Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06 Archiv

Epigenetic programming facilitates the adaptation of an organism to changes in the environment through lasting alterations in gene expression that underlie certain physical and behavioral phenotypes. Exposure to adverse events in early postnatal life is known to increase the risk for stress-related psychiatric disorders later on. Our previous studies showed that early-life stress (ELS) in mice caused by periodic infant-mother separation (MS) leads to increased hyperactivity of the HPA axis, reduced glucocorticoid feedback inhibition, and depressive-like behavior. Moreover, our work revealed ELS-induced hypomethylation of the arginine vasopressin (Avp) gene enhancer and pro-opiomelanocortin (Pomc) promoter. The aim of the study was to investigate whether ELS can also lead to epigenetic programming of the mouse glucocorticoid receptor (GR, Nr3c1). GR is a major feedback regulator of the hypothalamic-pituitary adrenal (HPA) stress axis and its expression is regulated by multiple promoters associated with its5’ untranslated first exons. Given the fact that the mouse GR promoter was only partly characterized, we aimed to determine its genomic structure. In addition, tissue distribution and absolute quantification of newly identified alternative first exon transcripts were analysed. Although most of the first exon transcripts were found to be widely expressed, some of them are shown to be differentially regulated by growth factor- and depolarization-induced signaling. In the present work we show also that mice with a history of maternal separation display up-regulated GR mRNA levels. This observation was confined to Crh-producing neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN), which are principal effectors of the stress response. Moreover, elevated levels of GR are shown to be responsible for stronger induction of its downstream target genes (Fkbp5, Sgk1, and DUSP1), which suggests an enhanced transcriptional activity of the GR in ELS mice. This effect is supported by a higher occupancy of the GR at the glucocorticoid response elements (GREs), following corticosterone injection (i.p.). Finally, we report here that an enhanced level of GR expression in ELS mice is accompanied by an increased methylation of specific CpG residues at the CpG island shore region of the GR promoter. These ELS-responsive CpGs comprise a DNA binding site for the transcriptional repressor Yin Yang 1 (YY1). Given the high homology of the mouse and human GR promoter, and the conservation of the YY1 binding site, we conducted a methylation analysis of the hGR CpG island shore region in peripheral tissues and post mortem brain samples. Our findings might serve as a basis for comparing the methylation patterns in tissues from control subjects and patients with stress-related brain disorders.

Sleep characteristics are candidates for predictive biological markers in patients with severe psychiatric diseases, in particular affective disorder and schizophrenia. The genetic components of sleep determination in humans remain, to a large degree, unelucidated. In particular, the heritability of rapid eye movement (REM) sleep and EEG bursts of oscillatory brain activity in Non-REM sleep, i.e. sleep spindles, are of interest. In addition, recent findings suggest a strong role of distinct sleep spindle types in memory consolidation, making it important to identify sleep spindles in slow wave sleep (SWS) and to separate slow and fast spindle localization in the frequency range. However, predictive sleep biomarker research requires large sample sizes of healthy and affected human individuals. Therefore, the present work addressed two questions. The first aim was to optimize data analysis by developing algorithms that allow an efficient and reliable identification of rapid eye movements (REMs) and sleep EEG spindles. In the second part, developed methods were applied to sleep EEG data from a classical twin study to identify genetic effects on tonic and phasic REM sleep parameters, sleep spindles, and their trait-like characteristics. The algorithm for REM detection was developed for standard clinical two channel electrooculographic montage. The goal was to detect REMs visible above the background noise, and in the case of REM saccades to classify each movement separately. In order to achieve a high level of sensitivity, detection was based on a first derivative of electrooculogram (EOG) potentials and two detection thresholds. The developed REM detector was then validated in n=12 polysomnographic recordings from n=7 healthy subjects who had been previously scored visually by two human experts according to standard guidelines. Comparison of automatic