RNA-Seq-basierte Isolierung des Resistenzgens Bs4C aus Paprika
Beschreibung
vor 9 Jahren
Das Paprika Resistenzgen Bs4C aus Capsicum pubescens vermittelt
Resistenz gegenüber Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
(Xcv)-Stämmen, die den (transcription activator-like) TAL-Effektor
AvrBs4 exprimieren. Vorangegangene Arbeiten ließen vermuten, dass
AvrBs4 die Expression von Bs4C transkriptionell induziert. In einem
“proof of principle”-Experiment, wurde Bs4C unter Verwendung eines
RNA-Seq-basierten Ansatzes isoliert. Unter 68 differentiell
AvrBs4-induzierten Paprikagenen war jedoch nur eines, das
ausschließlich in der resistenten und nicht in der suszeptiblen
Akzession induziert war und für das kein Transkript in Abwesenheit
von AvrBs4 in der resistenten Akzession nachgewiesen wurde.
Kopplungs- und Komplementationsanalysen bestätigten dieses
Kandidatengen als das gesuchte Resistenzgen Bs4C. Im Bs4C-Promoter
konnte ein Effektorbindeelement (EBE) für AvrBs4 identifiziert
werden, das notwendig und ausreichend für die AvrBs4-Bindung an und
transkriptionelle Aktivierung von Bs4C ist. Bindungsstudien ließen
erkennen, dass zwei Nukleotidpolymorphismen in der
korrespondierenden Region der suszeptiblen Akzession eine stark
reduzierte Affinität (10fach) gegenüber AvrBs4 bedingen. Außerdem
zeigten GUS-Studien, dass der Promoter des suszeptiblen Allels
nicht durch AvrBs4 induzierbar ist. Folglich bestimmt ein
Substitutionspolymorphismus von zwei Basenpaaren in den Promotoren
des resistenten und suszeptiblen Bs4C-Allels über Resistenz oder
Suszeptibilität gegenüber AvrBs4-exprimierenden Xanthomonaden. Bs4C
kodiert für ein 164-AS großes Protein, das keine Homologie zu
Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. In silico
Proteinstrukturanalysen sagen vier Transmembranhelices in Bs4C
vorher und demzufolge stellt es einen neuen Typ von
Exekutorproteinen dar, welcher Resistenz gegen TALE-exprimierende
Xanthomonas-Stämme vermittelt. Zudem konnten Sequenzanalysen
mindestens ein Homolog in C. pubescens und mindestens sieben
Homologe in C. annuum identifizieren. Interessanterweise kodieren
die meisten von ihnen aufgrund von Nukleotidaustauschen,
Leserahmenverschiebungen und Insertions/Deletionspolymorphismen
nicht für Volllängen Bs4C-ähnliche Proteine. Folglich könnten diese
homologen Sequenzen duplizierte Gene repräsentieren, die nicht mehr
funktional sind.
Resistenz gegenüber Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
(Xcv)-Stämmen, die den (transcription activator-like) TAL-Effektor
AvrBs4 exprimieren. Vorangegangene Arbeiten ließen vermuten, dass
AvrBs4 die Expression von Bs4C transkriptionell induziert. In einem
“proof of principle”-Experiment, wurde Bs4C unter Verwendung eines
RNA-Seq-basierten Ansatzes isoliert. Unter 68 differentiell
AvrBs4-induzierten Paprikagenen war jedoch nur eines, das
ausschließlich in der resistenten und nicht in der suszeptiblen
Akzession induziert war und für das kein Transkript in Abwesenheit
von AvrBs4 in der resistenten Akzession nachgewiesen wurde.
Kopplungs- und Komplementationsanalysen bestätigten dieses
Kandidatengen als das gesuchte Resistenzgen Bs4C. Im Bs4C-Promoter
konnte ein Effektorbindeelement (EBE) für AvrBs4 identifiziert
werden, das notwendig und ausreichend für die AvrBs4-Bindung an und
transkriptionelle Aktivierung von Bs4C ist. Bindungsstudien ließen
erkennen, dass zwei Nukleotidpolymorphismen in der
korrespondierenden Region der suszeptiblen Akzession eine stark
reduzierte Affinität (10fach) gegenüber AvrBs4 bedingen. Außerdem
zeigten GUS-Studien, dass der Promoter des suszeptiblen Allels
nicht durch AvrBs4 induzierbar ist. Folglich bestimmt ein
Substitutionspolymorphismus von zwei Basenpaaren in den Promotoren
des resistenten und suszeptiblen Bs4C-Allels über Resistenz oder
Suszeptibilität gegenüber AvrBs4-exprimierenden Xanthomonaden. Bs4C
kodiert für ein 164-AS großes Protein, das keine Homologie zu
Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. In silico
Proteinstrukturanalysen sagen vier Transmembranhelices in Bs4C
vorher und demzufolge stellt es einen neuen Typ von
Exekutorproteinen dar, welcher Resistenz gegen TALE-exprimierende
Xanthomonas-Stämme vermittelt. Zudem konnten Sequenzanalysen
mindestens ein Homolog in C. pubescens und mindestens sieben
Homologe in C. annuum identifizieren. Interessanterweise kodieren
die meisten von ihnen aufgrund von Nukleotidaustauschen,
Leserahmenverschiebungen und Insertions/Deletionspolymorphismen
nicht für Volllängen Bs4C-ähnliche Proteine. Folglich könnten diese
homologen Sequenzen duplizierte Gene repräsentieren, die nicht mehr
funktional sind.
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