeigten sich bezüglich eines Rezidives (Rezidivösophagitis und radiologischer Rezidiv-GÖR) schlechtere Ergebnisse für die Thal-Operation als für die Nissen-Fundoplikatio (37,5% vs.7,7% und 25% vs. 15,4%). Nur der unmittelbar postoperative Rezidivreflux war bei Nissen-Operationen etwas häufiger (15,4% vs. 12,5%). Weiterhin war die Thal-Operation mit mehr Manschettenkomplikationen assoziiert (29,2% vs. 7,7%). Im Gesamtüberblick zeigte sich aber auch bei mehr Thal-operierten Kindern ein vollkommen komplikationsloser postoperativer Verlauf als bei Kindern nach Nissen-Operation (45,8% vs. 30,8%). Die Reoperationsrate war nach Nissen-Fundoplikatio höher (23,1% vs. 16,7%), ebenso geringfügig die direkt postoperative Dysphagie (23,1% vs. 20,8%). Weiterhin fällt ein häufigeres Auftreten von neu entstandener Dysphagie im Langzeitverlauf nach Nissen-Fundoplikatio auf (23,1% vs. 8,3%). Die laparoskopische Operationsform ist in unserer Studie mit mehr Refluxrezidiven in der ersten postoperativen Röntgenkontrolle verbunden (21,1% vs. 5,0%). Hier zeigte die offene Operation ein deutlich besseres Outcome, während es im Langzeitverlauf im Hinblick auf die Refluxrezidive keinen deutlichen Unterschied mehr gab zwischen offener und laparoskopischer Operationstechnik. Während die Rate an Ösophagitisrezidiven bei der offenen Operation etwas höher lag (30,0% vs. 26,3%), waren die laparoskopisch operierten Patienten mehr von Rezidivreflux in der Langzeit-Röntgenkontrolle betroffen (26,3% vs.20,0%). Die Häufigkeit des Auftretens von postoperativen Komplikationen (ohne Unterscheidung der Art der Komplikation) war bei laparoskopischer und offener Technik fast gleich (52,6% vs. 55,0%). Die Reoperationsrate war bei den offen operierten Kindern etwas höher (20,0% vs. 15,8%). Intraoperativ traten beim laparoskopischen Operationszugang mehr Blutungen auf (15,8% vs. 5,0%), bei offener Operation mehr Organläsionen (25,0% vs. 10,5%, bedingt vor allem durch die wesentlich höhere Zahl an Komplikationen durch Verwachsungen bei voroperierten Kindern). Alle drei Fälle mit postoperativem Ileus/Subileus waren offen operiert worden (15,0% vs. 0%). Die Ergebnisse des Gruppenvergleichs zwischen neurologisch retardierten Patienten (Gruppe A), gastrointestinal vorerkrankten Kindern (Gruppe B) und ansonsten gesunden Patienten (Gruppe C) zeigten im Vergleich ähnliche Erfolgs- und Komplikationsraten bei den vorerkrankten wie bei den gesunden Patienten. In der Symptombewertung im Langzeitverlauf schnitt Gruppe B sogar besonders gut ab. Die endoskopische Rezidivösophagitis in der Langzeitkontrolle war bei Gruppe C deutlich höher als bei Gruppe A (50,0% vs. 15,0%, allerdings war in der Gruppe C relativ häufig therapierefraktäre Ösophagitis bereits die Operationsindikation). Auch in der direkt postoperativen Magen-Darm-Passage war der Anteil der gesunden Patienten mit Reflux-Rezidiv relativ hoch (25,0%). Man kann also aus unserer Patientengesamtheit nicht den Schluss ziehen, vorerkrankte Patienten profitierten von der Fundoplikatio weniger als gesunde Patienten. Die Komplikations-, Rezidiv- und Reoperationsraten sind bei den geunden Kindern unserer Studie nicht besser als bei den vorerkrankten Kindern. Allerdings zeigten sich bei den Symptomen, die die Indikation für die Fundoplikatio darstellten, Unterschiede zwischen den Gruppen A bis C sowohl in der Art der Beschwerden als auch in deren Verlauf. Insgesamt waren gastrointestinale Beschwerden wie Erbrechen und Dysphagie mit der Fundoplikatio gut therapierbar ebenso wie Gedeihstörung, die am meisten bei Gruppe C als Hauptsymptom beschrieben war. Respiratorische Symptome konnten vor allem in der Gruppe der neurologisch retardierten Kinder nur zu einem geringen Prozentsatz behoben werden (23,1% beschwerdefrei). In Gruppe B war das Ergebnis nach Operation für die Kinder mit pulmonalen Komplikationen besser (60,0% beschwerdefrei), in Gruppe C waren Beschwerden im Respirationstrakt nur bei einem Kind ausschlaggebend für die Operation. Die medikamentös-therapierefraktäre Ösophagitis zeigte einen nur mäßigen bis keinen Erfolg nach der operativen Therapie (66,7% unverändert), wie man vor allem an den hohen Rezidivraten bei Patienten mit isolierter GERD sieht. Der Bedarf an Säureblockern konnte postoperativ erheblich gesenkt werden und weniger als ein Drittel der Kinder musste nach der Fundoplikatio noch kontinuierlich auf Protonenpumpenhemmer zurückgreifen. Ein wichtiges Ergebnis der Studie ist eine große Elternzufriedenheit und deutliche Lebensqualitätsverbesserung der operierten Patienten, die sich aus der telefonischen Interview der Eltern ergab. Der Nachsorgezeitraum war seit OP bis zum Telefoninterview im Median 7,3 Jahre (+/-1,7). Die Komplikations-, Rezidiv- und Reoperationsraten der Fundoplikatios unserer Studie waren im Literaturvergleich relativ hoch, allerdings haben wir auch sehr detailliert alle Komplikationen aufgezeichnet, was sicher auch die hohen Prozentzahlen mit bedingt. Bei der Indikationsstellung zur Operation ist es wichtig, die häufigen Komplikationen und die relativ hohen Rezidiv- und Reoperationszahlen zu bedenken. Allerdings ist die Befragung zur Symptomentwicklung und Lebensqualitätsverbesserung im Langzeitverlauf ein ebenso wichtiger Erfolgsmaßstab. Das umfassend positive Ergebnis der Elternbefragung hat gezeigt, dass gerade auch die chronisch kranken Kinder von der Fundoplikatio deutlich profitieren können.

In the past view decades the therapy of malignant diseases has improved significantly. However especially metastatic diseases and relapses still require the development of new therapeutic modalities. Most chemotherapeutic agents induce apoptosis. A better understanding of apoptosis signaling is needed in order to combine cytostatic drugs in a more efficient way and to develop new targeted therapies. Conventional cytotoxic drugs and new therapies target p53, a key regulator of apoptosis. p53 is one of the most intensively studied target proteins but the heterogeneity and diversity of the function of p53 remains unclear. We investigated the importance of p53 in the intrinsic and extrinsic apoptosis signaling, via a variety of molecular biological approaches (Wachter et al., 2013). Apoptosis is induced intrinsically by the release of pro-apoptotic proteins from the inter-membrane space of the mitochondrion (eg. doxorubicin) or via activation of death receptors on the surface of the cell (eg. TRAIL, Tumor necrosis factor Related Apoptosis Inducing Ligand). As described in the literature, wildtype p53 leaded to an increase in intrinsic cell death, whereas different p53 mutations reduced apoptosis. In our work we discovered that the influence of p53 status on extrinsic cell death induction was much more multifaceted. The presence of p53 in tumor cell lines and xenograft tumor cells resulted in augmented, unaffected or decreased cell death. With great interest we discovered that the replacement of wildtype p53 by mutant p53 did not disturb the extrinsic apoptosis inducing capacity. As a next step we studied the influence of cell cycle arrest induced by p53 activation on TRAIL apoptosis sensitivity (Ehrhardt/Wachter et al., 2013). Cell cycle arrest was induced in tumor cell lines and patient samples in G0, G1 or G2 with cytostatic drugs, phase-specific inhibitors or RNA interference against cyclinB and E. Molecular or biochemical arrest at any point of the cell cycle augmented the rate of apoptosis by TRAIL. Consequently, when cell cycle arrest was deactivated by adding caffeine, the antitumor activity of TRAIL was decreased. The extrinsic apoptosis by TRAIL was increased in senescent tumor cells. This is especially important for the therapy of minimal residual disease and for the prevention of