REM detection with human scorers revealed mean correlations of 0.94 and 0.90, respectively (mean correlation between experts was 0.91). The developed automatic sleep spindle detector assessed individualized signal amplitude for each channel as well as slow and fast spindle frequency peaks based on the spectral analysis of the EEG signal. The spindle detection was based on Continuous Wavelet Transform (CWT); it localized the exact length of sleep spindles and was sensitive also for detection of sleep spindles intermingled in high amplitude slow wave EEG activity. The automatic spindle detector was validated in n=18 naps from n=10 subjects, where EEG data were scored both visually and by a commercial automatic algorithm (SIESTA). Comparison of our own spindle detector with results from the SIESTA algorithm and visual scoring revealed the correlations of 0.97 and 0.92, respectively (correlation between SIESTA algorithm and visual scoring was 0.90). In the second part of the work, the similarity of given sleep EEG parameters in n=32 healthy monozygotic (MZ) twins was compared with the similarity in n=14 healthy same-gender dizygotic (DZ) twins. The author of the current work did not participate in acquisition of twin study sample. EEG sleep recordings used for the heritability study were collected and already described by Ambrosius et al. (2008). Investigation of REM sleep included the absolute EEG spectral power, the shape of REM power spectrum, the amount and the structural organization of REMs; parameters of Non-REM sleep included slow and fast sleep spindle characteristics as well as the shape of the Non-REM power spectrum in general. In addition to estimating genetic effects, differences in within-pair similarity and night-to-night stability of given parameters were illustrated by intraclass correlation coefficients (ICC) and cluster analysis. A substantial genetic influence on both spectral composition and phasic parameters of REM sleep was observed. A significant genetic variance in spectral power affected delta to high sigma and high beta to gamma EEG frequency bands, as well as all phasic REM parameters with the exception of the REMs occurring outside REM bursts. Furthermore, MZ and DZ twins differed significantly in their within-pair similarity of non-REM and REM EEG spectra morphology. Regarding sleep spindles, statistical analysis revealed a significant genetic influence on localization in frequency range as well as on basic spindle characteristics (amplitude, length, quantity), except in the quantity of fast spindles in stage 2 and whole Non-REM sleep. Basic spindle parameters showed trait-like characteristics and significant differences in within-pair similarity between the twin groups. In summary, the developed algorithms for automatic REM and sleep spindle detection provide several advantages: the elimination of human scorer biases and intra-rater variability, investigation of structural organization of REMs, exact determination of fast and slow spindle frequency for each individual. Algorithms are fully automated and therefore well suited to score REM density and sleep spindles in large patient samples. In the second part of the study, sleep EEG analysis in MZ and DZ twins revealed a substantial genetic determination of both tonic and phasic REM sleep parameters. This complements previous findings of a high genetic determination of the Non-REM sleep power spectrum. Interestingly, smaller genetic effects and lower night-to-night stability were observed for fast spindles, especially in SWS. This is in line with recent hypotheses on the differential function of sleep spindle types for memory consolidation. The results from the presented studies strongly support the application of sleep EEG to identify clinically relevant biomarkers for psychiatric disorders.

Das Einkomponentensystem CadC in Escherichia coli zählt zur Gruppe der ToxR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren und aktiviert bei niedrigem pH-Wert die Expression des cadBA-Operons, einem Säure-induzierbaren Lysin-Decarboxylase-System. Transkriptionsregulatoren der ToxR-Familie zeichnen sich durch einen gemeinsamen modularen Aufbau aus und bestehen aus einer periplasmatischen Sensordomäne, einer Transmembranhelix und einer zytoplasmatischen Effektordomäne. Die Signalwahrnehmung, -weiterleitung und -verarbeitung erfolgt bei den ToxR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren innerhalb eines einzelnen Proteins. Die molekularen Mechanismen der Reizwahrnehmung durch CadC sind bekannt, die Signalweiterleitung und -verarbeitung im Zytoplasma sind hingegen weitgehend ungeklärt. In CadC ist ein zytoplasmatischer Linker (51 Aminosäuren) essentiell für die Signaltransduktion von der sensorischen Domäne zur DNA-Bindedomäne. