Genetische und molekularbiologische Analyse der Interaktion der Src-Kinase Hck mit dem niedermolekularen Inhibitor PP1

Kristallstrukuturuntersuchungen zur dreidimensionalen Struktur der
Src-Kinase Hck im Komplex mit dem Tyrosinkinasen-Inhibitor PP1
haben gezeigt, dass die Zusammensetzung der Aminosäuren an
verschiedenen Positionen kritisch für die Sensitivität von Kinasen
gegenüber diesem Inhibitor sein können. In dieser Arbeit sollten
die für die Bindung von PP1 und Hck relevanten Aminosäuren
identifiziert werden und gezeigt werden, dass Hck direkt durch PP1
inhibiert wird. Es sollte ein System entwickelt werden, dass zur
Selektion niedermolekularer Kinase-Inhibitoren dient. In dieser
Arbeit wurden PP1-insensitive Punktmutanten von Hck hergestellt.
Die untersuchten Aminosäure-Positionen innerhalb von Hck begrenzen
zum einem den Eingang zu einer hydrophoben Tasche (Position 338 und
403), zum anderen liegen sie innerhalb dieser Tasche (Positionen
314, 323, 325 und 336). Diese Positionen wurden durch Aminosäuren
mit längeren oder polaren Seitenketten ersetzt. Es konnte gezeigt
werden, dass die mutierten Positionen innerhalb der hydrophoben
Tasche nicht wesentlich an der Bindung zu PP1 beteiligt sind. So
zeigt zwar die Mutation zu Phenylalanin an den Positionen L325 und
I336 Wildtyp-Aktivität, allerdings ist bei keiner der
Taschen-Mutanten Inhibitor-Resistenz gegenüber PP1 nachweisbar. Die
meisten der untersuchten Eingangs-Mutanten (Position 338 und 403)
zeigen eine dem Wildtyp Hck vergleichbare Aktivität. Allein die
Position 388 konnte als einzige Spezifitätsdeterminante von Hck für
den Inhibitor PP1 identifiziert werden, da die Mutation dieser
Aminosäuren zu einer erheblichen Reduktion der Sensitivität der
Kinasen gegenüber PP1 führte. Die Position 403 hingegen wird nicht
als Spezifitätsdeterminante von PP1 anerkannt, da die Mutanten
sensitiv gegenüber PP1 sind. Zusammengefasst zeigen die Daten, dass
PP1 die Src-Kinase Hck direkt über die Bindung in die hydrophobe
Tasche in Nachbarschaft zur ATP-Bindungsstelle inhibiert. Das
etablierte System der Mutation einer Aminosäureposition, die
entscheidend die Bindung eines Inhibitors beeinflusst, kann
nützlich sein, um die biologische Potenz von Inhibitoren und deren
Zielstruktur-Spezifität zu untersuchen. Es kann zudem für die
Spezifizierung und Optimierung von Kinase-Inhibitoren herangezogen
werden.