Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19 Archiv

The immune system is highly organized and multifunctional; it protects the organism against invading pathogens (immune response), while at the same time being tolerant to ‘self’ (immune tolerance). Central tolerance is achieved during T-cell development by negative selection via self-peptide-MHC complexes (pMHC) presented by thymic dendritic cells (tDCs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). However, how self-antigens are processed into peptides that further are shuttled onto major histocompatibility complex (MHC) class II in thymic epithelial cells (TECs) is not fully understood. One candidate pathway involved in this process is macroautophagy (referred to as autophagy hereafter), originally thought to solely be involved cellular housekeeping, has previously been implicated to contribute to MHC class II endogenous antigen presentation by TECs. This research project investigates the role of autophagy in negative selection by TECs. A model antigen was targeted specifically to the autophagosome in autoimmune regulator (Aire)+ mTECs. Transgenic mice expressing this antigen were generated. Experimental data indicated that the efficient direct presentation of this endogenous antigen by mTECs observed in vitro was sufficient to induce negative selection in vivo. By contrast, interference with autophagosomal processing of this antigen through exchange of one amino acid or disruption of an essential autophagy gene abolished endogenous antigen presentation by mTECs and impaired negative selection, which resulted in the escape of autoreactive CD4 T-cells. Moreover, further investigation showed that if the level of antigen expression was limited, autophagy-dependent direct presentation by mTECs was essential for T-cell deletion, while with sufficient amounts of antigen provided by mTECs, direct presentation by mTECs and indirect presentation by tDCs co-operated to induce central CD4 T-cell tolerance. These findings strongly suggest that the autophagy pathway contributes to CD4 T-cell tolerance induction by facilitating the loading of intracellular antigens onto MHC class II in mTECs.

Type 2 diabetes is a metabolic disorder with globally increasing prevalence. Therefore, the identification of etiological factors is of ascending relevance for the understanding, treatment, and prevention of the disease. Levels of the acute-phase serum amyloid A (A-SAA) protein have been found to be elevated in type 2 diabetic subjects, but little is known about their causal implication in the development of type 2 diabetes so far. This doctoral thesis presents an epidemiological perspective on the association between circulating levels of A-SAA and risk of type 2 diabetes and assesses a possible causality in this association using a genetic approach. Three studies were conducted. In a prospective cohort study, A-SAA levels were measured in 836 initially non-diabetic, elderly, Western European subjects without clinically overt inflammation who participated in a seven-year follow-up examination. Results of this study provided first evidence that levels of A-SAA are elevated years before the manifestation of type 2 diabetes independent of other type 2 diabetes risk factors. However, adjustment for parameters related to glucose metabolism, particularly levels of 2h-glucose, attenuated the association suggesting a potential link via post-challenge hyperglycemia in the association between elevated levels of A-SAA and type 2 diabetes or, alternatively, a possible reverse causality between levels of A-SAA and 2h-glucose. In a meta-analysis of genome-wide association studies (GWAS) on levels of A-SAA conducted in three population-based studies and one prospective case-cohort study including a total of 4,212 participants of European descent two biologically highly plausible genetic susceptibility loci for A-SAA proteins at chromosome 11p15.5-p13 and chromosome 1p31 were identified. One of these loci represented a suitable candidate for a Mendelian Randomization study. In Mendelian Randomization studies, genetic variants are used as proxies for a biomarker. These studies benefit from the fact that genotypes are randomly assorted at meiosis and are largely independent of non-genetic confounding and disease processes. Thus, they constitute a genetic approach to assess whether the association between a biomarker and a disease is causal. The associations between genetic variants of the candidate locus and type 2 diabetes were extracted from the results of a meta-analysis of eight GWAS (8,130 cases, 38,987 controls) published by DIAGRAM, a large diabetes and genetic consortium. In spite of sufficient power, the above mentioned associations were not significant suggesting that there are genetic mechanisms that raise plasma levels of A-SAA without translating into an increase in type 2 diabetes risk. In conclusion, results of this doctoral thesis indicated that levels of A-SAA are elevated years before the manifestation of type 2 diabetes but could not provide evidence that the association is truly causal using a genetic approach. Rather it seems likely that the association between levels of A-SAA and risk of type 2 diabetes is substantially influenced by post-challenge hyperglycemia. Time-series studies are warranted to elucidate the role of post-challenge hyperglycemia in this association.