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Signalweiterleitung von der sensorischen Domäne zur DNA-Bindedomäne untersucht. Mit Hilfe der Kernspinresonanzspektroskopie konnte gezeigt werden, dass die Linkerregion unstrukturiert vorliegt. Im Rahmen einer umfangreichen Mutagenesestudie wurde beobachtet, dass sowohl eine Vielzahl an Aminosäuresubstitutionen (Veränderungen der Ladung, der Rigidität oder der Wahrscheinlichkeit zur Bildung einer α-Helix) als auch die Verlängerung des CadC-Linkers zu keiner funktionellen Beeinträchtigung führte. Jedoch wurde die Signalverarbeitung im Zytoplasma durch Verkürzung des Linkers modifiziert und verursachte ein invertiertes Expressionsprofil des Zieloperons cadBA oder die Entkopplung der Expression vom externen pH. Der Linkerregion in CadC konnte keine Rolle in der Oligomerisierung zugeordnet werden. Unabhängig vom Linker wurde in einer in vivo Interaktionsstudie eine pH-abhängige Interaktion (pH < 6,8) zwischen CadC-Monomeren gezeigt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Röntgenkristallstruktur (2,0 Ångström) und in einem parallelen Ansatz die NMR-Struktur (0,46 backbone RMSD) der zytoplasmatischen Effektordomäne in CadC als erste dreidimensionale Struktur der DNA-Bindedomäne eines ToxR-ähnlichen Regulators aufgeklärt. In der Struktur von CadC1-107 wurde ein „winged Helix-Turn-Helix“-Motiv aus der Familie der OmpR-ähnlichen Transkriptionsregulatoren beobachtet. Im Gegensatz zu der Topologie bereits gelöster OmpR-ähnlichen Regulatoren enthält CadC am Übergang von DNA-Bindedomäne und Linkerregion einen zusätzlichen β-Strang (β-Strang 7), welcher sich stabilisierend auf die DNA-Bindung auswirken könnte. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der DNA-Bindemechanismus von CadC an den cadBA-Promotor untersucht. In in vitro Versuchen zur Bindung von löslichen CadC-Varianten an DNA konnte eine sehr geringe Dissoziationsrate beobachtet werden. Somit ist nicht die Affinität zur DNA sondern die Stimulus-abhängige Interaktion von CadC mit der α-Untereinheit der RNA-Polymerase essentiell für die Aktivierung des cadBA-Operons. Außerdem wurden, basierend auf der Kristallstruktur der DNA-Bindedomäne von CadC Aminosäuresubstitutionen durchgeführt. Die Aminosäure His66 in der Erkennungshelix α3 ist an der Interaktion mit der großen Furche der DNA beteiligt, während die Aminosäuren Lys95 und Arg96 die Interaktion mit der kleinen Furche der DNA vermitteln. Die Ergebnisse dieser Arbeit postulieren ein Modell zur Signalverarbeitung in CadC, in welchem die Signalwahrnehmung im Periplasma zu konformationellen Veränderungen des unstrukturierten CadC-Linkers führt und somit die räumliche Positionierung der DNA-Bindedomänen im CadC-Dimer ermöglicht wird.

Die Strahlenempfindlichkeit des Normalgewebes ist in der humanen Bevölkerung sehr heterogen und kann bislang nicht über prädiagnostische Biomarker charakterisiert werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, um die Strahlenempfindlichkeit in lymphoblastoiden Zelllinien von jungen Lungenkrebspatienten in einem Hochdurchsatz Screening-Ansatz zu untersuchen. Fünf Zelllinien mit unterschiedlicher Strahlenempfindlichkeit wurden gewählt, um in einem ungerichteten Versuchsansatz (2D DIGE Methode = two-dimensional difference gel electrophoresis) strahlenspezifische Proteinregulation nach gamma-Bestrahlung (137Cs-Quelle) zu untersuchen. Dabei konnten sowohl neue Proteine, wie z.B. Mcm7und SerpinB9 identifiziert werden, als auch Proteine (Strukturproteine, Chaperone), die bereits in der Literatur in Verbindung mit der zellulären Stressantwort beschrieben wurden. Die 2D DIGE Ergebnisse konnten beispielhaft anhand von vier Kandidatenproteinen im Westernblot validiert werden. Die Untersuchungen zeigten, dass die intraindividuellen Expressionsunterschiede nach gamma-Bestrahlung auf Proteinebene sehr gering waren. Die geringen Expressionsunterschiede konnten jedoch validiert werden. Die Untersuchungen gaben Hinweise darauf, dass die interindividuelle Strahlenantwort sehr unterschiedlich ist. Dies konnte in weiterführenden Experimenten bestätigt werden. Da die Proteinexpression der Regulation durch mikroRNAs unterliegt, wurde in einem weiteren Ansatz eine miRNA Array Analyse durchgeführt. Hier bestätigte sich ebenfalls die Beobachtung aus der 2D Proteinanalyse, dass die Strahlenantwort interindividuell sehr heterogen ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die Strahlenantwort auf verschiedenen zellulären Ebenen intraindividuell kaum variiert, die interindividuelle Varianz aber sehr groß ist. Diese beobachtete Heterogenität erklärt die Problematik einzelne Biomarker zur Prädiktion der Strahlenempfindlichkeit zu identifizieren.

