Identifizierung und molekulare Charakterisierung mitochondrialer Signalpeptide der 3-Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase

Der isolierte 3-Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase (MCC)-Mangel ist
eine angeborene Störung im Abbau der Aminosäure Leucin. Die
Erweiterung des Neugeborenen-Screenings (NGS) führte zu der
Erkenntnis, dass der MCC-Mangel eine der häufigsten organischen
Azidämien darstellt. Das klinische Bild ist sehr heterogen und eine
Genotyp-Phänotyp Korrelation ist nicht möglich. Über die Prognose
der im NGS identifizierten und bisher asymptomatischen
Mutationsträger kann bisher keine Aussage gemacht werden. Das
mitochondriale Enzym besteht aus einer α- und einer β-Untereinheit.
In dieser Arbeit wurden die mitochondrialen Signalpeptide beider
Untereinheiten identifiziert. Hierzu wurden Fusionsproteine aus
Fragmenten der Untereinheiten mit dem fluoreszierenden Protein YFP
generiert. Nach Expression in humanen Hautfibroblasten wurden
Kolokalisationsstudien durchgeführt. Zunächst wurde experimentell
bestätigt, dass jede Untereinheit ein mitochondriales aminoterminal
lokalisiertes Signalpeptid besitzt. Für MCCα befindet sich dieses
in den Aminosäuren 1-39, für MCCβ in den Aminosäuren 1-20. Beide
Untereinheiten haben keine weiteren Importsignale. Somit sind die
aminoterminalen Targetingsequenzen ausreichend und gleichzeitig
notwendig, um einen mitochondrialen Import zu ermöglichen. In einer
Western Blot Analyse konnte die Abspaltung der Signalpeptide beider
Untereinheiten gezeigt werden. Durch Veränderung der positiv
geladenen Aminosäuren wurden die strukturellen Erfordernisse der
identifizierten Signalpeptide näher charakterisiert. Es wurden
Argininreste gegen Glutamin in verschiedenen Kombinationen
ausgetauscht. Eine Mutation der aminoterminalen vier Argininreste
im Signalpeptid von MCCα führte zum Importverlust. Bei einer
Mutation der in der Targetingsequenz vom Aminoterminus weiter
entfernt liegenden zwei Argininreste fand ein Import statt. Bei
Mutationen der Argininreste im Signalpeptid von MCCβ kam es
regelhaft zu einem Importverlust. Damit wurde die Relevanz der
positiv geladenen Aminosäuren für den Import der MCC-Untereinheiten
belegt. Die Identifizierung der Signalpeptide stellt die Grundlage
weiterer Funktionsuntersuchungen dar, da nur reife Proteine ohne
Signalsequenz für prokaryontische Expressionsstudien verwendet
werden können. Durch solche Untersuchungen könnten die Auswirkungen
von Mutationen auf die Enzymfunktion besser verstanden werden. In
diesem Zusammenhang können möglicherweise diejenigen Veränderungen
in der Funktionsweise des Enzyms aufgeklärt werden, die eine
klinische Symptomatik nach sich ziehen. Hierdurch könnte die bisher
schwierige Beratungssituation betroffener Familien hinsichtlich
Prognose und Therapie erheblich verbessert werden.