Macrophage-derived foam cells play a critical role in all stages of atherosclerosis, from the earliest discernable lesions to complex plaques. oxLDL is thought to be a main trigger for endothelial release of pro-inflammatory cytokines, subsequently causing transmigration of the monocytes into the vessel wall. Moreover, formation of macrophage-derived foam cells is mainly induced by oxLDL. Deposition of macrophage-derived foam cells in the lesions is induced by oxLDL uptake, as this uptake causes migratory arrest of the cells. Therefore, reversion of migratory arrest of macrophage-derived foam cells might enable these cells to leave the plaques resulting in reduction of plaque sizes. Our results show that iNOS participates in the mechanisms of oxLDL induced inhibition of macrophage-derived foam cell migration. Inhibition of iNOS expression completely reversed oxLDL mediated migratory arrest of macrophage-derived foam cells. Inhibition of iNOS was associated with enhanced phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) and subseqent actin polymerization. Furthermore, the p-FAK triggered increase in actin polymerization is dependent on iNOS mediated increased oxidative stress. Our results suggest that iNOS may be an interesting target gene to reverse the process of atherosclerosis.

Der in der Evolution hochkonservierte Wnt-Signalweg spielt in der Embryonalentwicklung, der Stammzellbiologie sowie in der Entstehung von Tumoren eine tragende Rolle. Es werden dabei verschiedene Arten der Wnt-vermittelten Signalübertragung unterschieden: Einerseits der sogenannte kanonische, über β-Catenin vermittelte Wnt-Signalweg und andererseits der Wnt/Ca2+- sowie der planar cell polarity (PCP)-like-Weg, die beide die Signaltransduktion unabhängig von β-Catenin übermitteln. Bislang sind die Mechanismen des Wnt/β-Catenin-Signalweges nur teilweise aufgeklärt, wobei insbesondere das Zusammenspiel von Wnts, Frizzleds und deren Korezeptoren auf funktioneller und struktureller Ebene bis heute nur rudimentär beschrieben wurden. In unserer Arbeitsgruppe konnte in vorangegangenen Arbeiten gezeigt werden, dass der Frizzled-8-Rezeptor (Fzd8) in HT1080-Fibrosarkomzellen im Verhältnis zu den übrigen Fzds sehr stark exprimiert wird und seine erhöhte Expression mit einer Aktivierung des Wnt/β-Catenin-Signalweges sowie mit einer erhöhten Invasivität und Proliferation assoziiert ist (Leitenstern et al., mündliche Mitteilung). Ferner wurde gezeigt, dass die Expression von Fzd8 durch Wnt3a bzw. den kanonischen Wnt-Signalweg negativ reguliert wird (Karow 2008; Kolben, Perobner et al. 2012). Vor diesem Hintergrund sollte nun im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe von Reportergenexperimenten die transkriptionelle Regulation von Fzd8 im Detail untersucht werden. Hierzu wurden die Fzd8-Promotorregion und verschiedene 5’- und 3’-terminale Verkürzungsvarianten in den Vektor pGLuc-Basic kloniert, der eine Quantifizierung der Promotoraktivität mittels des Reporterproteins Gaussia Luciferase erlaubt. Der Fzd8-Promotor konnte durch dieses Verfahren in aktivierende und repressive Elemente unterteilt werden, wobei auch ein putatives Enhancer-Element identifiziert werden konnte. Unter Wnt3a-Stimulation zeigten alle untersuchten Promotorkonstrukte eine verringerte Reporterproteinaktivität, was auf eine negative Regulation von Fzd8 durch Wnt3a hinweist. Interessanterweise aber führten Manipulationen am Wnt/β-Catenin-Signalweg weiter downstream zu entgegengesetzten Ergebnissen. So führte ein APC-Knockdown, der mit einer starken Aktivitätszunahme des Wnt/β-Catenin-Signalweges einhergeht, zu einer Zunahme der Fzd8-Promotoraktivität. Im Gegensatz hierzu ging ein Knockdown von β-Catenin, der einer Inhibierung des Wnt/β-Catenin-Signalweges gleichkommt, mit einer verminderten Fzd8-Promotoraktivität einher. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Wnt3a-vermittelte Repression von Fzd8 auch unabhängig vom kanonischen Wnt/β-Catenin-Signalweg erfolgen könnte. Des Weiteren wurde die Fzd8-Promotorregion einer in silico-Analyse mit der Software MatInspector unterzogen, um mögliche Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die für die Fzd8-Regulation maßgeblich sein könnten. Dabei zeigte sich, dass der Transkriptionsfaktor ZF5, der sowohl aktivierend als auch reprimierend an verschiedenen Promotoren wirken kann, aufgrund des Verteilungsmusters seiner Bindungsstellen am Fzd8-Promotor als möglicher Regulator fungieren könnte. ZF5 konnte dabei als putativ positives Wnt/β-Catenin-Zielgen charakterisiert werden. Es konnte ferner gezeigt werden, dass Fzd8 indirekt über ZF5 durch den Wnt/β-Catenin-Signalweg induziert werden kann. Da ZF5 wie auch Fzd8 in HT1080-Fibrosarkomzellen stark exprimiert wird und die ZF5-Überexpression mit einer Zunahme des Wnt/β-Catenin-Signals einhergeht, könnte hier ein positiver feedback loop vorliegen. Somit könnte diese Amplifikation des Wnt/β-Catenin-Signals von maßgeblicher Bedeutung für die verstärkte Proliferation und Invasivität von mesodermalen Tumoren sein.