Durch Fehler entstandene tetraploide Zellen sind chromosomal instabil und können zu Zelltransformation führen. Die Beweise verdichten sich, dass die Propagation von tetraploiden Säugetierzellen durch einen p53-vermittelten Arrest eingeschränkt wird; jedoch ist weiterhin unklar, was die Ursache dieses p53-vermittelten Arrests ist. Um die Ursache des p53-vermittelten Arrests zu identifizieren, wurden individuelle Zellen mittels zeitraffender Mikroskopie in Echtzeit verfolgt. Neu entstandene tetraploide Zellen können einen Zellzyklus vollenden, aber die Mehrzahl der Zellen starb oder verharrte in einem Arrest in der folgenden G1-Phase, abhängig davon ob die vorangegangene Mitose fehlerfrei verlief oder nicht. Tochterzellen, denen eine fehlerhafte Mitose voranging, akkumulierten p53 im Zellkern, was zum Zelltod oder einem irreversiblen Zellzyklusarrest führte. Es zeigte sich durch den Anstieg von 8-OHdG, einem Indikator für oxidative DNA Schädigung, dass tetraploide Zellen durch die vermehrten fehlerhaften Mitosen höheren Konzentrationen von reaktiven oxidativen Spezien (ROS) ausgesetzt sind. Der Anstieg von 8-OHdG korrelierte mit der p53-Akkumulation im Zellkern. Da keine vermehrte Phosphorylierung des Histons H2AX (γ-H2AX), ein Marker für DNA-Strangbrüche, detektiert wurde, lässt sich schlussfolgern, dass ROS entscheidend für den p53 vermittelten Arrest verantwortlich sind. Mehrere p53-aktivierende Kinasen wurden mittels RNA Interferenz (RNAi) und chemischer Genetik untersucht, ob sie einen Einfluss auf den Zellzyklusarrest von tetraploiden Zellen haben. Von den getesteten Kinasen hatte nur ATM einen Einfluss auf die Aktivierung von p53 nach fehlerhaften tetraploiden Mitosen. Zwar wird ATM in der Regel durch DNA-Schäden aktiviert, jedoch wurde bereits zuvor gezeigt, dass ATM auch durch erhöhte ROS Konzentrationen aktiviert werden kann. Um die Zusammenhänge des Zellzyklusarrests weiter aufzuklären, wurde ein genomübergreifender esiRNA Screen etabliert, der die Zellproliferation nach induzierter Tetraploidisierung analysiert. Durch Kombination der Zellzyklusanalyse an Hand des DNA-Gehalts zusammen mit den FUCCI-Zellzyklusindikatoren, konnten tetraploide und diploide Zellen nebeneinander mikroskopisch analysiert werden, ohne zuvor tetraploide und diploide Zellen isolieren zu müssen. Dieser neue experimentelle Ansatz ermöglichte die Identifikation von Genen, die spezifisch die Proliferation von tetraploiden Zellen verstärken oder einschränken Im Primärscreen wurden 1159 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation einschränken. Weiter wurden 431 Gene identifiziert, deren Inhibition die Proliferation der tetraploiden Zellen verstärken. Von den 431 Genen, deren Inhibition die Proliferation verstärken, wurden 371 Gene einem Konfirmationsscreen unterzogen, in dem 158 der identifizierten 371 Gene bestätigt wurden. Die bioinformatische Analyse der 158 Gene zeigte eine signifikante Anhäufung von Genen, die mit DNA-Replikation, dem kanonischen Wnt-Signalweg oder mit Tumorsignalwegen assoziiert sind. Unter letzteren ist CCDC6 sehr interessant, da dessen Genprodukt durch ATM phosphoryliert wird und nachgeschaltet den Tumorsuppressor 14-3-3σ reguliert. Des weiteren wurden mittels einer Meta Analyse der Ergebnisse des Primärscreens, zusammen mit den Daten aus dem “Project Achilles”, welches genomweit den Effekt von shRNA-vermittelter Geninhibition auf die Proliferation von 108 Krebszelllinien untersuchte, 18 Gene identifiziert, deren Inhibition sowohl die Proliferation von tetraploiden Zellen einschränkt, als auch die Proliferation von Zelllinien hemmt, welche von Krebsarten stammen, die zu meist chromosomale Instabilitäten (CIN) aufweisen. Damit bilden die präsentierten Daten nicht nur eine gute Basis zur Aufklärung des Zellzyklusarrests tetraploider Zellen, sondern auch für die Identifikation neuer potentieller Zielmoleküle, welche benutzt werden können um Tumorerkrankungen mit chromosomaler Instabilität zu behandeln, welche häufig resistent gegen die bislang verfügbaren Behandlungen sind.