relapse caused by resting tumor cells. Additionally, we studied the impact of p53 activation on the rate of apoptosis induced by combinations of cytostatic drugs (Ehrhardt, Schrembs, Moritz, Wachter et al., 2011). A single drug is not very effective in cancer therapy therefore malignant diseases are usually treated with a combination of cytostatic agents. Co-administration of anthracyclines and vinca alkaloids on the same day is a standard of care for hematopoietic malignancies. If both drugs are applied simultaneously, doxorubicin inhibits apoptosis induction of vincristine. While it is well understood that doxorubicin activates p53 and induces cell-cycle arrest, we observed that cell-cycle arrest disabled inactivation of anti-apoptotic Bcl-2-family members by vincristine. Therefore, it follows that vincristine was unable to activate downstream apoptosis signaling. Cycling cells are required for vincristine to kill cancer cells efficiently. In summary we have shown the heterogeneity of p53 in extrinsic and intrinsic apoptosis signaling. The impact of the p53 status of tumor cells on extrinsic apoptosis signaling should be considered, especially in the context of therapeutic approaches that aim to restore p53 function to enable cell death. p53 can act pro- and anti-apoptotic, depending on the individual patient tumor cell and on drug and signal interactions. Finally, this suggests that patients benefit from an individualized therapeutic regimen. Further investigation is required in order to better understand the therapeutic potential of these complex interactions.

Die Polkörperdiagnostik ist ein reproduktionsmedizinisches Verfahren zum indirekten Nachweis von numerischen und strukturellen Chromosomenaberrationen von Eizellen. Ziel der Arbeit war, die Effizienz der Polkörperdiagnostik mit FISH zu analysieren und den Einfluss von verschiedenen Faktoren auf die Hybridisierung aufzudecken. Hierzu wurde eine retrospektive Datenanalyse aus sieben Jahren Polkörperdiagnostik mit knapp 1200 Polkörpern durchgeführt.

Unsere Forschungsgruppe hat eine neue, sensitive und robuste Methode entwickelt, um selektiv die Fettsäuren der Glycerophospholipidfraktion im Plasma zu bestimmen, welche nur wenig vom postprandialen Status des Probanden beeinflusst werden. Bei diesem neuen Verfahren wird die konventionelle Lipidextraktion und deren Auftrennung durch eine methanolische Ausfällung der Proteine mit zusätzlicher Ausfällung von Triglyceriden und Cholesterinestern ersetzt. In Kombination mit basenkatalysierter Synthese von Methylestern bei Raumtemperatur wird die ausschließliche Umesterung der Glycerophopholipid (GPL) Fettsäuren gesichert. In der Vergangenheit hat sich gezeigt, dass sich dieses Verfahren nicht einfach von Plasma auf Erythrozyten übertragen lässt, sodass es notwendig war, die Anwendbarkeit der Plasma-GPL Methode auf Erythrozyten zu überprüfen, zu optimieren und zu validieren, bevor sie in klinischen Studien Anwendung finden kann. Im Rahmen dieser Untersuchung bestimmten wir auch den Omega-3-Index und verglichen diese mit in der Literatur beschriebenen Werten. Außerdem haben wir eine robuste Methode für die Analyse von Wangenschleimhaut Glycerophopholipid (GPL) gebundenen Fettsäuren entwickelt, welche nur wenig Probenmaterial benötigt und einfach anzuwenden ist. Die genannten Methoden zur Extraktion von GPL wurden im Rahmen einer klinischen Interventionsstudie evaluiert. Dabei wurden vor allem der Docosahexanensäure(DHA)-Anstieg im zeitlichen Verlauf der Studie zwischen den verschiedenen Kompartimenten Plasma, Erythrozyten und Wangenschleimhautzellen verglichen und Korrelationen berechnet, um eine Aussage darüber treffen zu können, welcher Biomarker, welche Änderungen widerspiegelt und wie geeignet die Analyse von GPL der Fettsäuren im Vergleich zu langjährig etablierten Markern, wie Gesamt-Phospholipide ist.