The human health status is co-determined by the interplay of body composition, metabolism, and energy balance. In turn, these factors are influenced by genetic predispositions, a multitude of environmental factors such as nutritional habits or physical activity, and interactive effects between these parameters. Malnutrition and obesity reflect extreme phenotypes of body composition, and lead to disturbances in metabolism. Especially obesity as a prominent health problem in industrialised countries is linked to an increased risk of morbidity and mortality. Important regulators of energy balance and metabolism are thyroid hormones and disturbances of their homoeostasis are associated with serious health problems. Metabolomics is an evolving field which has the ability to represent a snapshot of the current metabolic state. Disturbances of pathways can be captured and the utilisation of closely connected metabolites ratios provides proxies for enzymatic reactions. In this doctoral thesis, three projects are presented exploring the interplay of body composition,metabolism, and energy homeostasis by focusing on gene–nutrition interactions and their effect on obesity risk, the relationship between fat free mass and the serum metabolite profile of adults, and the influence of thyroid hormones on the metabolism in euthyroid adult participants. The first project aims at improving the understanding of inter-individual variance and susceptibility towards obesity. Common obesity is the result of a genetic predisposition in combination with nowadays modern environment which encourages a sedentary lifestyle and often leads to an imbalance in energy intake and expenditure, subsequently followed by weight gain. To this end, adjusted logistic regression models are used to analyse the interaction effects between single nucleotide polymorphisms (SNPs) of different candidate genes for obesity and polyunsaturated fatty acids (PUFAs) analysed in erythrocyte membranes, which are valid biomarkers for PUFA intake, on the obesity risk in adults participating in a crosssectional population-based study. Several significant SNP–PUFA interactions are identified, indicating regulatory effects of PUFAs by gene variants of interleukin (IL)-2, IL-6, IL-18,tumour necrosis factor receptor superfamily (TNFRSF) member 1B and 21, leptin receptor (LEPR), and adiponectin (ADIPOQ). Due to the limited statistical power of this study, these results have to be reproduced in a sufficiently sized prospective study. If replicated, our results would indicate a beneficial effect of high PUFA supply for a substantial proportion of the population with respect to obesity risk. Aspiration of the second project is to provide a comprehensive picture of fat free mass induced effects on the metabolite profile in blood samples of adults. Further, it is hypothesised that a sedentary lifestyle leads to derangements in skeletal muscle metabolism, e.g., favouring the development of obesity. Thus, the associations between the fat free mass index (FFMI) and up to 190 serum metabolite concentrations - with a focus on amino acids, acylcarnitines, phosphatidylcholines (PCs), and sphingomyelins - and all intra-class metabolite ratios are investigated by means of adjusted linear regression models in cross-sectional analyses of a cohort study. These analyses reveal 339 significant associations between FFMI and various metabolites and metabolite ratios. Among the most prominent associations with higher FFMI are increasing concentrations of the branched-chain amino acids (BCAAs), ratios of BCAAs to glucogenic amino acids, and carnitine concentrations. These findings are in agreement with the expected metabolic situation in fasted participants. Most of these results are replicated in the follow-up survey of the analysed baseline study. In order to draw a comprehensive picture of the FFMI effects, Gaussian graphical models (GGMs) are computed. These models have previously been shown to reveal the true relationships among metabolites. Further, genetic aspects are investigated. To this end, the relationships between SNPs described to be associated with anthropometric characteristics and the metabolite variables are analysed; however, no significant association is revealed. Sensitivity and stratified analyses are carefully performed. Most interestingly, almost all associations which are found for the entire sample are largely missing in the obese subgroup supporting our hypothesis that the accumulation of body fat tissue may be accompanied by a derangement in skeletal muscle metabolism. The aim of the third project is to identify thyroid hormone related changes on metabolism of fasting euthyroid participants in a cross-sectional analysis of a cohort study. To this end, the associations between free tyroxine (FT4), thyrotropin (TSH), and 151 metabolites as well as their pairwise intra-class metabolite ratios are analysed in adjusted linear regression models. Increased serum FT4 levels are associated with an overall enhanced transport to the mitochondria and beta-oxidation of fatty acids which is reflected by significantly increased serum acylcarnitine concentrations and decreased PC concentrations. Further, these findings are largely stable as they could be reproduced in different subsets of the population, including obese versus non-obese participants. No significant associations are found between the metabolite variables and the TSH concentrations. In summary, this doctoral thesis provides indication of a beneficial effect of high PUFA supply for specific genotype carriers with respect to obesity risk. An extensive image of FFMI effects in a data-driven metabolic network is revealed and high body fat accumulation is linked to a derangement in skeletal muscle metabolism. Further, this thesis broadens our knowledge of FT4 triggered pathways in euthyroid participants. Thus, this thesis contributes deeper insight into the interplay of body composition, metabolism, and energy balance.