Today’s pervasive presence of stress renders stress-related psychiatric disorders (SRPDs), a relevant global health problem. Memory impairment is a major symptom likely mediated by the hippocampus (HIP), a limbic brain region highly vulnerable to stress. Recent evidence suggests that information processing problems within specific neuronal networks might underlie SRPDs. However, the precise functional neurocircuitry that mediates hippocampal CA1 long-term potentiation (LTP), a putative correlate of mammalian learning and memory, remains unknown at present. Furthermore, valuable assays for studying stress and drug effects on polysynaptic activity flow through the classical input/output circuit of the HIP are missing. To engage a circuit-centered approach, voltage-sensitive dye imaging was applied in mouse brain slices. Single pulse entorhinal cortex (EC) to dentate gyrus (DG) input, evoked by perforant path stimulation, entailed strong neuronal activity in the DG, but no distinct neuronal activity in the CA3 and CA1 subfield of the HIP. In contrast, a thetafrequency (5 Hz) stimulus train induced waves of neuronal activity percolating through the entire hippocampal trisynaptic circuit (HTC-waves). Spatially restricted blocking of glutamate release at CA3 mossy fiber synapses caused a complete disappearance of HTC-waves, suggesting frequency facilitation at DG to CA3 synapses the pivotal gating mechanism. In turn, non-theta frequency stimulations (0.2/1/20 Hz) proved much less effective at generating HTC-waves. CA1 long-term potentiation (CA1 LTP) is the best understood form of synaptic plasticity in the brain, but predominantly at the monosynaptic level. Here, HTC-waves comprise high-frequency firing of CA3 pyramidal neurons (>100 Hz), inducing NMDA receptordependent CA1 LTP within a few seconds. Detailed examination revealed the existence of an induction threshold for LTP. Consequently, baseline recordings with a reduced number of HTC-waves were carried out to test the effects of memory enhancing drugs and HPA axis hormones on hippocampal network dynamics. Bath application of caffeine (5 mM), corticosterone (100 nM) and corticotropin-releasing hormone (5 & 50 nM) rapidly boosted HTC-waves. Cognitive processes taking place within the HIP are challenged by stress exposure, but whether and how chronic stress shapes "net" neuronal activity flow through the HIP remains elusive. The HTC-wave assay, refined for group comparisons, revealed that chronic stress markedly lowers the strength of evoked neuronal activity propagation through the hippocampal trisynaptic circuit. In contrast, antidepressants (ADs) of several classes, the mood stabilizer lithium, the anesthetic ketamine, and the neurotrophin brainderived neurotrophic factor amplified HTC-waves. An opposite effect was obtained with the antipsychotic haloperidol and the anxiolytic diazepam. The tested ADs exert this effect at low micromolar concentrations, but not at 100 nM, and nearly always, also not at 500 nM. Furthermore, the AD fluoxetine was found to facilitate LTP of HTC-waves. Finally, pharmacological blockade of the tyrosine-related kinase B receptor abolished fluoxetine effects on HTC-waves. These results highlight a circuit-centered approach suggesting evoked synchronous theta rhythmical firing of EC principal cells as a valuable tool to investigate several aspects of neuronal activity flow through the HIP. The physiological relevance is emphasized by the finding that the resulting HTC-waves, which likely occur during EC theta oscillations, evoke NMDA receptor-dependent CA1 LTP within a few seconds. Furthermore, HTC-waves allow to integrate molecular, cellular and structural adaptations in the HIP, pointing to a monoaminergic neurotransmission-independent, "circuit-level" mechanism of ADs, to balance the detrimental effects of chronic stress on HIP-dependent cognitive abilities.

Das Paprika Resistenzgen Bs4C aus Capsicum pubescens vermittelt Resistenz gegenüber Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)-Stämmen, die den (transcription activator-like) TAL-Effektor AvrBs4 exprimieren. Vorangegangene Arbeiten ließen vermuten, dass AvrBs4 die Expression von Bs4C transkriptionell induziert. In einem “proof of principle”-Experiment, wurde Bs4C unter Verwendung eines RNA-Seq-basierten Ansatzes isoliert. Unter 68 differentiell AvrBs4-induzierten Paprikagenen war jedoch nur eines, das ausschließlich in der resistenten und nicht in der suszeptiblen Akzession induziert war und für das kein Transkript in Abwesenheit von AvrBs4 in der resistenten Akzession nachgewiesen wurde. Kopplungs- und Komplementationsanalysen bestätigten dieses Kandidatengen als das gesuchte Resistenzgen Bs4C. Im Bs4C-Promoter konnte ein Effektorbindeelement (EBE) für AvrBs4 identifiziert werden, das notwendig und ausreichend für die AvrBs4-Bindung an und transkriptionelle Aktivierung von Bs4C ist. Bindungsstudien ließen erkennen, dass zwei Nukleotidpolymorphismen in der korrespondierenden Region der suszeptiblen Akzession eine stark reduzierte Affinität (10fach) gegenüber AvrBs4 bedingen. Außerdem zeigten GUS-Studien, dass der Promoter des suszeptiblen Allels nicht durch AvrBs4 induzierbar ist. Folglich bestimmt ein Substitutionspolymorphismus von zwei Basenpaaren in den Promotoren des resistenten und suszeptiblen Bs4C-Allels über Resistenz oder Suszeptibilität gegenüber AvrBs4-exprimierenden Xanthomonaden. Bs4C kodiert für ein 164-AS großes Protein, das keine Homologie zu Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. In silico Proteinstrukturanalysen sagen vier Transmembranhelices in Bs4C vorher und demzufolge stellt es einen neuen Typ von Exekutorproteinen dar, welcher Resistenz gegen TALE-exprimierende Xanthomonas-Stämme vermittelt. Zudem konnten Sequenzanalysen mindestens ein Homolog in C. pubescens und mindestens sieben Homologe in C. annuum identifizieren. Interessanterweise kodieren die meisten von ihnen aufgrund von Nukleotidaustauschen, Leserahmenverschiebungen und Insertions/Deletionspolymorphismen nicht für Volllängen Bs4C-ähnliche Proteine. Folglich könnten diese homologen Sequenzen duplizierte Gene repräsentieren, die nicht mehr funktional sind.

Fluorescent protein sensors have gained great importance in research as they exhibit a number of advantages over synthetic dyes. They can be targeted precisely, large populations of cells can be imaged simultaneously, and they allow for chronic imaging approaches. Many of them however still suffer from comparably low signal changes. Improving fluorescent protein sensors can be tedious and time-consuming. For this reason, great efforts have been made not only to improve existing sensors, but also to develop better strategies to improve them. In this work, a novel large-scale bacterial based screening assay was established to complement rational design. Sensor expression, stimulation, and screening in bacteria, as well as the handling of large amounts of data created by such a screening assay were optimized. While the new assay can be adapted for other applications, it is especially well suited for the screening of genetically encoded Ca2+ indicators of the basis of FRET (Förster Resonance Energy Transfer). We used the assay to optimize such sensors, utilizing the Ca2+ binding protein Troponin C fused between the fluorescent proteins ECFP and cpCitrine. The resulting ‘Twitch’ sensor series exhibited a large dynamic range of up to 1000% FRET ratio change, great sensitivity and fast kinetics. In a second approach, we attempted to develop a similar sensor deploying red-shifted fluorescent proteins. To this end, further screening was conducted to optimize the orange fluorescent protein mKOκ for FRET, and a FRET sensor deploying mKOκ. The sensor we developed utilized troponin C and the fluorescent protein Dreiklang (photoswitchable) in addition to mKOκ. It was bright and exhibited a FRET ratio change of approximately 170%. In summary, the screening procedures presented in this thesis, will facilitate the development of a range of genetically encoded biosensors, and were already employed to develop a number of highly effective Ca2+ FRET indicators.