In der vorliegenden Arbeit wurde die potentielle Rolle der AMP-Kinase, eines der Schlüsselenzyme im Energiestoffwechsel, bei der Regulation des Vasotonus kleiner arterieller Blutgefäße untersucht und die Effekte einer AMPK-Stimulation mit der EDHF-vermittelten endothelialen Dilatation verglichen. Mittels Western-Blot Technik wurde auf Proteinebene nachgewiesen, dass in Arterien des Hamsters sowohl die α1-Untereinheit der AMPK - als prädominante katalytische Untereinheit - sowie die β1-Untereinheit der AMPK exprimiert werden. Die funktionellen Untersuchungen erfolgten an isoliert perfundierten Widerstandsarterien aus der Skelettmuskulatur des Hamsters. An diesen wurden gleichzeitige Registrierungen des Außendurchmessers als Maß für den Vasotonus sowie der intrazellulären Kalziumkonzentration in der glatten Gefäßmuskulatur (Kalziumindikator Fura 2) nach Zugabe verschiedener vasoaktiver Substanzen durchgeführt. An mit Noradrenalin vorkontrahierten isolierten Gefäßen führte der auf die β1-Untereinheit wirkende AMPK-Aktivator A769662 (A76) endothelunabhängig zu einer maximalen Dilatation der Gefäße, die mit einem erheblichen Abfall des glattmuskulären Kalziumspiegels einherging. Die beobachteten A76 Effekte auf Gefäßtonus und Kalziumspiegel waren dosisabhängig. Der Vasodilatator Acetylcholin löste ebenfalls einen ausgeprägten Kalziumabfall in der glatten Muskulatur aus. Dies war jedoch nur bei einem intakten Endothel zu beobachten. Eine Transfektion kultivierter Gefäße mit einer dominant negativ Variante der α1-Untereinheit der AMPK führte zu einer partiellen Herabsetzung der Dilatation und des Kalziumabfalls. Zwei weitere Aktivatoren der AMPK, AICAR und Metformin, bewirkten an den Widerstandsgefäßen ebenfalls eine statistisch signifikante Dilatation und einen Kalziumabfall. An Gefäßen, welche anstelle von Noradrenalin durch eine hohe extrazelluläre Kaliumkonzentration vorkontrahiert wurden, ließ sich nach Stimulation mit A76 weder eine Dilatation noch ein Kalziumabfall feststellen, welches als ein Hinweis auf eine Beteiligung von Kaliumkanälen an den A76 mediierten Effekten zu werten war. Zur genaueren Evaluation dieser Hypothese wurden die A76 Effekte nach pharmakologischer Blockade verschiedener Kaliumkanäle untersucht. Hierbei zeigte sich, dass Iberiotoxin, ein selektiver Inhibitor von BKCa-Kanälen keinen Einfluss auf eine A76 vermittelte Dilatation hatte. Ebenso wenig wurde eine Acetylcholin vermittelte Vasodilatation blockiert. Demgegenüber führte Charybdotoxin, ein Hemmer von BKCa-Kanälen und IKCa-Kanälen, zwar zu einer Blockade der Acetylcholinantwort, ließ die A76 Effekte jedoch weitgehend unbeeinflusst. Die Blockade von ATP-abhängigen Kaliumkanälen KATP durch Glibenclamid in hohen Konzentrationen bewirkte hingegen eine deutliche Reduktion sowohl der Dilatation als auch des Kalziumabfalls nach Gabe von A76. Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit damit gezeigt werden, dass eine Aktivierung der AMPK in isolierten Widerstandsgefäßen des Hamsters zu einer schnellen und ausgeprägten Vasodilatation führt, welche durch einen vorhergehenden Abfall der intrazellulären Kalziumkonzentration in der glatten Gefäßmuskulatur initiiert wird. Die Hemmwirkung von Glibenclamid weist darauf hin, dass dieser Dilatation ein Effekt der AMPK auf KATP-Kanäle in der glatten Muskulatur zu Grund liegen könnte.